LONG Min, E-mail:longmin_casper@163.com
糖尿病溃疡(diabetic ulcers, DUs)经久不愈, 最终导致截肢, 是糖尿病患者致残、致死的并发症之一, 严重影响患者的生活质量[1]。因此, 探索有效的干预措施是治疗DUs的关键, 既能减少经济损失又能改善患者的预后。目前关于DUs的治疗包括清创、减压、人工皮肤移植、生长因子的干预等, 但是上述治疗效果并不理想, 仍有14%~20%的DUs患者持续进展最终导致截肢[2-3]。因此, 寻找安全有效的针对性治疗措施是现今DUs治疗的迫切需求。
新近研究表明氧化应激在创口愈合的发生发展中起关键作用[4],核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor, Nrf2) 通路是体内重要的抗氧化应激防御通路[5]。本课题组及其他课题组发现,激活Nrf2通路可以改善DUs愈合[6-7]。近来研究发现腹腔注射Nrf2的激动剂——肉桂醛(cinnamic aldehyde, CA)可以改善糖尿病小鼠创口愈合。进一步研究发现CA可以促进人皮肤角质细胞[6]和成纤维细胞[8]迁移,并且减少细胞内的活性氧堆积, 缓解氧化应激损伤。
目前CA应用于DUs的治疗主要以腹腔注射的方式[6], 然而这种方式并非临床DUs的最佳治疗措施。聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种无毒的生物惰性物质, 无刺激性, 具有良好的水溶性、保湿性, 可用于配制医用药膏、药霜、栓剂等基质, 在化妆品、制药中均有广泛应用。PEG400作为一种黏稠液体[9],近来研究表明, Nrf2的激动剂莱菔硫烷(sulforaphane, SF)可溶于PEG400中, 安全可靠, 药效稳定,可望用于预防紫外线引发的皮肤癌变等[10-11]。鉴于CA的一般性状与SF类似, 我们配制了添加CA的PEG400凝胶, 以观察局部外用CA对DUs的疗效并进一步探讨其可能机制。
1 材料与方法 1.1 主要材料和试剂链脲霉素(streptozotocin, STZ)、CA均购买于Sigma公司(St. Louis, MO); 柠檬酸(重庆川东化工),柠檬酸三钠(成都市科龙化工),生理盐水, 小鼠血糖监测(Abbott Laboratory, North Chicago, IL), 抗体Nrf2、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1) 及结合辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)购自Santa Cruz公司; 抗-8-羟基脱氧鸟核苷(anti-8-dihydro-2-deoxyguanosine, 8-oxo-dG)抗体购自Trevigen公司(Gaithersburg, MD); HE染色试剂盒(Vector laboratory, Burlingame, CA); 免疫组化染色(immunohistochemistry, IHC)HRP-DAB试剂盒套件购自DAKO公司(North America, CA)。
1.2 实验动物与分组健康8周龄的Nrf2+/+和Nrf2-/-雄性SKH-1无毛小鼠各8只, 由美国亚利桑那大学药学院张教授馈赠。普通动物房喂养, 体质量25~30 g,随机数字表法分为:① Nrf2+/+鼠对照组(Nrf2+/+ Veh组); ② Nrf2+/+鼠CA治疗组(Nrf2+/+ CA组); ③ Nrf2-/-鼠Veh组(Nrf2-/- Veh组); ④ Nrf2-/-鼠CA组(Nrf2-/- CA组), 每组4只。
1.3 糖尿病小鼠模型的建立采用小剂量STZ连续腹腔注射5 d诱导糖尿病小鼠动物模型[12],具体过程如下所述:注射STZ前小鼠禁食4 h,注射时将STZ避光充分溶解于现配的浓度为0.1 mol/L,pH=4.3过滤灭菌的柠檬酸钠缓冲液中,以50 mg/kg的剂量腹腔注射,连续5 d。在STZ注射前及注射后第4周,禁食4 h,采用AlphaTRAK系统检测小鼠空腹血糖水平(fasting glucose levels, FGL), FGL>250 mg/dL的小鼠视为糖尿病模型诱导成功,纳入实验。
1.4 小鼠创口模型建立STZ注射4周后, 采用皮肤活检钳(Health link, Jacksonville, FL)在小鼠背部建立2个直径为6 mm的创口, 并覆盖透气胶膜贴(3M Tegaderm pads)。术后当日开始在Veh组小鼠创口局部应用20 μL PEG400(Vehicle, Veh), CA组局部应用20 μL含4 μmol/L CA的PEG400凝胶, 每隔1天干预直至第14天,监测各组小鼠血糖并收集创缘处皮肤做进一步检测。
1.5 实时监测各组糖尿病小鼠创口愈合速率采用在体成像系统于既定时间点第0、3、5、7、9、11、13天记录创面愈合情况。采用Image J定量测定创口愈合面积, 以创口愈合面积占原创口面积百分比代表创口闭合速率。
1.6 HE染色观察各组创口皮肤组织学差异收集创口愈合第14天小鼠创口处直径为8 mm的皮肤标本, 多聚甲醛固定后石蜡包埋。制作3 μm的皮肤组织切片, 按照HE染色试剂盒说明书操作, 染色后于光镜下观察皮肤组织学变化。
1.7 IHC检测创缘处皮肤Nrf2、HO-1的表达将已备好的皮肤组织切片, 按照IHC染色操作流程, 依次脱蜡至水、3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶、10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0) 抗原修复、山羊血清封闭后, 依次经单克隆抗体NRF2或HO-1孵育过夜, 生物素化的二抗及三抗(SAB复合物)常温各孵育40 min, 经DAB显色, 苏木精复染后梯度脱水透明, 中性树脂封片。
1.8 IHC检测8-oxo-dG水平比较组织氧化DNA损伤程度两步法检测创缘皮肤氧化DNA损伤, 将已备好的组织切片按上述步骤脱蜡至水, 依次采用蛋白酶K(10 μg/mL)、RNase A(100 μg/mL), HCL(2 mol/L)处理后, 按IHC操作步骤依次孵育抗8-oxo-dG抗体, 生物素化的二抗及三抗, 经DAB显色, 苏木精复染后梯度脱水透明, 中性树脂封片。
1.9 IHC染色评分IHC评分准则如近期研究所述[13], IHC染色分析由两位病理专家独立评分:染色强度分4个级别(由低至高):0分, 无着色; 1分, 浅黄色; 2分, 棕黄色; 3分, 黄褐色; 阳性染色面积为5个级别(由低至高): 0分<5%;1分5% ~25%;2分26% ~50%;3分51% ~ 75%;4分>75%。IHC染色的评分由染色强度分数乘以阳性染色面积分数表示; 每组4张片子, 每张片子的评分为3个视野的平均值。
1.10 统计学处理本研究结果以x±s记录, 采用GraphPad 6.0统计软件, 非配对t检验分析两组均值。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 糖尿病小鼠模型的建立和血糖监测情况拟建立糖尿病模型。如图 1所示, 小鼠8周龄时, 小剂量STZ(50 mg/kg)连续注射5 d。STZ注射4周后, 实施创口手术, Veh组在创口处涂抹20 μL PEG400, CA组在创缘局部涂抹20 μL含4 μmol/L CA的PEG400, 每隔1天干预直至第14天收集创缘处皮肤。定时拍照观察创口愈合情况。
定期监测各组血糖情况, STZ注射4周后血糖水平均>250 mg/dL, 表明糖尿病模型建立成功。经CA干预2周后,Nrf2+/+ CA组与Nrf2+/+ Veh组相比血糖水平并无差异;Nrf2-/- CA组与Nrf2-/- Veh组相比亦然, 表明局部应用CA对糖尿病小鼠血糖并无显著影响(P>0.05,表 1)。
组别 | Nrf2+/+ SKH-1小鼠 | Nrf2-/- SKH-1小鼠 | ||||
0周 | 4周 | 6周 | 0周 | 4周 | 6周 | |
Nrf2+/+ Veh组 | 130.00±9.96 | 428.00±26.76 | 474.75±16.42 | 108.25±6.63 | 436.50±24.49 | 442.25±33.79 |
Nrf2+/+ CA组 | 114.00±0.82 | 457.75±28.03 | 494.00±6.00 | 107.00±4.74 | 452.25±17.77 | 463.50±24.17 |
2.2 局部应用CA对Nrf2+/+小鼠糖尿病创口愈合的影响
如图 2A所示, 实时观察Nrf2+/+小鼠创口愈合过程中各个时间点的改变, Nrf2+/+ CA组小鼠的创口愈合情况比Nrf2+/+ Veh组较好(图 2A)。经定量分析各时间点创口愈合面积的变化(图 2B), Nrf2+/+ CA组在创口愈合的第9天起, 创口愈合速率显著增加(P < 0.05)。进一步比较各组创口愈合的组织学差异, 如图 2C所示, 发现Nrf2+/+ Veh组创面处仍有尚未脱落的痂及疏松的肉芽组织, 新生上皮并未完全覆盖创面, 然而, Nrf2+/+CA组创口处, 新生上皮已完全形成, 组织学完整。上述结果表明局部运用CA显著改善Nrf2+/+糖尿病小鼠创口愈合。
2.3 局部应用CA对Nrf2-/-小鼠糖尿病创口愈合的影响
进一步观察了CA对Nrf2-/-糖尿病小鼠创口愈合的影响。如图 3A所示, Nrf2-/- CA组和Nrf2-/- Veh组小鼠创口愈合过程并无差异。经定量分析比较各时间点创口愈合面积的变化(图 3B), Nrf2-/- Veh组和Nrf2-/- CA组的愈合速率亦无统计学差异(P>0.05)。此外, HE染色观察第14天两组创口皮肤的组织学变化, Nrf2-/- Veh组和Nrf2-/- CA组创面均为新鲜的肉芽组织, 创口皮肤尚未完全闭合(图 3C)。以上结果提示CA对Nrf2-/-糖尿病小鼠的创口愈合并无影响。
2.4 局部应用CA对Nrf2+/+糖尿病小鼠创缘处皮肤氧化应激的影响
如图 4, 对比两组Nrf2+/+糖尿病小鼠创缘处皮肤氧化应激相关指标的表达水平, 并进一步采用IHC染色评分定量分析相关蛋白表达水平的差异。经CA干预后, 与Nrf2+/+ Veh组相比, Nrf2+/+ CA组糖尿病小鼠创缘皮肤处Nrf2的表达水平增强[(2.42±0.29) vs (7.42±0.73), P < 0.05]及下游靶蛋白HO-1的表达水平亦显著增强[(5.92±0.36) vs (8.88±0.53), P < 0.05], 并且, 组织氧化应激损伤相关指标8-oxo-dG的水平较Nrf2+/+ Veh组降低[(9.46±0.28) vs (8.46±0.23), P < 0.05]。提示局部应用CA激活了创缘处皮肤的Nrf2通路, 缓解糖尿病小鼠创口创缘皮肤的氧化应激损伤。
2.5 局部应用CA对Nrf2-/-糖尿病小鼠创缘处皮肤氧化应激的影响
对比两组Nrf2-/-糖尿病小鼠创缘处皮肤氧化应激相关指标的表达水平(图 5), IHC评分定量分析:Nrf2-/- CA组和Nrf2-/- Veh组创缘处皮肤Nrf2、HO-1 [(1.80±0.32) vs (1.92±0.16), P>0.05]的表达水平并无明显差异, 并且两组8-oxo-dG的表达均较高, 但无明显不同[(11.58±0.28) vs (11.38±0.13), P>0.05], 提示局部应用CA对Nrf2-/-糖尿病小鼠的Nrf2通路及氧化应激损伤均无影响。
3 讨论
糖尿病是现今威胁人类健康的世界难题之一, 预计到2035年, 糖尿病人群将达到5.92亿, 大约25%的糖尿病患者处于进展为DUs的风险中, DUs迁延不愈, 是导致非创伤性截肢的重要因素, 严重降低患者的生活质量, 增加患者的死亡率和医疗费用[14], 是现今临床上极具挑战的难题之一, 目前尚无有效治疗措施[15], 探讨DUs愈合的具体机制,制定新的治疗策略及研发新的药物亟待研究解决。本研究一方面在Nrf2+/+糖尿病创口动物模型中证实局部应用CA可以激活Nrf2通路, 缓解创缘处皮肤的氧化应激损伤, 显著促进糖尿病创口愈合; 另一方面, 在Nrf2-/-糖尿病创口动物模型中, CA对其创口愈合的促进作用消失, 表明CA促进DUs愈合依赖于Nrf2通路。
众所周知, 氧化应激在DUs的发生发展中有重要作用, 体内抗氧化防御机制紊乱是导致DUs迁延不愈的因素之一[4]。Nrf2是一种在氧化应激相关的组织损伤中具有重要作用的氧化还原敏感转录因子, 与体内抗氧化反应元件间相互作用,调控编码多种抗氧化应激蛋白[16]。越来越多的研究表明全身使用Nrf2的激动剂如CA、SF, 或者局部运用Keap1siRNA干扰Keap1均可上调Nrf2的表达水平,从而显著促进糖尿病创口愈合[6-7], 但是上述研究尚未排除激活体内Nrf2通路的全身效应。本研究局部外用CA激活糖尿病小鼠创缘皮肤的Nrf2通路, 缓解氧化应激损伤, 促进糖尿病创口愈合, 提示局部外用CA可以直接改善DUs的局部微环境, 具有潜在的临床应用前景。
长期以来, Nrf2的另一种重要激动剂——SF, 是膳食中西兰花等植物提取的一种重要活性成分, 局部应用于皮肤可以抵抗紫外损伤等各种皮肤疾病, 防治皮肤肿瘤的形成和发展, 已在多项动物实验中得以证实[17]。近期临床试验结果亦表明, 局部外用西兰花提取精华液(含SF 500 nmol/mL), 对K14-相关的单纯性大疱性表皮松解症有较好的治疗效果[18]。而与SF相似的, 同样具有Nrf2激动作用的CA是桂皮总有机提取物的主要成分, 经FDA认证的食品添加剂, 继胡椒和香草之后位居世界香料销量第三位的物质[19], 更由美国“香料与提取物制造者协会(FEMA)”给予了“一般认为安全”的使用说明(NO.2286)[LONG.21-27], 未来可进一步探讨CA对其他皮肤疾病是否亦发挥着重要的保护作用。
CAPEG400水凝胶作为外用药物在体表创口的运用, 疗效稳定, 安全便捷, 在小鼠体内耐受性好, 但其药物在人体表皮肤的药物半衰期及安全剂量范围, 尚需进一步研究证实。局部使用CAPEG400水凝胶, 其对创口愈合的起效时间在第9天以后促进作用显著, 而在早期并未显现出独特的治疗效果, 可能是局部用药后的药物起效时间较长, 如何缩短药物的起效时间尚需进一步探讨。
综上, 本研究证实了CA局部外用于STZ诱导的糖尿病小鼠创口, 通过激活创缘处皮肤的Nrf2通路, 缓解氧化应激损伤, 从而促进糖尿病创口愈合; 新近研制的CAPEG400水凝胶外用疗效稳定, 安全可靠, 作用显著, 排除了全身性应用Nrf2激动剂的其他潜在效应, 为CA在DUs中的临床应用提供了实验依据和新的给药途径。
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