2. 400010 重庆, 重庆医科大学附属第二医院: 检验科;
3. 400010 重庆, 重庆医科大学附属第二医院: 感染科
2. Department of Laboratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China;
3. Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是导致慢性肝炎重要因素之一,全球有超过1.85亿感染者[1]。持续的HCV感染是导致慢性肝炎、肝硬化,甚至是肝细胞肝癌的重要诱因[2-3]。丙型肝炎的治疗存在耐药突变等问题,RNA干扰技术可能成为HCV基因治疗的有效手段[4-5],但siRNA转运载体和靶向性问题急需解决。维生素E(Vitamin E)可通过结合肝细胞表面特异性受体而转运至肝脏代谢[6]。本研究应用Vitamin E、胆固醇、DOTAP结合的阳离子脂质体合成纳米颗粒,携带针对HCV 5′非翻译区和核心蛋白的siRNA,在细胞模型上验证其靶向抑制HCV表达的效果,这将为RNA干扰技术在HCV基因治疗的临床应用方面提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株和质粒Huh7.5.1细胞由本实验室保存;用于构建HCV稳定表达细胞模型的质粒pSGR-JFH1是由日本东京神经研究所Takaji Wakita教授馈赠;用于构建瞬时表达HCV核心蛋白的pCDNA3.1(+)-3FLAG-Core(pCore-3FLAG)质粒由本实验室构建并保存。
1.1.2 主要试剂高糖DMEM培养基由HyClone公司采购;胎牛血清购自Gibco公司;限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ购于日本TaKaRa公司;Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司;DOTAP购于美国Avanti公司;胆固醇购于美国GENVIEW公司;Vitamin E购于美国SIGMA公司;CCK-8试剂盒购于日本Dojindo公司;所需一抗HCV-NS3、HCV-NS5购于美国Abcam公司,HCV-Core购于美国Santa公司,β-actin购于中国博士德公司;所需二抗均购于中国中衫金桥公司;DAPI购于美国Santa公司;所用siRNA由上海吉玛公司合成。
1.1.3 主要仪器荧光显微镜成像系统(德国Leica DM4000)、激光粒度分析仪(中国Rise-2008)、透射电子显微镜(日本HITACHI7500)、凝胶电泳成像系统(美国Gel Doc 1000, Bio-Rad)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养Huh7.5.1细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。培养基中添加100 U/mL的青霉素和100 U/mL的链霉素。
1.2.2 构建稳定表达HCV复制子的细胞株Huh7.5.1-HCV用限制性内切酶XbaⅠ处理HCV复制子质粒pSGR-JFH1使之线性化,绿豆核酸酶和蛋白酶K消化处理酶切产物,酚氯仿法抽提纯化DNA。然后以纯化的线性DNA为模板,采用T7体外转录试剂盒进行体外转录,获得采用HCV复制子基因组RNA,按照说明书进行操作。将HCV复制子基因组RNA用转染试剂Lipofectamine 2000转染至Huh7.5.1细胞中,转染后3 d加入G418进行筛选,以获得稳定表达HCV复制子的细胞株,并命名为Huh7.5.1-HCV[7]。
1.2.3 免疫荧光验证Huh7.5.1-HCV构建通过免疫荧光技术检测Huh7.5.1-HCV细胞中HCV非结构蛋白NS3和NS5A的表达情况,鉴定Huh7.5.1-HCV是否筛选成功。用Huh7.5.1-HCV细胞制备24孔板细胞爬片,完全培养基培养24 h后弃掉孔中培养基,用PBS洗3次。加入4%多聚甲醛,37 ℃固定10 min,弃去固定液,PBS洗3次。加入0.1% Triton 37 ℃孵育10 min破膜,弃掉Triton,用PBS洗3次。夹出爬片置于蜡板上,山羊血清37 ℃封闭1 h,PBS洗3次。加入一抗(1:100),4 ℃过夜孵育。第2天拿出蜡板,用PBS洗3次,加入荧光二抗(1:200)37 ℃避光孵育1 h,PBS洗3次。DAPI (1:20)37 ℃避光孵育10 min,PBS洗3次。用防淬灭封片剂封片,立即在荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.4 瞬时表达HCV core蛋白的细胞株Huh7.5.1-Core的构建及验证培养Huh7.5.1细胞,接种24孔板,待细胞60%~70%汇合度时以脂质体Lipofectamine 2000转染质粒pCore-3FLAG至细胞内。转染后48 h后,通过免疫荧光技术检测HCV核心蛋白的表达情况。
1.2.5 siRNA的序列实验中所用siRNA正向序列为siRNA-NS5A: 5′-UCAAGCUAGCGGCUUCCAAdTdT-3′和siRNA-core:5′-GGUUGGUGUUACGUUUGGUd-TdT-3′。分别合成正反向序列退火形成双链后-80 ℃备用。
1.2.6 纳米颗粒VE-DC的制备及鉴定应用胆固醇和DOTAP通过薄膜水化法制备纳米颗粒DC[8],将DOTAP与胆固醇按照等摩尔比例溶于10 mL氯仿中,在40 ℃用全真空减压旋转去除有机溶剂形成一层均匀薄膜。再加入10 mL氯仿和3 mL PBS混合均匀后,超声振荡100 W,30 ℃,2 min形成均匀混合物。将混合物在40 ℃半真空条件下旋转形成凝胶状,加入7 mL PBS。将凝胶在40 ℃常压旋转30 min,形成均匀状物质即纳米颗粒DC。DC在4 ℃条件下与Vitamin E按照摩尔比例1:2过夜孵育形成纳米颗粒VE-DC。将VE-DC与siRNA按照1:1的摩尔比例在37 ℃孵育10 min,形成VE-DC/siRNA复合物。应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的粒度分布和zeta电位,应用透射电子显微镜观察VE-DC形态及分散性。
1.2.7 细胞毒性实验(CCK-8实验)采用CCK-8实验检测纳米颗粒VE-DC对Huh7.5.1的细胞毒性。将Huh7.5.1按照5 000个/孔接种于96孔板,分别加入0、20、40、60、80、100、200、400 nmol/L的纳米颗粒VE-DC及商品化脂质体Liposome 2000,孵育36 h后加入CCK-8试剂100 μL,孵育2 h,使用酶标仪测定吸光度,计算细胞相对活力。
1.2.8 血清稳定性测定在37 ℃条件下,将裸siRNA、DC/siRNA、VE-DC/siRNA分别加入50%的人血清中,然后分别孵育不同时间:0、3、6、12、24、48、72、96 h,样本用2%的凝胶进行分离,使用凝胶电泳成像仪分析其稳定性。
1.2.9 验证纳米颗粒VE-DC/siRNAs的有效性通过荧光显微镜观察经VE-DC/siRNA-cy3(40 nmol/L)、DC/siRNA-cy3(40 nmol/L)、lipofectamine/siRNA-cy3(40 nmol/L)处理的Huh7.5.1-HCV、Huh7.5.1-core,检测VE-DC/siRNA的入胞情况。
通过蛋白印迹技术及免疫荧光等方法检测经VE-DC/siRNA(siRNA-5A,40 nmol/L)、DC/siRNA(siRNA-5A,40 nmol/L)、lipofectamine/siRNA(siRNA-5A,40 nmol/L)分别处理后,NS3蛋白(处理48 h)的表达量来验证其有效性。同时用VE-DC/siRNA(siRNA-Core, 40 nmol/L)、DC/siRNA(siRNA-Core,40 nmol/L)、lipofectamine/siRNA(siRNA-Core, 40 nmol/L)分别处理Huh7.5.1-Core细胞后通过蛋白印迹技术及免疫荧光等方法检测Core水平进一步验证VE-DC/siRNAs的有效性。
1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行分析,组间差异比较采用t检验和单因素方差分析。
2 结果 2.1 稳定表达HCV亚基因组复制子的细胞株Huh7.5.1-HCV构建成功HCV复制子结构见图 1A。HCV复制子基因组RNA转染Huh7.5.1细胞并进行筛选获得稳定细胞株,通过免疫荧光技术检测Huh7.5.1-HCV细胞中HCV非结构蛋白NS3和NS5A的表达,鉴定Huh7.5.1-HCV筛选成功(图 1B)。
2.2 瞬时表达HCV core蛋白的细胞株Huh7.5.1-Core构建成功
HCV核心蛋白真核表达质粒结构见图 2A,转染后通过免疫荧光技术可检测到HCV7.5.1-Core中core蛋白的表达,提示该细胞株构建成功(图 2B)。
2.3 纳米颗粒VE-DC/siRNA粒度分布、zeta电位及形态的测定
VE-DC纳米颗粒结构见图 3A。在37 ℃条件下,应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的粒度分布和zeta电位。DC/siRNA粒度分布为(118.0±7.7) nm,zeta电位为(40.6±3.4) mV;VE-DC/siRNA的粒度分布为(125.5±9.0) nm,zeta电位(39.1±4.8) mV。透射电子显微镜结果显示VE-DC/siRNA形态是球形,分散性均一(图 3B),其大小与激光粒度测量仪测量结果吻合。
2.4 CCK-8实验检测纳米颗粒VE-DC/siRNA的细胞毒性
用VE-DC/siRNA处理的Huh7.5.1的细胞活力显著高于用商品化的脂质体处理,如浓度为100 nmol/L的商品化脂质体处理时,细胞存活率下降了45%。相反,浓度为100 nmol/L纳米颗粒VE-DC/siRNA处理组细胞存活率较高,甚至在200 nmol/L VE-DC/siRNA时,也表现出低细胞毒性(表 1)。这些结果提示纳米颗粒VE-DC/siRNA的细胞的毒性相对较小。
组别 | 0 ng/mL | 20 ng/mL | 40 ng/mL | 60 ng/mL | 80 ng/mL | 100 ng/mL | 200 ng/mL | 400 ng/mL |
空白组 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
DC/siRNA | 100 | 101 | 95 | 93 | 91a | 88 | 86b | 82b |
VE-DC/siRNA | 100 | 100 | 95 | 92 | 90a | 89 | 85b | 83b |
Liposome/siRNA | 100 | 99 | 90 | 88a | 78b | 55b | 54b | 36b |
a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与空白组比较 |
2.5 血清稳定性测定
与血清孵育24 h后,DC/siRNA或VE-DC/siRNA组仍有完好的siRNA存在,而裸siRNA在6 h之后已经全部降解(图 4)。这表明,纳米颗粒VE-DC可以作为合适的载体对siRNAs进行转运。
2.6 验证纳米颗粒VE-DC/siRNAs的有效性
通过荧光显微镜观察VE-DC/siRNAs的入胞情况。用VE-DC/siRNA-cy3分别处理Huh7.5.1-HCV和Huh7.5.1-core细胞24 h后可见胞内大量颗粒状荧光的聚集,而DC/siRNA-cy3组及裸siRNA-cy3组荧光颗粒较少,这说明VE-DC作为运送siRNA的载体有较高的转染效率(图 5)。
通过蛋白印迹技术及免疫荧光等方法观察到在Huh7.5.1-HCV细胞中,与裸siRNA及DC/siRNA组相比较,VE-DC/siRNA处理组NS3蛋白表达表达显著降低。同样也观察到在Huh7.5.1-core细胞中,与裸siRNA及DC/siRNA组相比较,VE-DC/siRNA处理后core蛋白水平也显著降低(图 6、7)。这些结果提示VE-DC可以作为载体将siRNAs运载至胞内实现对靶基因的有效抑制。
3 讨论
在基因治疗中,寻找安全、高效的载体将siRNA转导入靶细胞,更好地使siRNA发挥作用是RNA技术的关键。目前,基因导入载体主要分为病毒型和非病毒型。病毒型基因载体虽转染效率较高,但具有诱导宿主免疫反应、潜在成瘤性、装载容量有限和代价高等缺点[9]。因此,非病毒基因载体的应用日益受到重视,其中纳米颗粒被认为是很有前景的非病毒基因导入载体。本研究采用维生素E、胆固醇和DOTAP组成新型脂质体纳米颗粒,胆固醇可以提高siRNA在血液中的稳定性和转运效率,而Vitamin E则实现纳米颗粒的肝细胞靶向性。Vitamin E是人体所需营养成分之一,通过结合肝细胞表面特异性受体而转运至肝脏代谢,从而具有肝脏靶向性特点,具有用作靶向载体成分的可能,且其本身对人体无害[10]。脂质体转染是目前广泛应用的非病毒介导的基因转染系统,但是存在显著的缺点,例如, 明显的细胞毒性。故本研究对DC纳米颗粒、VE-DC纳米颗粒和脂质体体外转染基因进行了比较,结果表明新型VE-DC纳米颗粒的细胞毒性明显低于脂质体,转染效率更高,具有良好的siRNA运载能力并实现对靶基因的有效抑制。这些结果说明VE-DC纳米颗粒可以作为一种理想的siRNA转运载体,高效转运siRNA至肝细胞实现抑制靶基因的作用。当然,这些结果是基于体外实验的发现,在今后的工作有必要在建立HCV体内感染模型, 将该纳米载体平台作为HCV治疗载体在体内深入评价其有效性、靶向性及毒性等,为将来是否走向临床应用提供重要依据。
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