2. 400038 重庆,第三军医大学微生物教研室
2. Department of Microbiology, College of Basic Medical Sciences, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China.)
“静坐少动(sedentary)”是慢性疾病发生的独立危险因素,全球因缺乏运动而引致的死亡人数, 每年超过二百万人[1-2]。运动(exercise)可以提高人体天然免疫力,预防多种慢性疾病。但是运动对人体健康产生影响的作用机理仍然不清楚[3]。因此,了解及阐明运动影响人体健康的作用机理,能使人们更加全面而深入的了解运动,指导人们积极保持健康的运动习惯。人体免疫系统对维持肠道菌群的稳态具有重要作用,如对正常肠道菌群表现为免疫耐受,对病原菌则表现为免疫排斥作用[4]。人体循环系统中蛋白酶和激素是肠道菌群重要的生存环境因子,对肠道菌群的结构和功能具有调节作用。因此,运动对人体免疫系统的调节及激素类物质的持续性影响可能会导致肠道菌群结构的改变。
人体肠道内的微生物数量多达1014个,覆盖了1 000多种已知的微生物种类,其中大多数细菌都是无法体外纯培养的菌种。随着测序技术突飞猛进的发展,基于宏基因组,宏转录组和宏代谢组的微生物研究技术,不需要对肠道微生物进行分离培养,利用高通量测序平台对样本中全部DNA,RNA或代谢物质进行定性定量的分析检测[5]。如基于16S rDNA的高通量测序技术,通过提取全部肠道微生物基因组,利用高通量测序平台对扩增的16S rDNA片段产物序列进行测定,最后根据测序数据对所有肠道微生物进行分类鉴定和定量分析。近年来,受益于这些不依赖于体外培养的高通量微生物研究技术,越来越多的研究表明,肠道菌群结构的改变与多种慢性疾病和癌症,如肥胖,糖尿病,肠炎和结肠癌的发生发展有着重要联系;人体免疫系统在调节肠道菌群的同时,也受到肠道菌群的影响;肠道菌群能通过多种方式与大脑神经系统对话,影响人体的情绪,睡眠和心理健康。由此可见,肠道菌群与人体的运动功能之间可能存在着相互作用,肠道菌群的结构改变可能是运动对人体健康产生积极影响的一种重要的作用方式。在这项工作中,我们利用基于16S rDNA的高通量测序技术,分析了运动人群和少动人群粪便中的肠道细菌的组成。从肠道菌群的角度研究运动对人体健康的影响,鉴定运动诱导产生的“健康肠道菌”,不仅能使人们以一个全新的视角进行认识运动的作用,还能为通过肠道菌群干预治疗运动功能相关疾病提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 粪便采集研究招募了两组人群,分为跑步人群和少动人群,各200人。其中跑步人群为保持日常跑步习惯1年以上,平均每周休闲跑步至少3次,配速8~9 km/h,距离5~10 km,每月跑步距离总量60~100 km。少动人群为极少运动的人群,日常上下班以开车为主,日常工作为伏案工作。根据“McCance and Widdowson’s The Composition of Foods Integrated Dataset 2015”以及Willett的饮食频率问卷(food-frequency questionnaire, FFQ), 设计了符合本地区饮食习惯的饮食调查问卷[6-7]。从这两组人群中每组各筛选20名饮食习惯相似的志愿者,分为运动组(exersise, EX)和少动组(sedentary, SED)。为了尽可能排除如昼夜节律及其他生活习惯对肠道菌群的干扰,我们对这40名志愿者进行了为期一周的粪便采集,每人一共采集3次粪便样本。将3次粪便取等量混合后为1份样本(剩余样本冻存于-80 ℃冰箱中)。
1.2 粪便DNA的提取取1 g粪便样本用10 mL无菌的0.1 mol/L的磷酸钠缓冲液重悬,涡旋15 min,200×g离心10 min,离心3次,弃去粗颗粒,收集上清;9 000×g离心10 min,收集沉淀,再用30 mL的磷酸钠缓冲液洗4次,最后重悬于10 mL的磷酸钠缓冲液中,随后利用粪便DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit)进行DNA提取。
1.3 16S rDNA的V3-V4区测序16S rDNA位于原核细胞核糖体小亚基上,包括10个保守区域(Conserved Regions)和9个高变区域(Hypervariable Regions),其中保守区在细菌间差异不大,高变区具有属或种的特异性,随亲缘关系不同而有一定的差异。因此,16S rDNA可以作为揭示生物物种的特征核酸序列,被认为是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。本课题采用16S rDNA扩增子测序(16S rDNA Amplicon Sequencing),选择V3-V4变异区域,利用保守区设计通用引物如下:
(FwOvAd_341FTCGTCGGC-AGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG; ReOvAd_785RGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACA-GGACTACHVGGGTATCTAATCC),进行PCR扩增,然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定。根据所扩增的16S区域特点,基于Illumina HiSeq测序平台,利用双末端测序(Paired-End)的方法,构建小片段文库进行双末端测序。
1.4 测序数据处理将Illumina HiSeq测序平台得到的原始数据拼接和质控,得到Clean Tags,再进行嵌合体过滤,得到可用于后续分析的有效数据,即Effective Tags。
1.5 生物信息学分析① 为了研究样品的物种组成多样性,对所有的100个样品的Effective Tags进行聚类,以97%的一致性(identity)将序列聚类成为OTUs(operational taxonomic units),然后对OTUs的代表序列进行物种注释。根据OTUs聚类结果,一方面对每个OTU的代表序列做物种注释,得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。② 对OTUs进行丰度、Alpha多样性计算、Venn图等分析,以得到运动组和少动组共有和特有OTUs信息。③ 对OTUs进行多序列比对并构建系统发生树,并进一步得到运动组和少动组的群落结构差异。最后进行PCoA分析展示。④ 根据OTUs的物种注释结果,选取每个样品在各分类水平门、纲、目、科、属、种(phylum、class、order、family、genus)上最大丰度排名前10的物种,生成物种相对丰度柱形累加图,以便直观查看各样品在不同分类水平上,相对丰度较高的物种及其比例。为进一步挖掘运动组和少动组间的群落结构差异,选用T-test、MetaStat、LEfSe、Anosim和MRPP等统计分析方法对分组样品的物种组成和群落结构进行差异显著性检验。
1.6 统计学分析采用Student’s t双尾t检验,比较运动/少动组志愿者的年龄、身体、饮食数据的差异是否有统计学意义。
2 结果 2.1 志愿者信息我们通过问卷调查的方式,从运动人群和少动人群中各筛选了200名年龄,身体质量指数(BMI)相似的志愿者,随后利用饮食问卷调查的形式,筛选了40名每日主要营养物质摄入量相似(P > 0.05) 的志愿者(表 1)。所有的志愿者无胃肠道疾病,最近半年内未使用过抗生素。
组别 | 年龄(岁) | BMI(kg/m2) | 能量(kcal/d) | 蛋白质(g/d) | 脂肪(g/d) | 碳水化合物(g/d) |
EX组(n=20) | 31.0±2.9 | 22.0±1.8 | 2 653.4±1170.5 | 125.3±51.6 | 187.7±75.8 | 265.3±117.1 |
SED组(n=20) | 29.6±23.6 | 22.6±31.3 | 2 159.3±1 127.1 | 102.3±46.3 | 137.0±80.3 | 215.9±112.1 |
P | 0.35 | 0.5 | 0.35 | 0.31 | 0.16 | 0.35 |
2.2 OTU聚类及物种注释概况
一共获得2 475 514条有效序列(1 017 828 653 bp),平均长度为411.158 512 131。随后,对测序有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和丰度统计。再根据OTUs聚类结果,一方面对每个OTU的代表序列做物种注释,得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况(图 1)。40个粪便样本测序一共得到61 888个OTUs,其中注释的OTUs有61 149个,平均每个样本包含335个OTUs。为了分析运动组和少动组各组中的优势菌种,我们使用GraPhlAn针对每个分组中的所有样本的OTUs物种注释结果进行系统发育分析和总体的可视化展示(图 2)。结果显示,运动组和少动组肠道菌群的优势菌种是一致的,丰度最大的是Firmicutes,在运动组和少动组中的丰度分别为76%和71%,另外3种相对丰度较大的优势菌种分别是Bacteroidetes,Proteobacteria和Actinobacteria。这说明运动对人体肠道菌群的大结构不会有影响,所起的作用可能只是调节作用。
2.3 肠道菌群的物种的分布分析
为了找出各样本中聚集较多或含量较低的物种,我们根据所有样品在属水平的物种注释及丰度信息,选取丰度排名前35的属,根据其在每个样品中的丰度信息,从物种和样品两个层面进行聚类。如图 3所示,这35个属的细菌分属于4个优势的细菌门:27个Firmicutes门类细菌,3个Bacteroidetes门类细菌,3个Proteobacteria门类细菌和1个Actinobacteria门类细菌。聚类分析结果显示,各个细菌属都没有在运动组或者少动组中全部的志愿者中聚集较多或者较少,这说明每个志愿者之间肠道菌群的物种丰度差异性非常大,如果需要鉴定运动组和少动组之间的肠道菌群结构差异,需要对每个分组进行总体的分析。
2.4 运动组和少动组肠道菌群的结构差异分析
由图 4A可知,当样本量达到30例时,曲线趋于平缓,表明抽样充分,可以进行后续的物种差异性分析。为了分析运动组和少动组志愿者肠道菌群OUTs组成的差异程度,我们进行了基于Weighted Unifrac距离的主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)。通过一系列的特征值和特征向量排序从多维数据中提取出最主要的元素和结构,并选取贡献率最大的主坐标组合(PC1=49.24%,PC2=10.12%)进行作图展示。横坐标表示一个主成分,纵坐标表示另一个主成分,百分比表示主成分对样品差异的贡献值;图中的每个点表示一个样品,同一个组的样品使用同一种颜色表示。如果样品距离越接近,表示物种组成结构越相似,因此群落结构相似度高的样品倾向于聚集在一起,群落差异很大的样品则会远远分开。如图 4B所示,运动组和少动组两组之间的样本分为两个簇集,说明运动组和少动组两组志愿者的肠道菌群的OTUs组成差异程度较大。
2.5 运动组和少动组肠道菌群的差异物种
我们对运动组与少动组各样本中物种相对丰度排名最高的前10的各分类水平(门、纲、目、科、属、种)的物种组成进行了差异分析(图 5)。根据得到的差异分析中群落丰度数据,进行组间差异显著性检验:运用严格的统计学方法可以检测运动/少动组微生物群落中表现出的丰富度差异的微生物科,进行假设性检验,评估观察到的差异的显著性(图 6)。结果显示,运动组和少动组在各个分类水平都存在显著差异的物种,尤其是在科水平:相对丰度排名最高的前10个微生物科的柱状图。横坐标中每一个条形图代表一个样本,纵坐标代表相对丰度。同一种颜色代表相同的分类级别(科)。Others表示图中这10个科之外的其他所有门的相对丰度之和。运动组中毛螺菌科(Lachnospiraceae)和拟杆菌科(Bacteroidaceae)的丰度显著高于少动组,(P=2.5627×10-7,P=0.000 178 4),普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)的丰度显著低于少动组(P=0.000 003 46,P=0.000 017 41)。有三株可培养的菌株在运动组中丰度显著增加,分别为瘤胃球菌属的Ruminococcus_sp.5_1_39BFAA,双歧杆菌属的Bifidobacterium_adolescentis以及丁酸产盐菌属的Anaerostipes_hadrus。既往报道显示,在运动组中丰度显著增加的某些肠道菌能够产生对人体有益的代谢物,如Lachnospiraceae和Anaerostipes_hadrus代谢产生的丁酸类物质能够降低结肠癌的患病风险;拟杆菌科,双歧杆菌属的Bifidobacterium_adolescentis以及Anaerostipes_hadrus,能够产生丰富的SCFAs,对肠粘膜免疫系统动态平衡的维持具有重要意义。在运动组中丰度显著减少的某些肠道菌,如普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)与自闭症,帕金森等疾病有关。这些结果提示我们,运动能够通过肠道菌群结构的调整:增加健康菌,抑制有害菌,从而对人体健康产生积极的影响。
3 讨论
本研究利用Illumina HiSeq测序平台进行肠道菌群的结构分析,结果显示,两种生活方式:经常运动和很少运动两组人群肠道菌群的组成显著不同, 说明肠道菌群与人体的运动功能是存在相互作用。2007年,发表在《PNAS》上的一项研究首次为肠道菌群对运动功能的影响提供了实验证据:肠道菌能够提高小鼠肌肉组织中的AMPK(AMP蛋白激酶)活性和Fiaf(空腹诱导的脂肪因子)水平,增加肌肉脂肪的分解代谢,从而能够抵抗饮食诱导的肥胖[6]。2016年12月,《Cell》主刊的一篇报道显示肠道菌群能通过分泌免疫因子,活化大脑中的小胶质细胞,进而影响到与运动相关的神经元,从而影响帕金森症[7]。提示人们可以通过肠道微生物的干预来改善运动功能相关的疾病。
本研究中,长期保持运动的生活习惯能够显著增加肠道中健康细菌的丰度,抑制有害细菌的丰度,其中某些健康菌如在运动组中显著增加的肠道菌,如拟杆菌科,双歧杆菌属的Bifidobacterium_adolescentis以及Anaerostipes_hadrus,能够产生丰富的SCFAs。SCFAs能够作用于肠粘膜上的G蛋白偶联受体,如GPR43,具有抗炎症作用,从而对肠黏膜免疫系统动态平衡的维持具有重要意义[8]。由此可见,运动能通过肠道菌群与肠黏膜免疫系统之间的相互作用,从而对全身免疫系统进行调理,这可能是运动有益身心健康的一种潜在机制。运动的这种对人体的保护作用在既往研究中也有所报道。MatsuMoto等利用温度凝胶电泳技术(PCR-TGGE),首次证明了运动能够改变肠道菌群的结构:雄性大鼠在自愿轮转运动5周后,体内的肠道菌群结构显著改变,其中能代谢生成短链脂肪酸的细菌种类显著增加[9]。随后,一项类似的研究利用变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)发现,雄性大鼠在自助轮转运动6 d后,其肠道菌群的α-多样性(主要关注局域均匀生境下的物种数目)显著改变:乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度增加,梭状芽孢杆菌(Clostridium)和肠球菌属(Enterococcus)丰度减少[10]。进一步研究发现,运动能够逆转不良身体状态,如环境中的污染物,高脂饮食引发的肥胖等诱导的肠道菌群失调:口服多氯化联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)会改变小鼠肠道菌群的结构,而运动能缓解PCBs诱发的肠道菌群结构改变[11-12]。除了上述动物实验的研究证据,两篇人体研究模型的研究结果同样显示运动能够改变人体肠道菌群结构:① 长期运动的男性橄榄球运动员与不经常运动的健康男性相比,其体内的肠道菌群种类明显较多,其中阿克曼菌(Akkermansia)显著增加,Akkermansia在维持人体消化道粘膜屏障和防止肥胖相关代谢疾病方面具有重要作用;② 另外一项相似的研究通过分析1 493个来自“美国胃肠道工程(American Gut Project)”的志愿者的粪便样本发现,经常运动的人群具更大的肠道菌群多样性,其中厚壁菌(Firmicutes)门的丰度显著增加,而肠道菌群多样性的增加是意味着更加健康的肠道环境[13]。除了雄性动物模型,研究人员在雌性大鼠和小雌马中同样发现,不同的运动强度和运动时间都能导致肠道菌群结构发生显著改变[14-15]。这些研究结果中丰度增加或降低的肠道菌群种类因研究模型,运动强度,运动方式以及研究技术不同而各不相同。尽管如此,这些研究都为运动对肠道菌群结构产生积极的影响提供了证据。
综上所述,本研究从肠道菌群的角度来探究跑步运动对人体健康的影响。我们的研究结果显示,运动能够调整肠道菌群的结构,增加健康菌,抑制有害菌,并通过肠道菌群与肠黏膜系统之间的对话对人体健康产生积极的影响。这项工作的研究结果能够为人们对运动的作用带来全新的认识,从而督促人们积极地保持良好的运动习惯。
[1] | WARREN T Y, BARRY V, HOOKER S P, et al. Sedentary behaviors increase risk of cardiovascular disease mortality in men[J]. Med Sci Sports Exerc, 2010, 42(5): 879–885. DOI:10.1249/MSS.0b013e3181c3aa7e |
[2] | OWEN N, HEALY G N, MATTHEWS C E, et al. Too Much Sitting[J]. Exercise and Sport Sciences Reviews, 2010, 38(3): 105–113. DOI:10.1097/jes.0b013e3181e373a2 |
[3] | WARBURTON D E, NICOL C W, BREDIN S S. Health benefits of physical activity: the evidence[J]. journal de l'Association medicale canadienne, 2006, 174(6): 801–809. DOI:10.1503/cmaj.051351 |
[4] | HOOPER L V, LITTMAN D R, MACPHERSON A J. Interactions between the microbiota and the immune system[J]. Science, 2012, 336(6086): 1268–1273. DOI:10.1126/science.1223490 |
[5] | GILBERT J A, QUINN R A, DEBELIUS J, et al. Microbiome-wide association studies link dynamic microbial consortia to disease[J]. Nature, 2016, 535(7610): 94–103. DOI:10.1038/nature18850 |
[6] | BÄCKHED F, MANCHESTER J K, SEMENKOVICH C F, et al. Mechanisms underlying the resistance to diet-induced obesity in germ-free mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(3): 979–984. DOI:10.1073/pnas.0605374104 |
[7] | SAMPSON T R, DEBELIUS J W, THRON T, et al. Gut Microbiota Regulate Motor Deficits and Neuroinflammation in a Model of Parkinson's Disease[J]. Cell, 2016, 167(6): 1469–1480. DOI:10.1016/j.cell.2016.11.018 |
[8] | JOBIN C. GPR109a: the missing link between microbiome and good health[J]. Immunity, 2014, 40(1): 8–10. DOI:10.1016/j.immuni.2013.12.009 |
[9] | MATSUMOTO M, INOUE R, TSUKAHARA T, et al. Voluntary running exercise alters microbiota composition and increases n-butyrate concentration in the rat cecum[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2008, 72(2): 572–576. DOI:10.1271/bbb.70474 |
[10] | QUEIPO-ORTU O M I, SEOANE L M, MURRI M, et al. Gut microbiota composition in male rat models under different nutritional status and physical activity and its association with serum leptin and ghrelin levels[J]. PLoS ONE, 2013, 8(5): e65465. DOI:10.1371/journal.pone.0065465 |
[11] | CHOI J J, EUM S Y, RAMPERSAUD E, et al. Exercise Attenuates PCB-Induced Changes in the Mouse Gut Microbiome[J]. Environmental Health Perspectives, 2013, 121(6): 725–730. DOI:10.1289/ehp.1306534 |
[12] | EVANS C C, LEPARD K J, KWAK J W, et al. Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity[J]. PLoS ONE, 2014, 9(3): e92193. DOI:10.1371/journal.pone.0092193 |
[13] | CLARKE S F, MURPHY E F, O'SULLIVAN O, et al. Exercise and associated dietary extremes impact on gut microbial diversity[J]. Gut, 2014, 63(12): 1913–1920. DOI:10.1136/gutjnl-2013-306541 |
[14] | LIU T W, PARK Y M, HOLSCHER H D, et al. Physical Activity Differentially Affects the Cecal Microbiota of Ovariectomized Female Rats Selectively Bred for High and Low Aerobic Capacity[J]. Plos one, 2015, 10(8): e0136150. DOI:10.1371/journal.pone.0136150 |
[15] | ALMEIDA M L, FERINGER W H, CARVALHO J R, et al. Intense Exercise and Aerobic Conditioning Associated with Chromium or L-Carnitine Supplementation Modified the Fecal Microbiota of Fillies[J]. PLoS ONE, 2016, 11(12): e0167108. DOI:10.1371/journal.pone.0167108 |