2. 400020 重庆,重庆市江北区人民医院药剂科
2. Department of Pharmacy, People's Hospital of Jiangbei District, Chongqing, 400020, China
胃溃疡是一种以腹胀、腹痛、恶心、反酸和呕吐为主要临床表现的消化道疾病。研究表明,约有60%的胃溃疡与应激性因素有关,且应激状态极易导致炎性糜烂和胃肠道出血为特征的胃黏膜损害,已成为严重影响人类生命健康的重要疾病[1]。然而,目前针对应激性胃溃疡的治疗方法有限,疗效也容易反复,寻求新的治疗策略迫在眉睫。石榴皮多酚是石榴果皮中主要存在的一种多酚类羟基化合物,其组分包括安石榴苷、没食子酸、绿原酸、表儿茶素、山奈素、咖啡酸和槲皮素等九种化合物[2]。大量研究结果显示,石榴皮多酚具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤和降血脂等多种生物学功能[3-4],但石榴皮多酚能否拮抗应激性溃疡及其具体机制尚不清楚,且国内外罕见报道。研究发现,Hedgehog信号的活化与胃溃疡的发生密切相关,Gli1、Gli2和Sufu均是反映Hedgehog信号转导的关键转录因子,也是启动Hedgehog信号通路的关键因子[5]。故本研究拟深入探讨Gli1-Gli2-Sufu信号通路在石榴皮多酚抗大鼠应激性胃溃疡中的作用。
1 资料与方法 1.1 实验材料兔多克隆抗体Anti-GAPDH Antibody、Anti-Gli1 Antibody购于Abcam公司(货号:ab9485;ab151796);兔多克隆抗体Anti-SUFU antibody购自于Proteintech Group公司(货号:10836-1-AP);羊多克隆抗体Anti-Gli2 Antibody购自于Thermofisher公司(货号:PA5-47500);血清前列腺素E2(PGE2)、促肾上腺皮质激素(ATCH)和皮质酮(CORT)测定ELISA试剂盒购于Bio-Swamp公司(货号:DRE20017,DRE20018,DRE 20034);丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所(货号A003-4,A001);荧光定量qPCR检测试剂盒、cDNA逆转录试剂盒和总RNA提取试剂盒均购于北京天根生化科技有限公司;奥美拉唑由上海大众药业有限公司生产(国药准字:H19981000);石榴皮多酚购于陕西宝鸡浩翔生物(货号:HXBZ-037)。
1.2 实验动物及分组选取50只7周龄健康Sprague Dawley雄性大鼠为受试对象,体质量240~260 g,购于重庆医科大学实验动物中心[动物生产许可证号:SCXK(渝)2012-0001]。适应环境7 d后,按随机数字表法分为空白对照组、应激性胃溃疡组(模型组)、奥美拉唑+应激性胃溃疡模型组(阳性对照组)、石榴皮多酚组和应激性胃溃疡模型+石榴皮多酚组,每组10只。处理期间,动物均自由饮食和进水,自然节律采光(12 h光照/12 h黑暗交替),环境湿度50%~70%,温度(24±2)℃,定期更换垫料,并记录大鼠的一般情况。
1.3 给药及模型制备方法各组大鼠均参照1 mL/100 g的标准预防性灌胃给药,每天9:00-11:00时灌胃1次,持续7 d,其中空白对照组和模型组均灌胃生理盐水,阳性对照组灌胃0.3 mg/mL奥美拉唑水溶液,石榴皮多酚组灌胃100 μg/mL石榴皮多酚水溶液,应激性胃溃疡模型+石榴皮多酚组则同样予以100 μg/mL石榴皮多酚水溶液灌胃预处理。灌胃结束后,模型组、阳性对照组和应激性胃溃疡模型+石榴皮多酚组分别应用水浸束缚应激法制备大鼠应激性胃溃疡模型,在10%水合氯醛麻醉后,仰卧固定,保持所用线绳松紧度适度,待动物清醒后,将其垂直浸入20 ℃恒温水箱中,露出大鼠胸骨剑突位置,10 h后取出松绑。
1.4 标本采集造模结束后,麻醉大鼠,常规消毒打开腹腔,迅速分离主动脉,虹膜剪剪一切口,插入采血针,连接加抗凝剂的真空采血管,采血完成后,常温放置2 h,4 ℃ 2 000 r/min离心10 min,取上清分装,-20 ℃储存备用。采血结束后,结扎幽门,取出完整胃部,于贲门处取2滴胃液,用于测定胃液pH值。剪开胃壁,放入生理盐水中漂洗后取出,轻轻刷去胃黏膜表面的黏液,平展于滤纸上,观察胃黏膜的损伤情况,计算损伤指数。随后,取适当大小胃组织,用于提取RNA和蛋白
1.5 胃液pH值和损伤指数测定采用pH酸碱度计测定胃液样本的pH值。参照Guth标准[6]计算损伤指数,即损伤≤1 mm(包括糜烂点),1分;1 mm < 损伤≤2 mm,2分;2 mm < 损伤≤3 mm,3分;3 mm < 损伤≤4 mm,4分;损伤>4 mm,5分;损伤宽度>2 mm者,计算分值再乘以2,分别计算全胃各病灶得分的总和,即为损伤指数。
1.6 血清相关细胞因子含量测定利用酶联免疫吸附实验分别测定大鼠血清前列腺素E2(PGE2)、促肾上腺皮质激素(ATCH)和皮质酮(CORT)的含量,应用化学比色法检测丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)。检测方法均严格参照试剂说明书由专业检验人员操作完成。
1.7 荧光定量PCR法PCR引物的合成均由上海Invitrogen公司承担完成,引物序列参考文献[7-8],分别如下所示:Gli1上游:5′-CCCTAAGGCTCCACCAATTCA-3′, 下游:5′-CCTTACCAGGACCACCATAAC-3′(208 bp); Gli2上游:5′-GCCCAAGCCTGGTCCACAATCT-3′, 下游: 5′-GGAAC-TCATGTCCCCAACAGC-3′(161 bp); Sufu上游: 5′-CC-ACGAGCTGATCCGCACAC-3′,下游:5′-CCGTGACTGC-GTAAGGATGT-3′(213 bp);GAPDH上游: 5′-GGGCCGGGTCATCATCTC-3′,下游: 5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3′(629 bp)。采用Trizol法提取胃组织的总RNA,测定RNA浓度后,取1 μg RNA将其利用逆转录为cDNA,以25 μL体系模板量行实时荧光定量PCR,反应参数条件:94 ℃预变性5 min,1个循环;94 ℃变性30 s,57 ℃退火延伸30 s,72 ℃ 10 min,持续35个循环;选择SYBR Green I/HRM Dye通道,读取Ct值;每个样本每种目的基因设置3个复孔,分别计算各样本各个基因的Ct值,以2-ΔΔCt方法进行定量分析,以β-actin的Ct值进行校正。
1.8 Western blot法处理结束后,提取胃组织蛋白,每个样本各取50 μg蛋白行SDS-PAGE电泳、转膜、室温封闭,随后分别孵育Gli1一抗(1 :500)、Gli2一抗(1 :400)、Sufu一抗(1 :300) 和GAPDH(1 :2 500),4 ℃孵育过夜,辣根酶标记的二抗(1 :5 000) 孵育1 h,化学发光后置于凝胶成像系统中成像,获取图片结果,采用Quantity one软件进行蛋白定量分析,并用内参GAPDH予以校正。
1.9 免疫共沉淀法取胃组织样本加入适量裂解液,冰上裂解30 min后,离心取上清;取10 μL Protein A琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液冲洗后,加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4 ℃缓慢摇晃孵育3 h,使抗体与Protein A琼脂糖珠偶连;免疫沉淀反应后,将琼脂糖珠离心至管底;小心吸去上清,琼脂糖珠用裂解缓冲液洗3次;最后加入15 μL上样缓冲液,沸水煮5 min。SDS-PAGE梯度胶10 mA恒流电泳后分析。
1.10 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行数据整理和分析,符合正态分布且方差齐的数据,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较应用SNK检验;不符合正态性或方差不齐的资料,多组间mRNA和蛋白表达比较利用秩和检验,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 各组大鼠胃组织溃疡情况比较如图 1所示,空白对照组、石榴皮多酚组均无明显的溃疡或出血情况,而模型组大鼠的胃组织有大量的出血和溃疡病灶;与模型组相比,阳性对照组和石榴皮多酚+模型组大鼠的溃疡和出血病灶明显减少。
2.2 各组大鼠胃液pH值和损伤指数比较
如表 1所示,与空白对照组比较,模型组大鼠的损伤指数明显升高,pH值显著下降,差异均有统计学意义(P < 0.05);与模型组相比,阳性对照组和石榴皮多酚+模型组的pH值增高,损伤指数降低,差异有统计学意义(P < 0.05);而石榴皮多酚组与空白对照组比较,两项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。
组别 | 胃液pH值 | 损伤指数 |
空白对照组 | 3.71±0.62 | 0.42±0.13 |
模型组 | 1.46±0.38a | 21.35±3.92a |
阳性对照组 | 2.76±0.40ab | 9.66±1.08ab |
石榴皮多酚组 | 3.68±0.61b | 0.50±0.11b |
石榴皮多酚+模型组 | 2.11±0.45ab | 14.62±2.39ab |
F值 | 5.293 | 12.757 |
P值 | 0.038 | < 0.001 |
a:P < 0.05,与空白对照组比较;b:P < 0.05,与模型组比较 |
2.3 各组大鼠血清相关细胞因子含量比较
如表 2所示,与空白对照组比较,模型组大鼠的MDA、ACTH和CORT含量明显升高,而SOD和PGE2的水平则显著下降,差异均有统计学意义(P < 0.05);与模型组相比,阳性对照组和石榴皮多酚+模型组的MDA、ACTH和CORT水平明显降低,SOD和PGE2的含量显著增高,差异均有统计学意义(P < 0.05);石榴皮多酚组与空白对照组比较,上述各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。
组别 | MDA(nmol/mg) | SOD(U/mg) | PGE2(ng/L) | ACTH(ng/L) | CORT(ng/L) |
空白对照组 | 6.01±2.01 | 22.74±4.56 | 98.17±6.84 | 12.02±2.05 | 80.75±7.64 |
模型组 | 21.34±4.69a | 10.90±2.89a | 84.10±5.30a | 24.79±3.18a | 121.18±10.75a |
阳性对照组 | 10.88±3.07ab | 17.13±3.06ab | 91.85±6.66ab | 18.45±3.01ab | 90.60±8.72ab |
石榴皮多酚组 | 5.87±1.96b | 21.37±4.82b | 99.03±6.23b | 12.37±1.97b | 81.54±7.33b |
石榴皮多酚+模型组 | 13.76±3.28ab | 14.66±2.60ab | 89.20±5.85ab | 15.84±2.76ab | 102.55±9.16ab |
F值 | 9.841 | 6.912 | 5.720 | 8.121 | 14.330 |
P值 | < 0.001 | 0.002 | 0.031 | < 0.001 | < 0.001 |
a:P < 0.05,与空白对照组比较;b:P < 0.05,与模型组比较 |
2.4 各组大鼠胃组织Gli1、Gli2和Sufu的mRNA和蛋白表达水平比较
如图 2所示,与空白对照组比较,模型组大鼠胃组织的Gli1、Gli2和Sufu的mRNA和蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P < 0.05);而与模型组相比,阳性对照组和石榴皮多酚+模型组的Gli1、Gli2和Sufu的mRNA和蛋白表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P < 0.05);石榴皮多酚组与空白对照组比较,上述各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.5 各组大鼠胃组织Gli2和Sufu蛋白复合物形成情况比较
如图 3所示,与空白对照组比较,模型组大鼠胃组织的Gli2和Sufu蛋白复合物水平增高,而与模型组相比,阳性对照组和石榴皮多酚+模型组的Gli2和Sufu蛋白复合物水平明显降低,差异均有统计学意义(P < 0.05);石榴皮多酚组与空白对照组比较,复合物水平比较差异则无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
应激性胃溃疡因起病隐匿、临床症状不典型等特点,容易造成误诊或漏诊,且多数患者确诊时病情较为严重,给临床治疗带来诸多困难,因此早期防治应激性溃疡对提高其诊疗效果和改善预后具有举足轻重的作用[9]。已有大量研究发现,天然植物化学提取物具有多种非营养性的生物学效应,包括抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎症和抗菌等,规律性地摄取或补充天然植物化学提取物不仅可有效提高患者的机体抵抗力,还可有效降低心脑血管疾病、消化道疾病,甚至肿瘤的发生率[10]。石榴皮多酚也是一种常见的植物化学提取物,已被证实对多种病理状态(如肝癌、高血脂、皮肤创伤、溃疡等)的发生发展有显著的拮抗作用。有学者发现,石榴皮多酚有效部位单次给药不但可调节应激大鼠胃肠运动机能,而且能有效减轻无水乙醇所致的胃溃疡[11]。本研究以水浸束缚应激法制备大鼠应激性胃溃疡模型,实验结果同样显示,石榴皮多酚可显著降低胃溃疡大鼠的溃疡损伤指数,升高胃液pH值,并促进溃疡的愈合,这与既往的报道结果基本一致[4],然而目前石榴皮多酚对胃溃疡的保护作用机制尚未明确。已有研究表明,应激性细胞因子水平(如PGE2、ACTH和CORT等激素和氧化应激指标)与胃溃疡的发生发展密切相关[12]。本研究还发现,石榴皮多酚可显著增加PGE2分泌和SOD活性,降低ACTH、CORT和MDA水平。该结果一方面提示,石榴皮多酚可能通过调节PGE2、ACTH和CORT等激素水平,经由神经-内分泌-免疫网络介导促进黏膜上皮细胞黏液的分泌,抑制胃酸的产生,促进胃黏膜损伤修复。另一方面,这一结果还表明,石榴皮多酚可能直接调控氧化应激关键分子SOD,降低脂质过氧化产物MDA的生成,进而减轻应激性溃疡的症状。
Hedgehog信号通路是调控人类胚胎发育的重要信号通路之一,其通路末端的胞内信号分子为Gli基因家族。目前已鉴定出Gli1、Gli2和Gli3 3个成员,均是Hedgehog信号通路不同水平激活的最后共同通道,可直接调控下游靶基因的转录和表达。其中,Gli1是直接的转录激活因子,Gli2生理条件下常位于胞浆,当Hh配体存在时,可活化转移入细胞核,与Sufu形成复合物,进而调控下游多种靶基因的转录[13]。最新研究显示,Gli1-Gli2-Sufu信号通路在成熟个体中可能与维持正常胃功能密切相关,而且是参与调节胃部肿瘤、消化性溃疡等消化道疾病的主要信号转导通路[14]。Gli1、Gli2和Sufu都可在胃肠道组织中表达,并参与调节胃泌素和胃酸的分泌。在胃部肿瘤的形成过程中Gli1、Gli2和Sufu都呈现明显过表达,靶向干预Gli1、Gli2或Sufu可减弱胃癌的侵袭和转移效应[15]。本研究结果发现,在模型组大鼠胃组织中Gli1、Gli2和Sufu的mRNA和蛋白表达水平均明显升高,且Gli2和Sufu的复合物形成也明显增加,提示其可能参与了胃溃疡的发生发展进程。研究结果显示,石榴皮多酚处理的模型组,两者的过表达作用明显受到抑制,Gli2和Sufu复合物生成减少,且伴随着损伤指数、pH值等指标的改善,充分提示Gli1-Gli2-Sufu信号通路可能调控石榴皮多酚拮抗应激性胃溃疡的作用。
奥美拉唑是经典的质子泵抑制剂,可特异性地作用于胃黏膜壁细胞顶端膜构成的分泌性微管和胞质内的管状泡上,抑制氢钾离子ATP酶的活性,阻断胃酸分泌,是临床上治疗胃溃疡的一线药物。本研究采用奥美拉唑为阳性对照药物,结果同样显示,奥美拉唑处理同样可以实现对应激性胃溃疡的保护和促进修复效应,这与既往研究结论基本一致[16]。有研究还发现,环氧酶-2及其分泌的炎症代谢产物前列腺素E2(PGE2) 与Gli1-Gli2-Sufu信号通路的活化密切相关[17]。本研究结果还显示,石榴皮多酚对模型组动物的氧化应激指标SOD和MDA均有显著的改善作用,提示环氧酶-2及其分泌的PGE2也可能是石榴皮多酚保护效应的潜在机制,而且Gli1-Gli2-Sufu信号通路可能通过调控环氧酶-2和PGE2途径影响SOD和MDA的含量。
综上所述,本研究结果发现,石榴皮多酚对大鼠应激性胃溃疡的保护作用可能与Gli1-Gli2-Sufu信号通路活化及细胞因子水平改变有关。然而,由于本研究纳入的动物数量有限,研究时限较短,尚未测定石榴皮多酚具体成分的构成状况,且未予以动物模型的Gli1、Gli2或Sufu靶向敲除或过表达干预,故结论仍有一定局限性,期望在后续研究体外模型或转基因动物模型中加以论证。
[1] | GULATI K, CHAKRABORTI A, RAY A. Gender based differences in stress-induced gastric ulcer formation and its regulation by nitric oxide (NO): an experimental study[J]. Curr Pharm Des, 2015, 21(23): 3395–3401. DOI:10.2174/13816128113199990413 |
[2] | LI J, HE X, LI M, et al. Chemical fingerprint and quantitative analysis for quality control of polyphenols extracted from pomegranate peel by HPLC[J]. Food Chem, 2015, 176: 7–11. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.12.040 |
[3] | COLANTUONO A, FERRACANE R, VITAGLIONE P. In vitro bioaccessibility and functional properties of polyphenols from pomegranate peels and pomegranate peels-enriched cookies[J]. Food & Function, 2016(10): 4247–4258. DOI:10.1039/C6FO00942E |
[4] | WISSAM Z, BASHOUR G, ABDELWAHED W, et al. Alginate-pomegranate peels' polyphenols beads: effects of formulation parameters on loading efficiency[J]. Brazilian Journal of Pharmaceutical Science, 2014, 50(4): 741–748. DOI:10.1590/S1984-82502014000400009 |
[5] | TANAKA T, ARAI M, MINEMURA S, et al. Expression level of sonic hedgehog correlated with the speed of gastric mucosa regeneration in artificial gastric ulcers[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2014, 29(4): 736–741. DOI:10.1111/jgh.12445 |
[6] | GUTH P H, AURES D, PAULSEN G. Topical aspirin plus HCl gastric lesions in the rat. Cytoprotective effect of prostaglandin, cimetidine, and probanthine[J]. Gastroenterology, 1979, 76(1): 88–93. |
[7] |
韩仕庆, 曹文富, 冯藜枥. 丹参含药血清抑制瘦素及Hh信号通路激活诱导的大鼠肝星状细胞中EVC2和Gli2表达上调[J].
中国组织化学与细胞化学杂志, 2016, 25(2): 118–124.
HAN S Q, CAO W F, FENG L L, et al. Danshen-containing serum inhibits leptin-and hedgehog signaling pathway activation-induced upregulation of EVC2-and Gli2-expression in rat hepatic stellate cells[J]. Chin J Histochem Cytochem, 2016, 25(2): 118–124. DOI:10.16705/j.cnki.1004-1850.2016.02.004 |
[8] |
韩仕庆, 王海兰, 冯藜枥, 等. 丹参含药血清对肝星状细胞Hh通路中Sufu和DYRK2表达的影响[J].
中国中药杂志, 2015, 40(22): 4469–4474.
HAN S Q, WANG H L, FENG L L, et al. Effect of Danshen-containing serum on expression of Sufu and DYRK2 in HSCs[J]. China J Chin Materia Medica, 2015, 40(22): 4469–4474. DOI:10.4268/cjcmm20152227 |
[9] | DEDING U, EJLSKOV L, GRABAS M P, et al. Perceived stress as a risk factor for peptic ulcers: a register-based cohort study[J]. BMC Gastroenterology, 2016, 16(1): 140. DOI:10.1186/s12876-016-0554-9 |
[10] | HE P, ZHOU R, HU G, et al. Curcumin-induced histone acetylation inhibition improves stress-induced gastric ulcer disease in rats[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(3): 1911–1916. DOI:10.3892/mmr.2014.2958 |
[11] | MUSTAFA Ç, YAŞAR H. Pressurised water extraction of polyphenols from pomegranate peels[J]. Food Chemistry, 2010, 123(3): 878–885. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.05.011 |
[12] | XIAO C, FENG R, ENGEVIK A C, et al. Sonic Hedgehog contributes to gastric mucosal restitution after injury[J]. Laboratory Investigation, 2013, 93(1): 96–111. DOI:10.1038/labinvest.2012.148 |
[13] | FENG R, ENGEVIK A C, SCHUMACHER M A, et al. 797 the ulcer associated cell lineage glands are Hedgehog targets in response to gastric injury[J]. Gastroenterology, 2014, 146(5): S–139. DOI:10.1016/S0016-5085(14)60491-1 |
[14] | ENGEVIK A C, FENG R, YANG L, et al. The acid-secreting parietal cell as an endocrine source of Sonic Hedgehog during gastric repair[J]. Endocrinology, 2013, 154(12): 4627–4639. DOI:10.1210/en.2013-1483 |
[15] | YU B, GU D, ZHANG X, et al. GLI1-mediated regulation of side population is responsible for drug resistance in gastric cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(16): 27412–27427. DOI:10.18632/oncotarget.16174 |
[16] | EL-SHINNAWY N A, ABD-ELMAGEID S A, ALSHAILABI E M. Evaluation of antiulcer activity of indole-3-carbinol and/or omeprazole on aspirin-induced gastric ulcer in rats[J]. Toxicol Ind Health, 2014, 30(4): 357–375. DOI:10.1177/0748233712457448 |
[17] | ZHOU F, HUANG D, LI Y, et al. Nek2A/Sufu feedback loop regulates Gli-mediated Hedgehog signaling pathway[J]. International Journal of Oncology, 2016, 50(2): 373–380. DOI:10.3892/ijo.2016.3819 |