乳腺癌是目前全世界女性恶性肿瘤中常见的癌症之一[1]。乳腺癌患者死亡的主要原因是发生了远端转移和对药物的抵抗,针对药物的治疗效果降低导致治疗无效[2]。由于乳腺癌早期症状缺乏特异性,早期诊断困难,确诊时多已属中晚期,5年生存率偏低[3]。所以寻找新的分子机制早期诊断和治疗乳腺癌是目前研究的主要方向,对其的诊断和生物靶向治疗也都有重要的推动意义。
长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是一类长度约为200个核苷酸的转录因子,其很少编码蛋白质[4]。最近研究表明lncRNA在生物体内广泛参与多种生物行为,如增殖、凋亡、细胞迁移和细胞侵袭等[5-7]。虽然已有报道lncRNA可以介导调节肿瘤转移过程和上皮细胞-间充质转化(epithelial cells-mesenchymal transformation,EMT)的前体作用[8],但是关于lncRNA在肿瘤细胞内的生物学作用的具体过程却不清楚。多功能细胞因子——转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)可以调节复杂的信号网络调节致癌和进展[9]。研究已经证实TGF-β信号可以促进癌症进展和通过增强肿瘤细胞的增殖、迁移和入侵等行为增强各种耐药性治疗,主要是由于其诱导上皮细胞的能力过渡(EMT)[10-11]。已经证明EMT通过促进癌细胞的侵袭与癌症进展密切相关[12]。TGF-β在乳腺癌中与部分lncRNA的协同作用已被证实。TGF-β可以调控包括Smad在内的靶向目标,激活PI3K/Akt途径改变肿瘤细胞的分泌微环境,从而影响乳腺癌细胞的生物学行为[13]。另有研究显示,lncRNA可以和下游miRNA共同作用调控TGF-β的表达,参与不同细胞株的行为调控[14-15]。
ATB是首个被发现的能被转化生长因子激活的lncRNA。本研究检测乳腺癌细胞株中ATB和miR-200c的表达水平,再抑制其表达,观察乳腺癌细胞生物学行为的变化及下游TGF-β的激活水平,旨在探讨ATB对乳腺癌细胞的增殖和侵袭转移行为的影响。
1 材料与方法 1.1 细胞株和试剂人乳腺癌细胞株BT474、SKBr-3、MCF7及MDA-MB-453细胞株购自上海细胞研究所。细胞培养条件:在RPMI1640培养基(90%)中加入10%胎牛血清(HyClone,USA),放在37 ℃下,5% CO2的恒温孵箱中培养。ZEB1和ZNF217抗体购自美国Abcam(ab73643,ab136678)。miR-200c-inhibitor和ATB-siRNA购自上海吉凯制药技术有限公司。qPCR引物以及RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自上海吉玛基因有限公司。
1.2 实验分组及细胞株处理实验分为3组。ATB-siRNA组:将ATB-siRNA转染入SKBr-3细胞;阴性对照组:将对照模拟物转染入SKBr-3细胞;ATB-siRNA+miR-200c-inhibitor组:将miR-200c-inhibitor转染入ATB-siRNA组SKBr-3细胞(已转染ATB-siRNA mimic)。后续采用ATB-siRNA组和阴性对照组或ATB-siRNA组和ATB-siRNA+miR-200c-inhibitor组进行实验。
1.3 miRNA提取和qPCR试验使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分离乳腺癌细胞的总RNA,并使用TM miRNA分离试剂盒(Ambion,Austin,TX,USA)进一步纯化miRNA部分。通过光谱测定RNA样品的浓度和纯度。使用实时PCR系统进行实时逆转录PCR(qPCR)。U6管家基因作为对照。反应条件:95 ℃ 10 min,45个循环;在95 ℃变性10 s,在60 ℃下退火和延伸60 s。用2-ΔΔCt方法计算乳腺癌SKBr-3细胞的miRNA相对表达量。实验重复3次。ATB的引物序列上游:5′-ATCATCCGTTCCGGATTTGTCTTC-3′,下游:5′-AGCATTGCCTGGGTCCCATC-3′,片段大小为1 530 bp;miR-200c的引物序列上游:5′-GCTCGATTCCTTCGGCTGGGACCTT-3′,下游:5′-ATAAGAATGCGGCCGCGGGCCTCTTCTG-3′,片段大小为360 bp。
1.4 细胞培养和转染通过慢病毒转染获得过表达ATB-siRNA和miR-200c-inhibitor的乳腺癌细胞,将编码ATB-siRNA或空载体的慢病毒感染到SKBr-3细胞中。根据说明书使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA),将其转染入细胞48 h,获得相应稳定表达的细胞株。
1.5 双荧光素酶试验使用双荧光素酶实验验证ATB和miR-200c的相关关系。将24孔板中的ATB或阴性对照细胞与0.4 mg萤火虫荧光素酶报告载体和0.1 mg含有海肾荧光素酶(Promega)的pRL-TK对照载体共转染,pmirGLO-miR-200c-WT代表野生型质粒载体和miR-200c结合共转染,pmirGLO-miR-200c-MUT代表突变型质粒载体和miR-200c结合共转染。根据siPORTneoFX使用方法操作,在转染后48 h制备裂解物。使用双荧光素酶报告基因测定系统,转染24 h后测定荧光素酶活性。实验重复3次。
1.6 MTT增殖实验将对数期SKBr-3细胞使用胰蛋白酶消化后,制成单细胞悬浮液并以1×103/孔接种到96孔板中。在细胞培养7 d后,加入20 μL MTT测定液,每孔充分混合均匀,在37 ℃下孵育4~6 h。然后使用无菌吸管吸出上清液,每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO),在室温下搅拌10 min保证晶体充分溶解。然后在1、2、3、4、5 d进行MTT,测定波长为490 nm时的光密度值[D(490)],计算SKBr-3细胞的增殖,D(490)值衰减越慢表明细胞增殖数目越多。实验重复3次。
1.7 Transwell侵袭试验将5×104个乳腺癌细胞置于上室,并加入Matrigel基质胶。将具有10% FBS的培养基置于下室中。在37 ℃下孵育24 h后,小心去除上膜表面上的细胞。95%乙醇固定20 min后,0.5%结晶紫溶液染色10 min,自来水冲洗干净,于倒置显微镜下计数。实验重复3次。
1.8 蛋白质印迹使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白,并将其转移到硝酸纤维素膜。使用5%脱脂牛奶充分封闭膜,并与ZEB1和ZNF217抗体(浓度1: 2 000),内参GAPDH(浓度1: 2 000),4 ℃,孵育过夜。次日,TBST充分冲洗过后,使用二抗辣根酶标记物(浓度1: 5 000)孵育2 h,TBST充分冲洗过后,使用增强的化学发光试剂ECL显影液检测目标蛋白的表达水平。
1.9 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件,计量资料数据以x±s表示,采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 乳腺癌细胞中ATB和miR-200c的表达与BT474、MCF7、MDA-MB-453细胞株相比,lncRNA-ATB在SKBr-3乳腺癌细胞株中表达水平最低;miR-200c在SKBr-3乳腺癌细胞株中表达水平最高(图 1)。因此,选择SKBr-3细胞株进行后续实验。
2.2 双荧光素酶实验检测ATB和miR-200c的关系
生物信息学分析发现,ATB和miR-200c有可结合的位点。双荧光素酶实验表明,抑制ATB的表达后可以相应增强miR-200c的表达活性(图 2)。推测miR-200c可能是ATB下游的相应作用靶点,ATB可能通过调控miR-200c的表达影响乳腺癌的生物学行为。
2.3 抑制ATB的表达对乳腺癌细胞增殖能力的影响
MTT细胞增殖实验结果显示:抑制ATB的表达后,SKBr-3细胞的增殖能力增强;随着时间的延长,ATB-siRNA组细胞的增殖能力较阴性对照组明显增强(P < 0.05,图 3)。表明抑制ATB的表达在一定程度上可以增强乳腺癌细胞的增殖能力。
2.4 抑制ATB的表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响
Transwell侵袭实验结果显示:抑制ATB的表达后,SKBr-3细胞的侵袭能力增强;ATB-siRNA组细胞的侵袭能力较阴性对照组明显增强[(165.22±24.16) vs (41.82±7.95),P < 0.05,图 4]。表明抑制ATB的表达在一定程度上可以增强乳腺癌细胞的侵袭能力。
2.5 抑制miR-200c的表达对乳腺癌细胞增殖能力的逆转作用
MTT细胞增殖实验结果显示:抑制ATB的表达后再沉默miR-200c的表达,发现SKBr-3细胞增强的增殖能力受到一定的抑制,且随着时间的延长,ATB-siRNA+miR-200c-inhibitor组细胞的增殖能力受到的抑制更加明显(图 5),表明抑制ATB的表达后,沉默miR-200c的表达在一定程度上可以抑制ATB对乳腺癌细胞的增殖能力的影响。推测miR-200c在乳腺癌中可能扮演一个促癌因子的角色。
2.6 抑制miR-200c的表达对乳腺癌细胞侵袭能力的逆转作用
Transwell侵袭实验结果显示:抑制ATB的表达后再沉默miR-200c的表达,发现SKBr-3细胞增强的侵袭能力受到一定的抑制,ATB-siRNA+miR-200c-inhibitor组细胞的侵袭能力受到的抑制更加明显[(168.75±21.42) vs (36.42±8.15),P < 0.05,图 6]。表明抑制ATB的表达后,沉默miR-200c的表达在一定程度上可抑制ATB对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,推测miR-200c在乳腺癌中扮演一个促癌因子的角色。
2.7 抑制ATB的表达对ZEB和ZNF217蛋白表达水平的影响
Western blot检测结果显示,抑制ATB的表达,ZEB1和ZNF217的表达水平相应增高(图 7)。表明抑制ATB的表达后,TGF-β通路的抑制被解除,激活水平提高,参与乳腺癌细胞的生物学行为的调控行为。
3 讨论
本研究探讨了乳腺癌细胞转移相关的行为,也为早期预测乳腺癌是否发生转移提供了一定的理论依据。研究证明,ATB在多种组织器官中显示出明显的转移抑制作用[16],表明ATB与乳腺癌的转移行为密切相关。本研究证实ATB可以与下游miRNA相互作用共同参与调控乳腺癌细胞的增殖和侵袭行为,最后通过介导乳腺癌细胞的EMT行为对乳腺癌细胞进行干预[17]。有研究证实,ATB可以调解TGF-β在肝细胞癌、结直肠癌和乳腺癌中的表达及对EMT行为的影响,表明ATB是多种类型肿瘤细胞中的有效调控因子,不单单在乳腺癌细胞中起调控作用[18]。此外,ATB也被证实是TGF-β/Smad通路上游的直接调控靶标[19]。较高水平的ATB与乳腺癌患者中的耐药性产生有一定的关联,其可以影响曲妥珠单抗耐药性的产生[20],与本研究发现TGF-β信号传导的激活相一致。本研究还发现乳腺癌患者miR-200c和ATB的表达相关,ATB和miR-200c共同调控乳腺癌细胞的增殖和侵袭行为及EMT过程。
本研究发现,ATB和miR-200c在乳腺癌细胞的EMT和侵袭转移行为中起关键调控作用。在恶性肿瘤发展的过程中,ATB是miR-200c的上游靶标。本研究进一步证实ATB不仅可以调节miR-200c的表达,miR-200c也可在一定程度上逆转ATB的作用;阐明了ATB在乳腺癌细胞内和miR-200c的相关联系,以及miR-200c在乳腺癌细胞中作为ATB下游因子所起到的逆转调控作用。推测ATB和miR-200c通过调节TGF-β通路中的ZEB1/ZNF217蛋白参与乳腺癌细胞的生物学行为。
TGF-β中的ZNF217是乳腺癌候选基因之一。有学者发现,过表达ZNF217可以促进乳腺癌细胞的迁移行为并可诱导体内淋巴结的转移[21]。ZNF217曾被确认是促进EMT并介导TGF-β表达水平上调的关键因子[18]。即ZNF217可能是TGF-β介导乳腺癌侵袭转移过程中的重要一环,ZNF217的激活对乳腺癌细胞自身的增殖和侵袭能力有一定的影响[22]。越来越多的miRNA已被证明与乳腺癌的转移和耐药相关。有学者指出miR-21和miR-144参与介导乳腺癌中曲妥珠耐药抗性,且过表达miR-21和miR-144后乳腺癌细胞的体外成瘤能力得到明显抑制[23-24]。目前,miRNA在乳腺癌中与下游相关靶点的联系不太明确,不同的miRNA分子有不同的作用靶点,所以明确miRNA和下游靶点的联系也是揭示乳腺癌生物学行为的关键一环。本实验证实,miR-200c/ZEB1和miR-200c/ZNF217都可能参与乳腺癌的增殖侵袭过程。一方面,ATB和miR-200c之间的负反馈调节的确存在,ATB可能作为miR-200c/ZEB1和miR-200c/ZNF217起上游调控作用。另一方面,有研究指出ATB可以有效对抗乳腺癌细胞的耐药性和EMT。本研究对阐明ATB和miR-200c在乳腺癌中的作用方式提供了参考。
综上所述,ATB和miR-200c可能作为乳腺癌调控因子干扰乳腺癌细胞的增殖和侵袭行为,且可以激活TGF-β通路影响乳腺癌细胞的生物学行为,后续实验拟进行进一步的相关信号通路的研究,丰富ATB在更多乳腺癌细胞株中的表达,完善实验的内容。
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