2. 400042 重庆, 第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室, 创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;
3. 400037 重庆, 第三军医大学新桥医院: 中心实验室;
4. 400037 重庆, 第三军医大学新桥医院: 中西医结合科
2. State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Department 1, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China;
3. Laboratory Center, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037;
4. Department of Integrated Chinese and Western Medicine, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037
Mibefradil,作为一种钙离子拮抗剂,兼具有T型钙通道和L型钙通道抑制作用,只是对T型钙通道的选择性比对L型钙通道高30-50倍,往往被作为T型钙通道拮抗剂[1]。T型电压门控钙通道与L型电压门控钙通道不同,其具有低电压、失活速度快、单通道电导小的特点,是唯一的低电压依赖性钙通道,由1G (Cav3.1)、1H(Cav3.2)、1I(Cav3.3) 等3种亚单位组成[2]。1G(Cav3.1)、1H(Cav3.2) 在心肌、神经元、血管平滑肌细胞和内分泌腺体细胞、肝脏等广泛分布,1I(Cav3.3) 只在神经细胞中表达[3]。研究发现[4],钙离子拮抗剂Mibefradil在显著改善糖尿病db/db小鼠高胰岛素血症的同时降低了高血糖,而对正常小鼠血糖无明显影响,但其具体降糖机制不明。
本实验以人的肝胚胎瘤细胞——HepG2细胞作为研究对象,用0.25 mmol/L的棕榈酸盐(palmitate,PA)诱导HepG2细胞成为胰岛素抵抗模型[5-6],初步探索Mibefradil对FoxO1的影响及Mibefradil改善胰岛素抵抗、降低血糖的机制。
1 材料与方法 1.1 实验试剂与器材HepG2细胞购自中科院上海细胞库,高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美国),胎牛血清(四季青,中国浙江天杭生物科技有限公司),脱脂胎牛血清白蛋白、棕榈酸盐(Solarbio,北京索莱宝生物科技有限公司),Mibefradil(Sigma-Aldrich,美国)溶解于DMSO中保存,糖原检测试剂盒(Biovision,美国),总RNA提取试剂盒RNAiso Plus、Prime ScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa,日本),FoxO1、G6Pase、PEPCK引物序列由Invitrogen设计、合成,序列见表 1。葡萄糖检测试盒、抗PEPCK兔多克隆抗体(Abcam,美国),抗FoxO1兔多克隆抗体(CST,美国),抗G6Pase鼠单克隆抗体(Santa Cruz,美国),抗β-actin兔多克隆抗体(Proteintech,美国),辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgM二抗(武汉博士德生物技术有限公司),辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司),ECL化学发光显影剂(Thermo,美国)。
目的基因 | 上游引物序列 | 上游引物序列 | 扩增片段(bp) |
FoxO1 | 5′-TCGTCATAATCTGTCCCTACACA-3′ | 5′-CGGCTTCGGCTCTTAGCAAA-3′ | 168 |
PEPCK | 5′-GCAAGACGGTTATCGTCACCC-3′ | 5′-GGCATTGAACGCTTTCTCAAAAT-3′ | 116 |
G6Pase | 5′-GTGTCCGTGATCGCAGACC-3′ | 5′-GACGAGGTTGAGCCAGTCTC-3′ | 126 |
β-actin | 5′-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′ | 5′-GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′ | 157 |
1.2 实验方法 1.2.1 HepG2细胞的培养及分组
复苏在液氮罐中冻存的HepG2细胞,置于含10%胎牛血清,1%青-链霉素的高糖DMEM培养基中,于37 ℃,5%CO2的恒温箱进行培养,当细胞贴壁生长融合至70%~80%时用0.25%胰酶进行消化、传代并分组(n=3):① 对照组:正常无血清高糖DMEM培养基;② 棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组:在正常无血清高糖DMEM培养基基础上,加入棕榈酸盐,使棕榈酸盐终浓度为0.25 mmol/L;③ 药物溶剂组:在棕榈酸盐诱导HepG2细胞成为胰岛素抵抗模型的基础上,同时加入DMSO,保证DMSO的体积分数小于0.1%;④ 低剂量Mibefradil组:在棕榈酸盐诱导HepG2细胞成为胰岛素抵抗模型的基础上,同时加入Mibefradil,使Mibefradil终浓度为0.025 μmol/L;⑤ 高剂量Mibefradil组:在棕榈酸盐诱导HepG2细胞成为胰岛素抵抗模型的基础上,同时加入Mibefradil,使Mibefradil终浓度为0.05 μmol/L;于37 ℃,5%CO2的恒温箱中培养24 h。
1.2.2 棕榈酸盐溶液的配制称取16.704 6 mg的棕榈酸盐于5 mL EP管中,加入1 mL超纯水,在70 ℃水浴中均匀摇动,使其完全溶解至溶液变澄清,制备成60 mmol/L的棕榈酸盐溶液。同时配制10%脱脂胎牛血清白蛋白溶液,55 ℃水浴助溶。将上述配制好的溶液按比例混合,制备成浓度为6 mmol/L的棕榈酸盐溶液,55 ℃水浴助溶。冷却至室温后,过滤除菌,-20 ℃保存。用前55 ℃水浴15 min使其溶解,然后冷却至室温后使用。
1.2.3 糖原合成检测按1.2.1步骤中的操作方法处理细胞,24 h后各组细胞用0.25%胰酶消化,再用等体积高糖DMEM培养基中和,移入10 mL离心管中离心(4 ℃,200×g,5 min),用1×PBS缓冲液洗2次,最后一次用1×PBS缓冲液重悬后对各组细胞进行计数,再次离心(4 ℃,200×g,5 min)后,尽量吸净PBS,加入预冷的Glycogen Hydrolysis Buffer裂解细胞10 min。按照试剂盒说明书配制标准曲线,加入反应物,每组3个复孔,在37 ℃孵箱中孵育30 min,最后用酶标仪测量450 nm处的吸光度值,运用标准曲线得到样品的糖原含量。
1.2.4 葡萄糖消耗检测5组细胞加药处理24 h后,用无酶枪头吸取各组培养基1 mL,分别装在5个无菌无酶的EP管中,4 ℃条件下,200×g离心5 min。每组培养基样品3个副孔,每个副孔体积为1 μL,并用Glucose Assay Buffer调平至50 μL。按照试剂说明书配制标准曲线,并加入反应物,在37 ℃孵箱中避光孵育30 min,用酶标仪检测579 nm处的吸光度值,通过标准曲线计算样品的葡萄糖浓度,并用高糖DMEM培养基葡萄糖浓度减去测得样品的葡萄糖浓度即为葡萄糖消耗浓度。与此同时,用Western及IP细胞裂解液裂解每组细胞,然后参照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书对细胞蛋白浓度进行测定。
1.2.5 细胞内糖原染色在六孔板中放入爬片后,将HepG2细胞胺2×104/mL接种于6孔板内,正常培养基补足溶液体积为3 mL,待细胞长至50%~70%,分组培养细胞,于37 ℃,5%CO2的恒温箱中培养24 h。在相应时间点,从培养箱中取出六孔板,用1×PBS缓冲液洗2次,再用Carnoy固定液(由纯乙醇、冰醋酸、氯仿按体积比6:1:3制成)固定细胞30 min,用1×PBS缓冲液清洗3次,每次10 min。之后按照碘酸雪夫染色法(PAS法)对细胞进行染色。
1.2.6 qRT-PCR检测FoxO1、G6Pase、PEPCK基因相对表达将细胞传至六孔板中,待细胞融合面积为80%~90%后,按1.2.1中的分组加药处理24 h,在相应时间点,根据TRIzol提取RNA的方法依次加入氯仿、异丙醇、75%乙醇提取RNA,测D值确定RNA浓度,D(260)/D(280) 在1.8~2.2。然后根据TaKaRa公司的Prime ScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser说明书要求,以总RNA为模板先去除基因组DNA,再逆转录为cDNA片段。最后以cDNA为模板,分别加入FoxO1、PEPCK、G6Pase、β-actin的特异性引物(序列见表 1),按照试剂盒说明书操作方法进行扩增。用2-△△Ct法计算相对表达量。所有实验重复3次。
1.2.7 Western blot检测FoxO1、G6Pase、PEPCK蛋白表达水平将HepG2细胞按照1.2.1中的分组进行处理后,用Western blot检测FoxO1、G6Pase、PEPCK蛋白表达水平。将收集的细胞样本依次提取蛋白、上样、电泳、转膜,以含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1~2 h,一抗采用抗PEPCK兔多克隆抗体,抗FoxO1兔多克隆抗体,抗G6Pase鼠单克隆抗体,抗β-actin兔多克隆抗体,于4 ℃孵育过夜,二抗37 ℃ 2 h,ECL显影。用Image J软件对各个条带的灰度值进行半定量分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件,计量资料以x± s表示,进行单因素方差分析。
2 结果 2.1 HepG2细胞的体外培养在倒置显微镜下观察HepG2细胞形态,HepG2细胞贴壁生长,形态呈梭形(图 1A)。加入棕榈酸盐诱导成为胰岛素抵抗模型后,部分细胞变圆、折光性增强(图 1B)。加入Mibefradil干预后的细胞形态学变化与棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组一致(图 1C),表明棕榈酸盐对HepG2细胞有损伤作用,Mibefradil不能逆转这种损伤。
2.2 Mibefradil对胰岛素抵抗HepG2细胞糖原合成及葡萄糖消耗的影响
与对照组相比,模型组与药物溶剂组的细胞糖原含量及葡萄糖消耗明显降低(P < 0.01);经Mibefradil干预后,细胞内糖原含量、葡萄糖消耗较模型组明显增加(P < 0.01),且高剂量组的糖原合成量、葡萄糖消耗明显高于低剂量组(P < 0.01)。结果见表 2。用碘酸雪夫染色法(PAS法)对细胞进行染色后,在倒置显微镜下观察细胞内糖原染色情况,如图 2所示。与对照组比较,棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组HepG2细胞内糖原染色变浅,表明糖原合成减少。经Mibefradil干预后,HepG2细胞内糖原染色加深,表明细胞内糖原合成增加。
组别 | 细胞糖原合成(μg/μL)d | 细胞葡萄糖消耗(nmol/μg)e |
对照组 | 9.14±0.33 | 5.87±2.26 |
棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组 | 3.28±0.74a | 1.31±0.49a |
药物溶剂组 | 2.77±0.98a | 1.53±0.73a |
低剂量Mibefradil组 | 5.73±0.16b | 5.61±0.29b |
高剂量Mibefradil组 | 7.09±0.60bc | 6.45±0.02bc |
a:P < 0.01,与对照组比较;b:P < 0.05,与棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组比较;c:P < 0.05,与低剂量Mibefradil组比较;d:各组细胞经计数板计数后,达到106个数量级;e:各组细胞用Western及IP细胞裂解液充分裂解后,用BCA法检测各组细胞的蛋白浓度,用于调平各组的葡萄糖消耗量 |
2.3 Mibefradil对胰岛素抵抗HepG2细胞的FoxO1、G6Pase、PEPCK基因表达的影响
在棕榈酸盐诱导下的HepG2细胞的FoxO1、G6Pase、PEPCK基因相对表达量较对照组明显增加(P < 0.01);Mibefradil干预后,FoxO1、G6Pase、PEPCK基因相对表达量较模型组及药物溶剂组明显下降(P < 0.01),且高剂量组与低剂量组之间的基因相对表达量也有统计学差异(P < 0.05)。结果见表 3。
对照组 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组 | 3.54±0.46a | 5.73±1.75a | 3.54±0.48a |
药物溶剂组 | 3.71±0.55 | 5.33±1.26 | 4.69±0.88 |
低剂量Mibefradil组 | 2.07±0.42b | 2.63±0.05b | 3.24±1.14b |
高剂量Mibefradil组 | 1.19±0.30c | 2.44±0.32c | 1.61±1.33c |
a:P < 0.01,与对照组比较;b:P < 0.05,与棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组比较;c:P < 0.05,与低剂量Mibefradil组比较 |
2.4 Mibefradil对胰岛素抵抗HepG2细胞的FoxO1、G6Pase、PEPCK蛋白表达量的影响
经棕榈酸盐诱导后,HepG2细胞的FoxO1、G6Pase、PEPCK蛋白表达量较对照组增加;Mibefradil干预后,FoxO1、G6Pase、PEPCK蛋白表达量较模型组及药物溶剂组明显下降,且高剂量组与低剂量Mibefradil组的蛋白表达量呈剂量依赖性下降。结果见图 3、表 4。
组别 | FoxO1 | G6Pase | PEPCK |
对照组 | 0.67±0.07 | 0.14±0.04 | 0.73±0.02 |
棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组 | 0.80±0.05a | 0.20±0.01a | 0.97±0.04a |
药物溶剂组 | 0.75±0.06 | 0.18±0.01 | 0.89±0.03 |
低剂量Mibefradil组 | 0.55±0.03b | 0.12±0.01b | 0.76±0.03b |
高剂量Mibefradil组 | 0.35±0.01c | 0.07±0.02d | 0.30±0.01c |
a:P < 0.01,与对照组比较;b:P < 0.05,与棕榈酸盐诱导的胰岛素抵抗模型组比较;c:P < 0.01,d:P < 0.05,与低剂量Mibefradil组比较 |
3 讨论
高血糖(hyperglycemia)和胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是2型糖尿病的两大主要特征,其中IR是由于胰岛素绝对和(或)相对不足,导致各胰岛素的靶器官(如:肝脏、骨骼肌)利用葡萄糖的能力下降。生理条件下,肝脏在机体血糖调节过程中发挥枢纽的角色。一方面,在饥饿状态或延长空腹的情况下,肝脏通过糖异生、糖原分解以提供机体所需的葡萄糖;另一方面,在进食后,机体胰岛素分泌量增加,肝脏通过糖原合成、糖酵解以调控血糖的储存和摄取[7],从而维持餐后血糖水平。然而,2型糖尿病模型所共有的特征是肝脏的葡萄糖输出增加,表现为糖异生、糖原分解过程亢进,糖原合成、糖酵解相对缓慢。有研究[8]表明,这是由于与此过程相关的限速酶基因,即:磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸激酶(G6Pase)的表达上调所致。
肝脏是维持血糖稳态的重要器官,而内源性转录因子-FoxO1蛋白在肝脏调节血糖过程中发挥重要的角色。FoxO1蛋白属于forkhead/winged ɑ-螺旋转录因子O家族(FoxO)中的一员,是第一个被鉴定为胰岛素信号传递过程中Akt的底物[9]。FoxO1蛋白有3个Akt磷酸化位点,即:苏氨酸24位点(T24)、丝氨酸256位点(S256) 与丝氨酸319位点(S319)。在进食状态下,胰岛素信号通路被激活,Akt调节FoxO1蛋白分子中3个保守的氨基酸位点(T24、S256、S319) 发生磷酸化,导致FoxO1蛋白与14-3-3结合并发生核外排,继而肝脏糖原分解、糖异生被抑制;相反地,在空腹状态下,FoxO1蛋白活化并始终定位于细胞核,并与其DNA结合位点上的胰岛素反应元件(insulin response element,IRE:CAAAACAA)相互作用,导致G6Pase、PEPCK基因的转录,并增加葡萄糖的合成[10-11]。当机体发生糖尿病时,Akt失活,FoxO1主要以活化的形式存在于细胞核内,导致肝脏葡萄糖输出增加,因此诱导糖尿病的发生、进展。已有研究发现,敲除或干扰肝脏中的FoxO1后,能显著降低2型糖尿病小鼠的血糖水平,改善其胰岛素抵抗[12-14],表明FoxO1与肝脏的葡萄糖输出紧密联系。而Mibefradil能否阻止FoxO1蛋白核转位或者降低FoxO1的表达,从而抑制肝脏糖代谢紊乱至今仍不清楚。
研究表明T型钙通道通过增强全细胞兴奋性有利于大鼠胰岛素瘤细胞株INS-1细胞胰岛素释放[15],Mibefradil可通过下调胰岛细胞T型钙通道Cav3.1、Cav3.2亚基表达抑制高糖作用下INS-1细胞胰岛素分泌[16]。本研究发现,Mibefradil增加棕榈酸盐诱导的HepG2细胞糖原的合成及葡萄糖消耗,改善其胰岛素抵抗。进一步我们发现Mibefradil降低FoxO1基因及其靶基因G6Pase、PEPCK的表达,因此我们大胆推测Mibefradil通过FoxO1-G6Pase、PEPCK通路发挥作用,最终减少肝细胞葡萄糖的输出,这与我们前期体内实验发现Mibefradil能显著改善糖尿病db/db小鼠高胰岛素血症、降低高血糖的结论一致[4]。
糖尿病模型的胰腺、肝脏、脑组织等存在细胞内钙离子紊乱,说明糖尿病血糖升高可能与胞内钙离子紊乱有关[17],而胞内钙离子浓度升高可以激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin dependent kinase Ⅱ,CaMKⅡ)。研究报道在空腹或肥胖情况下,肝糖输出增加与钙信号通路激发的CaMKⅡ的活性上升有关,CaMKⅡ的活性激活后可以增强转录因子FoxO1的核转位,从而加强肝糖的输出[18]。那么,Mibefradil是否能通过阻滞肝细胞钙离子缓慢内流,抑制CaMKⅡ的活性,阻止FoxO1核转位,从而抑制肝脏糖代谢紊乱至今仍不清楚。下一步,我们将针对CaMKⅡ-FoxO1通路探索Mibefradil的降糖机制,通过对此通路的深入研究以拓展我们对于糖尿病发病机制的了解,并可能为糖尿病的防治提供新的思路。
综上所述,Mibefradil能改善棕榈酸盐诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗,初步推测可能与降低FoxO1表达有关,但具体机制较复杂,仍须进一步探索其改善胰岛素抵抗的分子机制。
[1] | PEREZ-REYES E. Molecular physiology of low-voltage-activated T-type calcium channels[J]. Physiol Rev, 2003, 83(1): 117–161. DOI:10.1152/physrev.00018.2002 |
[2] | MASSIE B M. Mibefradil: a selective T-type calcium antagonist[J]. Am J Cardiol, 1997, 80(9A): 231–321. DOI:10.1016/S0002-9149(97)00791-1 |
[3] | IMOTO K, KUMATANI S, OKADA M. Endostatin is protective against monocrotaline-induced right heart disease through the inhibition of T-type Ca2+ channel[J]. Pflügers Arch, 2016, 468(7): 1–12. DOI:10.1007/s00424-016-1810-0 |
[4] | LU Y, LONG M, ZHOU S, et al. Mibefradil reduces blood glucose concentration in db/db mice[J]. Clinics, 2014, 69(1): 61–67. DOI:10.6061/clinics/2014(01)09 |
[5] | LIU T Y, SHI C X, GAO R, et al. Irisin inhibits hepatic gluconeogenesis and increases glycogen synthesis via the PI3K/Aktpathway in type 2 diabetic mice and hepatocytes[J]. Cli Sci(Lond), 2015, 129(10): 839–850. DOI:10.1042/CS20150009 |
[6] | WEI S N, ZHANG M, YU Y, et al. Berberine attenuates development of the hepatic gluconeogenesis and lipid metabolism disorder in type 2 diabetic mice and in palmitate-incubated HepG2 cells through suppression of the HNF-4ɑ miR122[J]. PLoS ONE, 2016, 11(3): e0152097. DOI:10.1371/journal.pone.0152097 |
[7] | OH K J, HAN H S, KIM M J, et al. Transcriptional regulators of hepatic gluconeogenesis[J]. Arch Pharm Res, 2013, 36(2): 189–200. DOI:10.1007/s12272-013-0018-5 |
[8] | YADAV H, DEVALARAJA S, CHUNG ST, et al. TGF-β1/Smad3 pathway targets PP2A-AMPK-FoxO1 to regulate hepatic gluconeogenesis[J]. J Biol Chem, 2017, 292(8): 3420–3432. DOI:10.1074/jbc.M116.764910 |
[9] | GUO S. Molecular basis of insulin resistance: The role of IRS and foxo1 in the control of diabetes mellitus and its complications[J]. Drug Discov Today Dis Mech, 2013, 10(1-2): e27–e33. DOI:10.1016/j.ddmec.2013.06.003 |
[10] | RAJAN M R, NYMAN E, KJØLHEDE P, et al. systems-wide experimental and modeling analysis of insulin signaling through forkhead box protein O1 (FOXO1) in human adipocytes, Normally and in type 2 diabetes[J]. JBC, 2016, 291(30): 15806–15819. DOI:10.1074/jbc.M116.715763 |
[11] | ZHU X, WU Y B, ZHOU J, et al. Upregulation of lncRNA MEG3 promotes hepatic insulin resistance via increasing FoxO1 expression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 469(2): 319–325. DOI:10.1016/j.bbrc.2015.11.048 |
[12] | ZHANG K, LI L, QI Y, et al. Hepatic suppression of Foxo1 and Foxo3 causes hypoglycemia and hyperlipidemia in mice[J]. Endocrinology, 2012, 153(2): 631–646. DOI:10.1210/en.2011-1527 |
[13] | HAEUSLER R A, KAESTNER K H, ACCILI D. FoxOs function synergistically to promote glucose production[J]. J Biol Chem, 2010, 285(46): 35245–35248. DOI:10.1074/jbc.C110.175851 |
[14] | ALTOMONTE J, RICHTER A, HARBARAN S, et al. Inhibition of Foxo1 function is associated with improved fasting glycemia in diabetic mice[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2003, 285(4): E718–E728. DOI:10.1152/ajpendo.00156.2003 |
[15] | BHATTACHARJEE A, WHITEHURST R M J R, ZHANG M, et al. T-type calcium channels facilitate insulin secretion by enhancing general excitability in the insulin-secreting beta-cell line, INS-1[J]. Endocrinology, 1997, 138(9): 3735–3740. DOI:10.1210/endo.138.9.5390 |
[16] |
游成姗, 严军, 李明, 等. Mibefradil抑制高糖诱导的胰岛素分泌作用及其机制的初步研究[J].
第三军医大学学报, 2015, 37(7): 660–665.
YOU C S, YAN J, LI M, et al. Mibefradil suppresses insulin secretion of high glucose-induced islet cells by down-regulating cav3.1 and cav3.2[J]. J Third Mil Med Univ, 2015, 37(7): 660–665. DOI:10.16016/j.1000-5404.201410175 |
[17] | MILARDI D, SIACCA M F, RANDAZZO L, et al. The Role of Calcium, Lipid Membranes and Islet Amyloid Polypeptide in the Onset of Type 2 Diabetes: Innocent Bystanders or Partners in a Crime?[J]. Front Endocrinol, 2014, 5(5): 216. DOI:10.3389/fendo.2014.00216 |
[18] | OZCAN L, WONG C C, LI G, et al. Calcium signaling through CaMKⅡ regulates hepatic glucose production in fasting and obesity[J]. Cell Metab, 2012, 15(5): 739–751. DOI:10.1016/j.cmet.2012.03.002 |