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β-桧木醇/纳米氧化锌/聚己内酯纳米纤维的体外抑菌效果及生物相容性评价
黄金柱, 胡敏, 孙建彬, 周敏, 盛芳芳, 卢来春     
400038 重庆,第三军医大学药学院药学综合实验中心
[摘要] 目的 制备β-桧木醇/纳米氧化锌/聚己内酯(beta-hinokitiol/zinc oxide nanoparticles/polycaprolactone, β-H/ZnONPs/PCL)纳米纤维,评价其对耐药金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA)的体外抑菌效果及生物相容性。方法 利用静电纺丝技术制备β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维并通过扫描电镜观察,傅里叶红外光谱仪检测其光谱特征,同时检测其透气性、降解性能等指标,考察不同载药比例的纳米纤维对MRSA的体外抑菌效果。参照医疗器械生物学评价标准实施指南,初步研究其体外生物相容性。结果 在PCL纺丝液浓度(质量浓度)为16%、电压为14 kV、喷射速度为0.3 mL/h、接收距离为9 cm时制备的纳米纤维直径分布较为均匀,直径大多分布在150~350 nm,红外光谱显示各组纳米纤维在1 732 cm-1(C=O)、2 950 cm-1(C-H)附近有吸收峰。纳米纤维的透气性明显优于普通无纺布组,差异有统计学意义(P < 0.05)。β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维在PBS缓冲液(pH=7.5)中缓慢降解。ZnONPs制成纳米纤维后仍能增加β-H对MRSA的抑菌作用,且纳米纤维中ZnONPs(质量浓度)的含量为1%时,纳米纤维对MRSA的抑菌效果随β-H含量的增大而增强(P < 0.05),当β-H(质量浓度)含量为0.05%时,纳米纤维的抑菌效果并未随ZnONPs含量的变化而明显改变(P>0.05)。通过MTT法细胞毒性实验、细胞粘附性实验和溶血性实验表明0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL组成的纳米纤维具有较好的体外生物安全性。结论 0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL组成的纳米纤维对MRSA有较好的体外抑菌效果,其体外生物相容性评价结果符合医疗器械生物学标准。
[关键词] β-桧木醇     纳米氧化锌     纳米纤维     抑菌效果     生物相容性    
In vitro antibacterial effect and biocompatibility of nanofibers composed of beta-hinokitiol, zinc oxide nanoparticles and polycaprolactone
HUANG Jinzhu , HU Min , SUN Jianbin , ZHOU Min , SHENG Fangfang , LU Laichun     
Comprehensive Experimental Center, College of Pharmacy, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
Corresponding author: LU Laichun, E-mail:lulab2014@126.com
[Abstract] Objective To prepare the beta-hinokitiol/zinc oxide nanoparticles/polycaprolactone (β-H/ZnONPs/PCL) nanofibers, and evaluate its antibacterial effect on methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and biocompatibility. Methods β-H/ZnONPs/PCL) nanofibers were prepared with electrostatic spinning technology. Then the obtained nanofibers were observed with scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Water vapor permeability and degradation were also detected for the fibers. The antibacterial effect of the nanofibers loaded with different doses of ZnONPs on MRSA was determined in vitro. The biological compatibility of the obtained nanofibers was evaluated with the reference of the guidelines. Results The prepared nanofibers had an uniform diameter (mainly 150 to 350 nm) under the condition of 16% PCL (w/v), voltage of 14 kV, ejection speed of 0.3 mL/h, and receiving distance of 9 cm. FTIR showed that absorption peaks were observed at the 1 732 cm-1 (C=O) and 2 950 cm-1 (C-H). The water vapor permeability of the nanofibers was superior to the non-woven fabrics (P < 0.05), and the nanofibers could be slowly degraded in the PBS (pH=7.5). The loaded ZnONPs in the nanofibers still increased the inhibitory effect of β-H on MRSA. When the ratio of ZnONPs was 1% (w/v), β-H exerted antibacterial effect on MRSA in a dose-dependent manner (P < 0.05). However, the antibacterial effect was not promoted with the increase of ZnONPs concentration under the ratio of 0.05% β-H (w/v) (P>0.05). Cytotoxicity test (MTT assay), cell adhesion test and hemolytic test indicated that 0.05% β-H/0.1 %ZnONPs/16% PCL had proved biocompatibility. Conclusion Nanofibers of 0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL exert sound antibacterial effect on MRSA, and meet the biocompatible standards for medical devices and equipments.
[Key words] beta-hinokitiol     zinc oxide nanoparticles     nanofibers     antibacterial effect     biocompatibility    

日常生活中的各种物理、化学等因素均可以对人体正常皮肤结构造成损害,形成伤口,进而暴露于外界环境中。正常人体皮肤表面有很多微生物定植,最常见的是革兰阳性球菌,有时亦有革兰阴性菌等。当皮肤受损伤时,如果伤口治疗或清洁不及时可引起严重的感染,甚至引起感染性休克而致死亡。近年来,抗菌药物的滥用导致细菌耐药率逐渐增加,超级细菌不断出现,一些高度耐药菌引起的伤口感染病例报道不断增多[1-3]。但是目前用于治疗伤口细菌感染的外用药物较少且抗菌谱较窄,因此开发可用于伤口感染的外用剂型具有一定的临床应用价值。

传统的伤口敷料如纱布、绷带、棉纱等并无明显的抗菌作用,仅能用于清洁、干燥的伤口,或仅作为其他药膏的固定等。新型创伤伤口敷料的研究已经引起了越来越多的关注,静电纺丝技术制备的纳米纤维相较于传统敷料,具有透气性能好、孔隙率高、比表面积大等优点[4]。文献报道,β-桧木醇(beta-hinokitiol,β-H)对多种细菌、真菌等微生物有较强的抗菌作用,且不易引起耐药[5],由于其低毒性在食品和化妆品中应用广泛[6-8]。纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticles,ZnONPs)也具有一定的抗菌作用[9-10],且有促进伤口愈合的作用[11-12]。研究[6]显示,β-桧木醇对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus, MRSA)的抑制作用有一个特殊的现象,即在某一较低浓度范围内出现抑菌效果下降,低于或高于这一浓度范围又恢复较强的抑菌作用。ZnONPs具有一定的抗菌作用,其与β-H联合给药可能会增强其抗菌作用,从而解决β-H在某一浓度范围无效的问题。聚己内酯(polycaprolactone,PCL)是静电纺丝技术中常用的载体材料,因其较强的脂溶性和生物相容性,常用作控缓释药物载体、细胞和组织培养基架。我们将β-H、ZnONPs两种药物和高分子材料PCL运用静电纺丝技术制备β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维,拟用于创伤感染性伤口的治疗。本研究主要分析其制备工艺、处方组成、体外抑菌效果及生物相容性, 以期为该纳米纤维未来临床推广应用提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

聚己内酯(平均分子量80 000,美国Sigma-Aldrich公司)、纳米氧化锌[(30±10)nm,上海麦克林生化科技有限公司]、β-桧木醇(东京化成工业株式会社)、2, 2, 2-三氟乙醇(上海麦克林生化科技有限公司)、DMEM培养基(美国Gibco公司)、胎牛血清(美国Gibco公司)、青霉素-链霉素双抗(碧云天)、MHB培养基(北京陆桥)、TSA培养基(海博生物)、高压静电纺丝机(第三军医大学药学院自组装)、扫描电镜(S-3400N,日本HITACHI公司)、傅里叶红外光谱仪(德国Perkin-Elmer公司)、酶标仪(Bio-RAD公司)、电热恒温培养箱(上海盛欣科技公司)、MRSA菌株(第三军医大学西南医院检验科提供的临床菌株)。

1.2 β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的制备

按一定的比例(质量浓度,%),用2, 2, 2-三氟乙醇溶解PCL,同时再分别加入β-桧木醇(质量浓度,0.5%、0.25%、0.1%、0.05%),纳米氧化锌(质量浓度,1%、0.5%、0.25%、0.1%),在35 ℃、200 r/min条件下搅拌3 h后,混悬液超声30 min,制得不同比例的电纺丝原液。将不同比例的电纺丝原液转移到10 mL针头内径为0.6 mm的注射器中,在一定条件下进行静电纺丝,制备纳米纤维。

1.3 β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的理化性质表征

1.3.1 静电纺丝技术制备纳米纤维的条件研究

分别研究PCL与溶剂的不同比例(质量浓度,10%、12%、14%、16%)、不同电压(10、12、14、16、18 kV)、不同喷速(0.3、0.6、1.2、2.0 mL/h)、不同接收距离(5、9、18 cm)纳米纤维的可纺性。以能否喷出纺丝、是否堵塞喷头、纺丝形态结构(均匀性、是否有串珠)为考察指标,用载玻片接纺丝于倒置电子显微镜下观察静电纺丝的形貌。

1.3.2 扫描电镜观察纳米纤维结构

将所得的纳米纤维裁剪成1 cm×1 cm大小,贴在导电胶并固定在样品台上,喷金约10 s,用扫描电镜(S-3400N,日本HITACHI公司)于扫描电压15.0 kV下观察拍照。每张照片选取30根纳米纤维,并用Image J软件计算其直径大小。

1.3.3 纳米纤维的红外光谱特征

分别取PCL纳米纤维、ZnONPs/PCL纳米纤维、β-H/PCL纳米纤维、β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维裁剪成1.5 cm×1.5 cm大小,送傅里叶红外光谱仪(德国Perkin-Elmer公司)检测。

1.3.4 纳米纤维的水蒸气渗透率测试

参照ASTME96干燥剂法[13]测定纳米纤维的水蒸气透过率,用小烧杯装载一定量的变色硅胶,纳米纤维封口,将其置于37 ℃、相对湿度为75%(饱和氯化钠溶液)的恒温孵箱中放置24 h。分别测量纳米纤维的厚度d(mm)、烧杯的内径r(cm)、放置24 h后膜的重量差△m(g)。由W=△m/24、A=3.14r2分别计算出膜透过的水蒸气量W(g/h)和膜的暴露面积A(cm2);再根据公式Rwvp=W/(A·△P)、P=Rwvp·d计算纳米纤维的水蒸气透过速率Rwvp[g/(h·cm3·mmHg)]和水蒸气渗透率P[g/(h·cm2·mmHg)],其中△P在37 ℃、相对湿度为75%时的值为23.8 mmHg。

1.3.5 β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的降解曲线

按照10 mm×50 mm的规格截取纳米纤维膜,称质量后浸泡在装有30 mL模拟降解液PBS(pH=7.5)缓冲溶液的离心管中,置于37 ℃恒温箱中,分别于10、20、30、40、50 d时取出,蒸馏水冲洗样品表面,干燥后称质量, 浸泡前质量记为W0,浸泡后不同时间点干燥后质量记为WT,用WT/W0×100%表示纳米纤维降解后的剩余质量比,反映其降解趋势。

1.4 β-H与ZnONPs的最小抑菌浓度测定及纳米纤维的抗菌性能研究

分别精密称取一定量的β-H和ZnONPs原料药,配成浓度为2 048、4 096 μg/mL的原液。ZnONPs原液需要超声30 min从而配成悬浮液。将培养至对数生长期的MRSA菌液按105 CFU/mL、100 μL浓度铺至96孔板,分别加入终浓度为256~0.125 μg/mL用MHB等比例稀释的β-H,以及终浓度为1 024~32 μg/mL的ZnONPs, 37 ℃恒温培养箱培养24 h后,用酶标仪在595 nm处测定吸光度值[D(595)值]。然后根据实验结果选择β-H对MRSA的空白浓度范围,在此范围内联合给予ZnONPs(浓度<ZnONPs的最小抑菌浓度),测定加入ZnONPs后β-H在空白无效浓度范围内是否恢复对MRSA的抑菌作用。

为了初步研究ZnONPs制成纳米纤维后是否仍能增加β-H的抗菌作用,选取0.05% β-H/0.5% ZnONPs/16% PCL与较高浓度单药的0.25% β-H/16% PCL、1% ZnONPs/16% PCL纳米纤维,采用测抑菌圈直径及其对MRSA生长曲线的影响两种方法比较了不同纳米纤维间的抗菌效果。将制得的纳米纤维制成直径为6 mm的圆形薄膜块(厚度、质量相近),双侧紫外灭菌各1 h、然后将其贴在接种MRSA菌株的培养皿上,置于37 ℃恒温培养箱中孵育24 h后测量其抑菌圈大小,同法筛选不同药物比例的纳米纤维膜对MRSA菌株的抑菌效果。另分别精密称量质量相近的0.05% β-H/0.5% ZnONPs/16% PCL、0.25% β-H/16% PCL、1% ZnONPs/16% PCL、16% PCL纳米纤维,分别加入5 mL对数生长期的MRSA菌液(107 CFU/mL)中,37 ℃恒温培养,在0、4、8、16、24 h时间点取样200 μL在595 nm处测定D(595)值。

1.5 β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的生物安全性评价

1.5.1 细胞毒性评价

采用MTT法检测纳米纤维膜的细胞毒性。将培养至对数期的人皮肤成纤维细胞按5 000/mL接种至96孔板,接种体积为150 μL,待其贴壁生长24 h后,加入经过灭菌处理的圆形纳米纤维膜(直径6 mm),分别在37 ℃、5% CO2恒温孵箱中孵育24、72 h。然后移去纳米纤维,加入20 μL MTT,继续孵育4 h,吸去培养基,加入150 μL二甲基亚砜,于室温下避光振摇10 min后,在490 nm下测吸光度值[D(490)值]。

1.5.2 细胞粘附性评

价根据MTT实验结果,选取了0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCL、0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL、16% PCL 3组纳米纤维进行细胞粘附性生长实验。在75%乙醇浸泡约2 h后烘干,双侧紫外灭菌各1 h后加入12孔板,培养至对数期的人皮肤成纤维细胞按5 000/mL接种至加入纳米纤维的孔中,接种体积为1 mL。分别在37 ℃、5% CO2孵箱中孵育72 h后,取出纳米纤维用PBS漂洗3次,预冷的戊二醛溶液固定2 h后,用生理盐水洗5 min,依次在30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液中脱水(每次脱水5~7 min),然后在50%、70%、90%、95%、100%叔丁醇中置换(每次置换5~7 min),吸水纸吸干表面液体固定在样品台上,干燥后喷金,在扫描电镜(S-3400N,日本HITACHI公司)下观察细胞在纳米纤维上的粘附性生长情况。

1.5.3 溶血率测定

待测纳米纤维按照GB/T 16886.5-2011标准[14]制作浸提液,溶血率<5%说明受检材料符合医用材料溶血要求,≥5%则表明生物材料具有一定的溶血风险。实验的阴性对照组采用灭菌的0.9%氯化钠生理盐水,阳性对照组采用灭菌双蒸水,实验组为本课题组制得的纳米纤维。向不同组别加入200 μL 2%人红细胞悬浮液,在37 ℃恒温放置2 h后2 500 r/min离心5 min,吸取上清液至96孔板,在545 nm下测定吸光度值[D(545)值]。溶血率=[实验组D(545)值-阴性对照组D(545)值]/[阳性对照组D(545)值-阴性对照组D(545)值]×100%。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件,计量资料以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 静电纺丝技术制备纳米纤维的条件

16% PCL(质量浓度)电纺丝液在电压为14 kV、喷射速度为0.3 mL/h、接收距离为9 cm时,所得的纳米纤维外观形态较为均匀,无明显粘连,见表 1

表 1 不同因素对纳米纤维可纺性的影响
影响因素 变量 是否堵塞喷头 能否喷出纺丝 结果
PCL比例(14 kV, 0.3 mL/h, 9 cm) 10% 大量串珠,不均匀
12% 较多串珠,不均匀
14% 少量串珠,不均匀
16% 无串珠,均匀
电压(16 %, 0.3 mL/h, 9 cm) 10 kV 少量串珠,均匀
12 kV 极少量串珠,均匀
14 kV 无串珠,均匀
16 kV 无串珠,均匀
18 kV 无串珠,均匀
喷射速度(16%, 14 kV, 9 cm) 0.3 mL/h 无串珠,均匀
0.6 mL/h 有少量串珠,不均匀
1.2 mL/h -
2.0 mL/h -
接收距离(16%, 0.3 mL/h, 14 kV) 5 cm 在接收板上过于集中
9 cm 无串珠,均匀
18 cm 超出接收板距离

2.2 β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的理化性质表征

2.2.1 扫描电镜观察纳米纤维结构

制得的纳米纤维(16% PCL、0.5% β-H/16% PCL、1% ZnONPs/16% PCL、0.5%β-H/1% ZnONPs/16% PCL)在扫描电镜15 kV、20 000倍下拍摄如图 1所示,纳米纤维直径分布较为均匀,纤维间无明显粘连融合。纳米纤维直径分布如图 2,纳米纤维直径大多分布在150~350 nm。

A:PCL;B:β-H/PCL;C:ZnONPs/PCL;D:β-H/ZnONPs/PCL 图 1 不同组成纳米纤维扫描电镜观察

A:PCL;B:β-H/PCL;C:ZnONPs/PCL;D:β-H/ZnONPs/PCL 图 2 不同组成纳米纤维的直径分布

2.2.2 纳米纤维的红外光谱特征

红外光谱仪检测发现纳米纤维(16% PCL、0.5% β-H/16% PCL、1% ZnONPs/16% PCL、0.5% β-H/1% ZnONPs/16% PCL)红外光谱图在加入β-H、ZnONPs未发生明显改变,在1 732 cm-1(C=O)、2 950 cm-1(C-H)附近有吸收峰,说明β-H和ZnONPs是以物理混合的形式分散在PCL中(图 3)。

A:PCL;B:β-H/PCL;C:ZnONPs/PCL;D:β-H/ZnONPs/PCL 图 3 不同组成纳米纤维的红外光谱图

2.2.3 纳米纤维的水蒸气透过率测试

无纺布、16% PCL、0.5% β-H/16% PCL、1% ZnONPs/16% PCL、0.5% β-H/1% ZnONPs/16% PCL纳米纤维的膜厚度(mm)分别为0.213±0.006、0.220±0.010、0.217±0.006、0.217±0.015、0.217±0.021, 各组间膜厚度相似,差异没有统计学意义(P>0.05)。各组水蒸气透过率如图 4所示,纳米纤维组比普通无纺布组透气率有明显提高(P < 0.05),不同纳米纤维之间透气率无明显差异(P>0.05),表明纳米纤维水蒸气透过率不受β-H和ZnONPs的影响,较高的水蒸气透过率反映纳米纤维的透气率良好,有利于创伤伤口的愈合。

1:普通无纺布组;2:PCL组;3:ZnONPs/PCL组;4:β-H/PCL组;5:β-H/ZnONPs/PCL组a:P < 0.05,与普通无纺布组比较 图 4 不同组成纳米纤维的水蒸气透过率

2.2.4 β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的降解曲线

利用pH=7.5的PBS模拟降解液,研究降解周期为50 d,纳米纤维(16% PCL、0.5% β-H/16% PCL、1% ZnONPs/16% PCL、0.5% β-H/1% ZnONPs/16% PCL)的降解率。如图 5所示,载药与不载药的纳米纤维在降解液中缓慢降解,放置50 d后,各组纳米纤维残留重量均在98%以上,纳米纤维降解率缓慢有利于避免反复置换敷料造成伤口的二次损伤。

图 5 不同组成纳米纤维的降解曲线(n=3)

2.3 β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的体外抗菌性能研究

首先测定β-H与ZnONPs原料药对MRSA的MIC,结果显示ZnONPs的MIC为128 μg/mL,β-H的浓度在0.5~1 μg/mL和≥16 μg/mL时对MRSA有明显的抑制作用,在2~8 μg/mL时,其抑菌效果明显下降,甚至在4 μg/mL时几乎无作用,但在2~8 μg/mL范围内加入低于MIC的ZnONPs后β-H又恢复了对MRSA的抑菌效果(图 6)。

A:β-H对MRSA的抑菌效果1~12:分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL β-H;B:ZnONPs对MRSA的抑菌效果1~6:分别为32、64、128、256、512、1024 μg/mL ZnONPs;C:ZnONPs恢复β-H对MRSA的抑菌作用1~2:32、64 μg/mL ZnONPs;3~5:2、4、8 μg/mL β-H;6:32 μg/mL ZnONPs+2 μg/mL β-H;7:32 μg/mL ZnONPs+ 4 μg/mL β-H;8:32 μg/mL ZnONPs+8 μg/mL β-H;9:64 μg/mL ZnONPs+2 μg/mL β-H;10:64 μg/mL ZnONPs+4 μg/mL β-H;11:64 μg/mL ZnONPs+8 μg/mL β-H;12:MHB培养基 图 6 β-H与ZnONPs对MRSA最小抑菌浓度及联合给药对其抑菌效果的测定

ZnONPs制成纳米纤维后仍能增加β-H对MRSA的抗菌作用。0.05% β-H/0.5% ZnONPs/16% PCL与较高浓度的单药0.25% β-H/16% PCL、1% ZnONPs/16% PCL纳米纤维相比,对MRSA的抗菌作用更强(P < 0.05, 图 7)。根据药物的质量浓度设计不同比例的药物组合,并研究不同载药量对MRSA的抑菌效果,结果见图 8。当ZnONPs的质量浓度为1%时,纳米纤维的抑菌效果随β-H含量的增大而增强(P < 0.05),当β-H的质量浓度为0.05%时,纳米纤维的抑菌效果并未随ZnONPs质量浓度的增大而增强(P>0.05),纳米纤维载药组均表现出了一定的抑菌效果。

A:抑菌圈测量图;B:抑菌圈统计结果;1:0.05% β-H/0.5% ZnONPs/16% PCL;2:1% ZnONPs/16% PCL;3:0.25% β-H/16% PCL;4:16% PCL;5:基线值a:P < 0.05,与0.05% β-H/0.5% ZnONPs/16% PCL比较;C:不同纳米纤维对MRSA生长曲线的影响a:P < 0.05,与相同时间点其他组比较 图 7 联合给药较单药纳米纤维对MRSA的抑菌作用

A:抑菌圈测量图;B:抑菌圈统计结果;1:0.5% β-H/1% ZnONPs/16% PCL;2:0.25% β-H/1% ZnONPs/16% PCL;3:0.1% β-H/1% ZnONPs/16% PCL;4:0.05% β-H/1% ZnONPs/16% PCL;5:0.05% β-H/0.5% ZnONPs/16% PCL;6:0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCL;7:0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL;8:基线值a~d: P < 0.05,各组间两两比较;e:P < 0.05,与其他各组比较 图 8 不同载药比例的纳米纤维对MRSA的抑菌效果

2.4 β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的体外生物安全性评价

2.4.1 细胞毒性评价

理想的创伤敷料应该对细胞无毒性或毒性非常小,经过体外细胞毒性实验发现,0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCL、0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL组成的纳米纤维膜符合GB/T 16886.5-2011的标准要求(表 2,同时参照了美国药典标准)。实验结果表明,当β-H的质量浓度固定为0.05%时,纳米纤维的细胞毒性随ZnONPs质量浓度的增高而增大(P < 0.05),且当ZnONPs质量浓度为1%时,除0.05% β-H/1% ZnONPs/16% PCL外,纳米纤维的细胞毒性并未随β-H含量的增高而进一步增大(P>0.05),说明纳米纤维中ZnONPs对细胞的毒性作用可能更大。

表 2 不同载药比例的纳米纤维对人皮肤成纤维细胞的毒性分级
组别 24 h 72 h
RGR(x±s,%) 毒性级别 RGR(x±s, %) 毒性级别
0.5% β-H/1% ZnONPs/16% PCL 22.68±0.01 4 22.49±0.02 4
0.25% β-H/1% ZnONPs/16% PCL 21.17±0.01 4 20.85±0.01 4
0.1% β-H/1% ZnONPs/16% PCL 22.92±0.01 4 22.17±0.01 4
0.05% β-H/1% ZnONPs/16% PCLa 29.76±0.03 4 29.60±0.03 4
0.05% β-H/0.5% ZnONPs/16% PCLb 60.60±0.01 2 57.41±0.01 2
0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCLc 83.68±0.00 1 78.31±0.01 1
0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCLd 92.36±0.02 1 90.25±0.02 1
16% PCLe 98.57±0.01 1 97.52±0.01 1
a~e:P < 0.05,各组间两两比较

2.4.2 细胞粘附性评价

根据MTT实验,选择0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCL、0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL、16% PCL 3组纳米纤维,观察人皮肤成纤维细胞在纳米纤维上的生长情况。如图 9所示,人皮肤成纤维细胞能在纳米材料上正常附着生长、铺展、增殖。

A、B:16% PCL;C、D:0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL;E、F:0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCL;A、C、E:×200;B、D、F:×500 图 9 扫描电子显微镜下观察人皮肤成纤维细胞在纳米纤维上的粘附性生长结果

2.4.3 溶血率测定

0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCL、0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL、16% PCL纳米纤维溶血率均<5%,符合要求(表 3)。

表 3 不同组分纳米纤维不同时间溶血率检测结果(x±s,%)
组别 24 h 72 h
0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCL 3.375±0.001 3.980±0.001
0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL 2.000±0.002 2.985±0.001
16% PCL 0.625±0.000 1.119±0.000

3 讨论

理想的创伤伤口敷料应该能够保持伤口适宜的湿润、吸收过多的渗出液、阻止微生物感染伤口、透气性能良好、生物相容性较好(无毒、不会引起机体过敏)、促进伤口愈合等,对于需要长期滞留机体内的还应该具有生物可降解性[15]。随着对伤口敷料研究的深入,目前大致可以分为四大类:传统敷料、适宜型敷料、新型敷料、生物智能型敷料[16]。其中传统敷料最常用的是纱布,它仅能提供隔离保护的作用,使伤口免于暴露在外界环境中;适宜型敷料具有代表性的是水凝胶和棉纱,其除具有隔离作用外,尚能保持伤口适当的潮湿和透气性能;新型敷料除具有以上功能外,开始具有一定的治疗作用;生物智能型敷料的功能更加强大,兼具多种治疗作用(如同时具有预防感染和促进伤口愈合的作用),部分甚至具有智能型(可以预警伤口是否感染或感染的严重程度)。目前,新型敷料的研究已经十分充分,生物智能型敷料的研究也取得了一定的进展,但是仍有许多问题值得探讨。首先,可以预警伤口是否感染或感染严重程度的智能型敷料研究尚处于起步阶段。其次更多新的问题在不断提出。例如:用于感染性伤口的敷料如何实现早期以抗菌治疗为主,后期以促进伤口愈合为主;可以识别细菌感染种类,且兼具治疗作用的敷料研究;可以用于治疗耐药菌或多种微生物引起的感染性伤口的敷料;伤口未继发感染时促进伤口愈合,而继发感染时可以触发其抗感染作用的智能型敷料等。

本研究探讨了β-H/ZnONPs/PCL纳米纤维的制备工艺、处方组成、对MRSA的体外抑菌效果及其生物相容性。实验结果表明β-H/ZnONPs/PCL在一定条件下可以制成直径均匀的纳米纤维,其在透气性能等方面优于传统无纺布组,较慢的降解速度避免了因快速降解而需要频繁更换伤口敷料的不足。研究发现,β-H对MRSA存在无效浓度范围,而同时给予ZnONPs可以消除这一现象,将两种药物与PCL制成纳米纤维后,ZnONPs仍能增强β-H对MRSA的抗菌活性,解决了β-H单药对MRSA存在无效浓度以及ZnONPs混悬液易于聚集沉淀的缺点。体外抑菌实验表明β-H是材料中主要的抗菌物质,且细胞毒性相对较小,ZnONPs对MRSA作用较弱,且细胞毒性较大。人皮肤成纤维细胞能在0.05% β-H/0.25% ZnONPs/16% PCL和0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL两种组成的纳米纤维上正常生长、增殖,且后者的溶血率低于前者。因此,0.05% β-H/0.1% ZnONPs/16% PCL纳米纤维在保持对MRSA的抗菌活性的同时,具有良好的体外生物相容性,未来在用于创伤感染性伤口的治疗方面,具有一定的临床应用前景。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201707052
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

黄金柱, 胡敏, 孙建彬, 周敏, 盛芳芳, 卢来春.
HUANG Jinzhu, HU Min, SUN Jianbin, ZHOU Min, SHENG Fangfang, LU Laichun.
β-桧木醇/纳米氧化锌/聚己内酯纳米纤维的体外抑菌效果及生物相容性评价
In vitro antibacterial effect and biocompatibility of nanofibers composed of beta-hinokitiol, zinc oxide nanoparticles and polycaprolactone
第三军医大学学报, 2017, 39(21): 2084-2092
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(21): 2084-2092
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201707052

文章历史

收稿: 2017-07-06
修回: 2017-08-31

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