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维生素E脂质体纳米颗粒转运siRNA抑制丙型肝炎病毒核心蛋白表达的实验研究
李小平1, 颜艳2, 陈红2, 陈维贤2, 黄英3     
1. 400010 重庆, 重庆医科大学附属第二医院: 科研处;
2. 400010 重庆, 重庆医科大学附属第二医院: 检验科;
3. 400010 重庆, 重庆医科大学附属第二医院: 感染科
[摘要] 目的 研究携带针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)RNA的小干扰RNA(siRNA)的维生素E(Vitamin E)脂质体纳米颗粒在体外靶向抑制HCV复制的作用。方法 采取“薄膜水化法”制备Vitamin E脂质体纳米颗粒,应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的颗粒大小及zeta电位,应用透射电子显微镜观察VE-DC形态及分散性。以Huh7.5.1细胞株作为载体。CCK-8法检测纳米颗粒的细胞毒性,琼脂糖凝胶电泳检测纳米颗粒携带siRNA的血清稳定性,蛋白印迹技术和免疫荧光技术检测该siRNA纳米颗粒的转染效率及对HCV的抑制作用。结果 Vitamin E脂质体纳米颗粒形态呈球形,粒度分布为(125.5±9.0) nm,zeta电位为(39.1±4.8) mV,分散均一。相较同浓度商品化脂质体,VE-DC/siRNA对细胞的毒性相对较小。血清稳定性实验显示,VE-DC/siRNA在24 h后siRNA无降解,较裸siRNA稳定性显著提高。携带siRNA的Vitamin E脂质体纳米颗粒可以较高效率进入Huh7.5.1细胞内,并抑制HCV核心蛋白的表达。结论 Vitamin E脂质体纳米颗粒可以转运siRNA至Huh7.5.1细胞,并抑制HCV核心蛋白的表达。
[关键词] 丙型肝炎     RNA干扰     维生素E     纳米颗粒     靶向治疗    
Vitamin E-coupled nanoparticles-delivered siRNA inhibits expression of hepatitis C virus core protein in vitro
LI Xiaoping1 , YAN Yan2 , CHEN Hong2 , CHEN Weixian2 , HUANG Ying3     
1. Department of Scientific Research Affairs, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China;
2. Department of Laboratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China;
3. Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81171628)
Corresponding author: HUANG Ying, E-mail:418face@163.com
[Abstract] Objective To study the inhibitory effect of small interfering RNAs (siRNAs) targeting hepatitis C virus (HCV) delivered by vitamin E-coupled nanoparticles on the viral replication in vitro. Methods Vitamin E-coupled nanoparticles were prepared by thin-film hydration method. The size and surface charge (zeta potential) of the VE-DC/siRNAs nanoparticles were determined with a laser particle size analyzer. The homogeneity and dispersivity of the nanoparticles were analyzed by transmission electron microscopy. CCK-8 assay was used to assess the cytotoxicity of VE-DC/siRNAs. The stability of the nanoparticles was determined by agarose gel electrophoresis. The transfection efficiency and the inhibition of HCV was analyzed with Western blotting and immunofluorescent staining. Results The VE-DC/siRNAs nanoparticles were in spherical shape and homogeneous distribution, with their size distribution of 125.5±9.0 nm and zeta potential of 39.1±4.8 mV. These nanoparticles were characterized for their lower cytotoxicity and higher stability. The CCK-8 assay data showed that cell viability was higher for VE-DC/siRNAs treated cells than those treated with commercial liposomes at the same concentration. In serum, siRNA was intact in the VE-DC/siRNAs nanoparticles after 24 h, which was degraded in the naked siRNA within 6 h. TheVE-DC/siRNAs nanoparticles were efficiently taken up by hepatoma cells(huh7.5.1-HCV, huh7.5.1-core) observed under fluorescence microscope. Western blot analysis detected decreased levels of HCV nonstructural protein 3 (NS3) and HCV-core protein in the VE-DC/siRNAs treated hepatoma cells. Conclusion Targeted delivery of siRNAs by vitamin E-coupled nanoparticles effectively inhibits HCV replication and core protein production, suggesting that it may potentially use as delivery vehicle for target therapy.
[Key words] hepatitis C     RNA interference     vitamin E     nanoparticle     targeted therapy    

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是导致慢性肝炎重要因素之一,全球有超过1.85亿感染者[1]。持续的HCV感染是导致慢性肝炎、肝硬化,甚至是肝细胞肝癌的重要诱因[2-3]。丙型肝炎的治疗存在耐药突变等问题,RNA干扰技术可能成为HCV基因治疗的有效手段[4-5],但siRNA转运载体和靶向性问题急需解决。维生素E(Vitamin E)可通过结合肝细胞表面特异性受体而转运至肝脏代谢[6]。本研究应用Vitamin E、胆固醇、DOTAP结合的阳离子脂质体合成纳米颗粒,携带针对HCV 5′非翻译区和核心蛋白的siRNA,在细胞模型上验证其靶向抑制HCV表达的效果,这将为RNA干扰技术在HCV基因治疗的临床应用方面提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞株和质粒

Huh7.5.1细胞由本实验室保存;用于构建HCV稳定表达细胞模型的质粒pSGR-JFH1是由日本东京神经研究所Takaji Wakita教授馈赠;用于构建瞬时表达HCV核心蛋白的pCDNA3.1(+)-3FLAG-Core(pCore-3FLAG)质粒由本实验室构建并保存。

1.1.2 主要试剂

高糖DMEM培养基由HyClone公司采购;胎牛血清购自Gibco公司;限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ购于日本TaKaRa公司;Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司;DOTAP购于美国Avanti公司;胆固醇购于美国GENVIEW公司;Vitamin E购于美国SIGMA公司;CCK-8试剂盒购于日本Dojindo公司;所需一抗HCV-NS3、HCV-NS5购于美国Abcam公司,HCV-Core购于美国Santa公司,β-actin购于中国博士德公司;所需二抗均购于中国中衫金桥公司;DAPI购于美国Santa公司;所用siRNA由上海吉玛公司合成。

1.1.3 主要仪器

荧光显微镜成像系统(德国Leica DM4000)、激光粒度分析仪(中国Rise-2008)、透射电子显微镜(日本HITACHI7500)、凝胶电泳成像系统(美国Gel Doc 1000, Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

Huh7.5.1细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。培养基中添加100 U/mL的青霉素和100 U/mL的链霉素。

1.2.2 构建稳定表达

HCV复制子的细胞株Huh7.5.1-HCV用限制性内切酶XbaⅠ处理HCV复制子质粒pSGR-JFH1使之线性化,绿豆核酸酶和蛋白酶K消化处理酶切产物,酚氯仿法抽提纯化DNA。然后以纯化的线性DNA为模板,采用T7体外转录试剂盒进行体外转录,获得采用HCV复制子基因组RNA,按照说明书进行操作。将HCV复制子基因组RNA用转染试剂Lipofectamine 2000转染至Huh7.5.1细胞中,转染后3 d加入G418进行筛选,以获得稳定表达HCV复制子的细胞株,并命名为Huh7.5.1-HCV[7]

1.2.3 免疫荧光验证Huh7.5.1-HCV构建

通过免疫荧光技术检测Huh7.5.1-HCV细胞中HCV非结构蛋白NS3和NS5A的表达情况,鉴定Huh7.5.1-HCV是否筛选成功。用Huh7.5.1-HCV细胞制备24孔板细胞爬片,完全培养基培养24 h后弃掉孔中培养基,用PBS洗3次。加入4%多聚甲醛,37 ℃固定10 min,弃去固定液,PBS洗3次。加入0.1% Triton 37 ℃孵育10 min破膜,弃掉Triton,用PBS洗3次。夹出爬片置于蜡板上,山羊血清37 ℃封闭1 h,PBS洗3次。加入一抗(1:100),4 ℃过夜孵育。第2天拿出蜡板,用PBS洗3次,加入荧光二抗(1:200)37 ℃避光孵育1 h,PBS洗3次。DAPI (1:20)37 ℃避光孵育10 min,PBS洗3次。用防淬灭封片剂封片,立即在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4 瞬时表达HCV core蛋白的细胞株Huh7.5.1-Core的构建及验证

培养Huh7.5.1细胞,接种24孔板,待细胞60%~70%汇合度时以脂质体Lipofectamine 2000转染质粒pCore-3FLAG至细胞内。转染后48 h后,通过免疫荧光技术检测HCV核心蛋白的表达情况。

1.2.5 siRNA的序列

实验中所用siRNA正向序列为siRNA-NS5A: 5′-UCAAGCUAGCGGCUUCCAAdTdT-3′和siRNA-core:5′-GGUUGGUGUUACGUUUGGUd-TdT-3′。分别合成正反向序列退火形成双链后-80 ℃备用。

1.2.6 纳米颗粒VE-DC的制备及鉴定

应用胆固醇和DOTAP通过薄膜水化法制备纳米颗粒DC[8],将DOTAP与胆固醇按照等摩尔比例溶于10 mL氯仿中,在40 ℃用全真空减压旋转去除有机溶剂形成一层均匀薄膜。再加入10 mL氯仿和3 mL PBS混合均匀后,超声振荡100 W,30 ℃,2 min形成均匀混合物。将混合物在40 ℃半真空条件下旋转形成凝胶状,加入7 mL PBS。将凝胶在40 ℃常压旋转30 min,形成均匀状物质即纳米颗粒DC。DC在4 ℃条件下与Vitamin E按照摩尔比例1:2过夜孵育形成纳米颗粒VE-DC。将VE-DC与siRNA按照1:1的摩尔比例在37 ℃孵育10 min,形成VE-DC/siRNA复合物。应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的粒度分布和zeta电位,应用透射电子显微镜观察VE-DC形态及分散性。

1.2.7 细胞毒性实验(CCK-8实验)

采用CCK-8实验检测纳米颗粒VE-DC对Huh7.5.1的细胞毒性。将Huh7.5.1按照5 000个/孔接种于96孔板,分别加入0、20、40、60、80、100、200、400 nmol/L的纳米颗粒VE-DC及商品化脂质体Liposome 2000,孵育36 h后加入CCK-8试剂100 μL,孵育2 h,使用酶标仪测定吸光度,计算细胞相对活力。

1.2.8 血清稳定性测定

在37 ℃条件下,将裸siRNA、DC/siRNA、VE-DC/siRNA分别加入50%的人血清中,然后分别孵育不同时间:0、3、6、12、24、48、72、96 h,样本用2%的凝胶进行分离,使用凝胶电泳成像仪分析其稳定性。

1.2.9 验证纳米颗粒VE-DC/siRNAs的有效性

通过荧光显微镜观察经VE-DC/siRNA-cy3(40 nmol/L)、DC/siRNA-cy3(40 nmol/L)、lipofectamine/siRNA-cy3(40 nmol/L)处理的Huh7.5.1-HCV、Huh7.5.1-core,检测VE-DC/siRNA的入胞情况。

通过蛋白印迹技术及免疫荧光等方法检测经VE-DC/siRNA(siRNA-5A,40 nmol/L)、DC/siRNA(siRNA-5A,40 nmol/L)、lipofectamine/siRNA(siRNA-5A,40 nmol/L)分别处理后,NS3蛋白(处理48 h)的表达量来验证其有效性。同时用VE-DC/siRNA(siRNA-Core, 40 nmol/L)、DC/siRNA(siRNA-Core,40 nmol/L)、lipofectamine/siRNA(siRNA-Core, 40 nmol/L)分别处理Huh7.5.1-Core细胞后通过蛋白印迹技术及免疫荧光等方法检测Core水平进一步验证VE-DC/siRNAs的有效性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析,组间差异比较采用t检验和单因素方差分析。

2 结果 2.1 稳定表达HCV亚基因组复制子的细胞株Huh7.5.1-HCV构建成功

HCV复制子结构见图 1A。HCV复制子基因组RNA转染Huh7.5.1细胞并进行筛选获得稳定细胞株,通过免疫荧光技术检测Huh7.5.1-HCV细胞中HCV非结构蛋白NS3和NS5A的表达,鉴定Huh7.5.1-HCV筛选成功(图 1B)。

A:HCV复制子结构示意图;B:免疫荧光检测HCV NS3和NS5A 图 1 HCV复制子细胞株的构建

2.2 瞬时表达HCV core蛋白的细胞株Huh7.5.1-Core构建成功

HCV核心蛋白真核表达质粒结构见图 2A,转染后通过免疫荧光技术可检测到HCV7.5.1-Core中core蛋白的表达,提示该细胞株构建成功(图 2B)。

A:HCV核心蛋白质粒结构示意图;B:免疫荧光检测HCV核心蛋白 图 2 HCV核心蛋白真核表达的鉴定

2.3 纳米颗粒VE-DC/siRNA粒度分布、zeta电位及形态的测定

VE-DC纳米颗粒结构见图 3A。在37 ℃条件下,应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的粒度分布和zeta电位。DC/siRNA粒度分布为(118.0±7.7) nm,zeta电位为(40.6±3.4) mV;VE-DC/siRNA的粒度分布为(125.5±9.0) nm,zeta电位(39.1±4.8) mV。透射电子显微镜结果显示VE-DC/siRNA形态是球形,分散性均一(图 3B),其大小与激光粒度测量仪测量结果吻合。

A:VE-DC纳米颗粒结构示意图;B:透射电子显微镜VE-DC/siRNA形态,Δ:示VE-DC/siRNA纳米颗粒 图 3 纳米颗粒VE-DC/siRNA粒度分布,Zeta电位及形态测定

2.4 CCK-8实验检测纳米颗粒VE-DC/siRNA的细胞毒性

用VE-DC/siRNA处理的Huh7.5.1的细胞活力显著高于用商品化的脂质体处理,如浓度为100 nmol/L的商品化脂质体处理时,细胞存活率下降了45%。相反,浓度为100 nmol/L纳米颗粒VE-DC/siRNA处理组细胞存活率较高,甚至在200 nmol/L VE-DC/siRNA时,也表现出低细胞毒性(表 1)。这些结果提示纳米颗粒VE-DC/siRNA的细胞的毒性相对较小。

表 1 CKK-8实验检测不同浓度纳米颗粒VE-DC/siRNA处理后的细胞毒性(%, n=3)
组别0 ng/mL20 ng/mL40 ng/mL60 ng/mL80 ng/mL100 ng/mL200 ng/mL400 ng/mL
空白组100100100100100100100100
DC/siRNA100101959391a8886b82b
VE-DC/siRNA100100959290a8985b83b
Liposome/siRNA100999088a78b55b54b36b
a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与空白组比较

2.5 血清稳定性测定

与血清孵育24 h后,DC/siRNA或VE-DC/siRNA组仍有完好的siRNA存在,而裸siRNA在6 h之后已经全部降解(图 4)。这表明,纳米颗粒VE-DC可以作为合适的载体对siRNAs进行转运。

1~8:分别指与血清孵育0、3、6、12、24、48、72、96 h 图 4 凝胶电泳检测纳米颗粒VE-DC/siRNA的血清稳定性

2.6 验证纳米颗粒VE-DC/siRNAs的有效性

通过荧光显微镜观察VE-DC/siRNAs的入胞情况。用VE-DC/siRNA-cy3分别处理Huh7.5.1-HCV和Huh7.5.1-core细胞24 h后可见胞内大量颗粒状荧光的聚集,而DC/siRNA-cy3组及裸siRNA-cy3组荧光颗粒较少,这说明VE-DC作为运送siRNA的载体有较高的转染效率(图 5)。

图 5 DAPI染色细胞核后荧光显微镜观察VE-DC/siRNA-cy3在两种细胞的入胞情况

通过蛋白印迹技术及免疫荧光等方法观察到在Huh7.5.1-HCV细胞中,与裸siRNA及DC/siRNA组相比较,VE-DC/siRNA处理组NS3蛋白表达表达显著降低。同样也观察到在Huh7.5.1-core细胞中,与裸siRNA及DC/siRNA组相比较,VE-DC/siRNA处理后core蛋白水平也显著降低(图 67)。这些结果提示VE-DC可以作为载体将siRNAs运载至胞内实现对靶基因的有效抑制。

图 6 免疫荧光检测VE-DC/siRNA处理两种细胞后蛋白表达

A:Huh7.5.1-HCV细胞NS3蛋白;B:Huh7.5.1-Core细胞核心蛋白1:空白对照;2:裸siRNA;3:DC/siRNA;4:VE-DC/siRNA;5:Liposome/siRNA 图 7 蛋白印迹技术检测VE-DC/siRNA处理细胞后蛋白的表达

3 讨论

在基因治疗中,寻找安全、高效的载体将siRNA转导入靶细胞,更好地使siRNA发挥作用是RNA技术的关键。目前,基因导入载体主要分为病毒型和非病毒型。病毒型基因载体虽转染效率较高,但具有诱导宿主免疫反应、潜在成瘤性、装载容量有限和代价高等缺点[9]。因此,非病毒基因载体的应用日益受到重视,其中纳米颗粒被认为是很有前景的非病毒基因导入载体。本研究采用维生素E、胆固醇和DOTAP组成新型脂质体纳米颗粒,胆固醇可以提高siRNA在血液中的稳定性和转运效率,而Vitamin E则实现纳米颗粒的肝细胞靶向性。Vitamin E是人体所需营养成分之一,通过结合肝细胞表面特异性受体而转运至肝脏代谢,从而具有肝脏靶向性特点,具有用作靶向载体成分的可能,且其本身对人体无害[10]。脂质体转染是目前广泛应用的非病毒介导的基因转染系统,但是存在显著的缺点,例如, 明显的细胞毒性。故本研究对DC纳米颗粒、VE-DC纳米颗粒和脂质体体外转染基因进行了比较,结果表明新型VE-DC纳米颗粒的细胞毒性明显低于脂质体,转染效率更高,具有良好的siRNA运载能力并实现对靶基因的有效抑制。这些结果说明VE-DC纳米颗粒可以作为一种理想的siRNA转运载体,高效转运siRNA至肝细胞实现抑制靶基因的作用。当然,这些结果是基于体外实验的发现,在今后的工作有必要在建立HCV体内感染模型, 将该纳米载体平台作为HCV治疗载体在体内深入评价其有效性、靶向性及毒性等,为将来是否走向临床应用提供重要依据。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201705123
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
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文章信息

李小平, 颜艳, 陈红, 陈维贤, 黄英.
LI Xiaoping, YAN Yan, CHEN Hong, CHEN Weixian, HUANG Ying.
维生素E脂质体纳米颗粒转运siRNA抑制丙型肝炎病毒核心蛋白表达的实验研究
Vitamin E-coupled nanoparticles-delivered siRNA inhibits expression of hepatitis C virus core protein in vitro
第三军医大学学报, 2017, 39(20): 1980-1985
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(20): 1980-1985
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201705123

文章历史

收稿: 2017-05-31
修回: 2017-07-18

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