2. 400038 重庆，第三军医大学：西南医院全军感染病研究所, 感染病研究重庆市重点实验室
2. Institute of Infectious Diseases, Chongqing Key Laboratory of Infections Disease, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis, SBP)是肝硬化和肝衰竭最常见的严重并发症之一[1-2]。慢性肝病患者自身免疫功能低下, 肝脏解毒功能减退，门静脉高压所致肠道淤血，黏膜屏障功能被破坏，肠道菌群失调及移位，是容易导致SBP发生的重要原因。一旦发生感染，若不及时控制，可进展为感染性休克和肝肾功能衰竭，诱发肝性脑病，严重危及患者生命[3-4]。因此，SBP的早期快速诊断对晚期肝病患者获得及时有效治疗、改善预后具有至关重要的作用[5-6]。
目前SBP的诊断标准为：临床症状、体征，结合腹水培养阳性和/或多形核细胞(polyremorphonuclear, PMN)≥250×106/L[7]。但SBP临床表现缺乏特异性、多数患者起病隐匿；腹水细菌浓度低、腹水培养阳性率低且耗时长；细胞学检查结果受腹水稀释等诸多因素影响，具有个体差异性。因此，肝病患者SBP早期诊断存在困难，临床迫切需求简便、快速、准确的检测指标，用于指导SBP的早期判别及治疗[8-9]。
降钙素原(procalcitionin，PCT)在细菌感染时显著升高，非细菌感染时不升高或轻微升高，半衰期长达25~30 h[10]。血中性粒细胞比例是临床常用的炎性反应判别指标，二者均有助于实现快速筛查或诊断细菌感染性疾病。本研究回顾分析130例晚期肝病腹水患者的临床资料，旨在探讨血降钙素原与中性粒细胞比例在SBP中的诊断意义，为临床早期筛查SBP提供依据。
1 资料与方法 1.1 一般资料收集2014年1月至2016年12月西南医院感染科住院的843例肝病腹水患者病例资料，年龄16~72岁，男性563例，女性280例。纳入标准：(1) 入院后同时检测血PCT、血常规、腹水常规和腹水培养的患者；(2) 纳入SBP患者符合以下诊断标准：① 不同程度的发热、腹痛、腹胀，压痛、反跳痛；② 腹水检查PMN≥250×106/L；③ 腹水培养细菌阳性；符合② 或/和③ 条为SBP确诊标准。排除标准：合并肺部感染、继发性腹腔感染、泌尿系统感染、口腔感染、胆道感染等其它部位感染的患者，最后纳入130例患者。
1.2 方法 1.2.1 分组标准参照2010年欧洲肝病学会(EASL)制定的肝硬化腹水临床实践指南[7]，将最终符合纳入标准的130例患者分为：SBP确诊组(n=89) 和非感染性腹水组(n=41)。SBP确诊组：依据腹水类型分为：SBP1组(培养阳性且PMN≥250×106/L) 10例，SBP2组(培养阳性但PMN < 250×106/L) 11例，SBP3组(培养阴性但PMN≥250×106/L)68例。非感染性腹水组41例：腹水PMN < 250×106/L且腹水培养阴性，住院期间未发现任何感染，经非抗生素治疗后病情好转出院，包括症状缓解、腹水明显减少并保持稳定、生物化学指标改善。
1.2.2 资料采集采集的临床资料包括患者性别、年龄、肝硬化病因；患者腹水检测(腹水培养、腹水WBC、PMN计数等)、血降钙素原检测、血常规检查(白细胞、中性粒细胞比例等)；患者预后情况。临床相关检测资料的采集时间点为各组患者腹水标本采集当天。住院期间多次检测符合入组标准的情况，则取首次，同日内重复测量的指标亦取首次。
1.2.3 检测方法血降钙素原检测采用电化学发光法(罗氏全自动免疫分析仪，COBAS-E601)，对应的实验室推荐参考值范围为：0~0.05 ng/mL。腹水培养及药敏由检验科细菌室完成，其余实验室观察指标由感染科实验室检测。
1.3 统计学分析数据分析采用SPSS 22.0软件。满足正态性检验(Shapiro-Wilk检验)的计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析进行4组间差异比较；不满足正态性检验的资料则采用中位数(四分位距)表示，采用Kruskal-Wallis H检验进行组间差异比较；计数资料以频数和百分比表示，采用χ2分析进行组间差异比较；降钙素原与血常规中性粒细胞比例通过ROC曲线来评价，通过约登指数获取最佳诊断界值；检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 患者一般资料843例慢性肝病腹水患者，其中523例获得腹水细胞学、腹水培养、PCT、血常规等检查结果。进一步排除合并其他部位感染，且严格参照2010年欧洲肝病研究会(EASL)制定的肝硬化腹水临床实践指南[7]中自发性细菌性腹膜炎的诊断标准(图 1中简称2010EASL)，最后筛选符合指南标准的SBP患者89例，非感染性腹水患者41例，筛选流程见图 1。
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| 图 1 患者筛选流程图 |
130例肝病腹水患者中，96例(74%)为肝硬化失代偿，34例(26%)慢加急性肝衰竭。4组患者性别、年龄差异无统计学意义；但各SBP组与非感染性腹水组之间的腹水WBC、腹水PMN、降钙素原、血常规WBC、血常规中性粒细胞比例间差异有统计学意义(P < 0.05，表 1)。
| 组别 | n | 男性a[例(%)] | 年龄[岁，中位数(四分位距)] | 疾病组成分a[例(%)] | 腹水WBCb[106/L，中位数(四分位距)] | 腹水PMNb[106/L，中位数(四分位距)] | 血常规WBCb[109/L，中位数(四分位距)] | 降钙素原b[ng/mL，中位数(四分位距)] | 血常规中性粒细胞比例c (Neu%, x±s) | |
| 肝硬化失代偿期 | ACLF | |||||||||
| SBP1组 | 10 | 7(70.00) | 47.50(12.50) | 3(30.00) | 7(70.00) | 7 490.00(2 307.50, 12 307.50) | 6 943.50(1 758.25, 10 228.50) | 9.31(7.25, 15.58) | 4.51(1.54, 8.46) | 82.34±6.49 |
| SBP2组 | 11 | 10(100.00) | 47.00(29.00) | 8(72.73) | 3(27.27) | 120.00(80.00, 192.50) | 59.00(0, 72.00) | 5.37(3.92, 8.42) | 0.40(0.31, 0.94) | 73.27±9.58 |
| SBP3组 | 68 | 50(96.15) | 51.00(15.50) | 49(72.06) | 19(27.94) | 1 290.00(630.00, 3 300.00) | 661.00(356.00, 1 788.50) | 6.00(4.06, 9.25) | 0.77(0.21, 1.69) | 69.24±17.43 |
| 非感染性腹水组 | 41 | 30(73.17) | 52.00(22.00) | 36(87.80) | 5(12.20) | 100.00(49.00, 160.00)d | 43.00(0, 70.40)d | 3.83(2.66, 4.89)d | 0.16(0.11, 0.35)d | 62.06±11.46d |
| a：由于理论频数小于5，采用校正后的χ2分析；b：由于数据不服从正态分布，采用Kruskal-Wallis H检验；c：数据服从正态分布，采用单因素方差分析；d：P < 0.05, 与SBP1、SBP2、SBP3组进行多重比较 | ||||||||||
2.2 腹水培养
腹水培养结果显示：所有确诊SBP患者，腹水培养阳性21例(23.6%)，其中PMN≥250×106/L的SBP患者中培养阳性为10例(12.8%)。本研究腹水培养阳性的细菌分布：革兰阴性菌14例(67%)，其中大肠埃希菌9例、肺炎克雷伯菌3例、鲍曼不动杆菌1例、气单胞菌1例；革兰阳性菌7例(33%)，其中山脊链球菌2例，肺炎链球菌、藤黄葡萄球菌、中间葡萄球菌、链球菌属、棒状杆菌各1例。
2.3 血降钙素原水平和血常规中性粒细胞比例血降钙素原水平：在PMN≥250×106/L的患者中，培养阳性组显著高于培养阴性组[4.51(1.54, 8.46)vs 0.77(0.21, 1.69)，P < 0.05]；在PMN < 250×106/L的患者中，培养阳性组同样显著高于培养阴性组[0.40(0.31，0.94)vs 0.16(0.11，0.35)，P < 0.05]；3种类型SBP组降钙素原水平均显著高于非感染腹水组(P < 0.05)。血常规中性粒细胞比例显示同样的趋势，差异有统计学意义(P < 0.05，表 1)。
2.4 降钙素原与血常规中性粒细胞在3种类型SBP中的CUT-OFF值通过ROC曲线分别评估降钙素原与血常规中性粒细胞的诊断效能，其中SBP1组结果显示降钙素原的AUC值为0.963，95%CI(0.914~1.000)；血常规中性粒细胞的AUC值为0.878，95%CI(0.786~0.970)；二者差异有统计学意义(P < 0.05)；SBP2组结果显示降钙素原的AUC值为0.767，95%CI(0.618~ 0.916)；血常规中性粒细胞的AUC值为0.756，95%CI (0.622~0.890)；二者差异有统计学意义(P < 0.05)；SBP3组结果显示降钙素原的AUC值为0.714，95%CI(0.608~0.819)；血常规中性粒细胞的AUC值为0.669，95%CI(0.557~0.780)；二者差异有统计学意义(P < 0.05)，见图 2。
以约登系数最大点为诊断效能最佳界值的原则，获取降钙素原与血常规中性粒细胞比例的最佳界值分别为：SBP1组(0.795 ng/mL，68.45%)；SBP2组(0.265 ng/mL，62.65%)；SBP3组(0.405 ng/mL，65.00%)；并以该界值进行串联和并联，其诊断结果的ROC曲线分析如图 2。
2.5 降钙素原与血常规中性粒细胞水平联合诊断将两项指标进行串联试验和并联试验，其中SBP1组结果显示串联试验的AUC值为0.976，95%CI(0.935~1.000)，并联试验的AUC值为0.866，95%CI(0.769~0.963)；SBP2组结果显示串联试验的AUC值为0.865，95%CI(0.736~0.993)，并联试验的AUC值为0.659，95%CI(0.497~0.820)；SBP3组结果显示串联试验的AUC值为0.706，95%CI(0.601~ 0.811)，并联试验的AUC值为0.677，95%CI(0.565~ 0.789)。见图 2，表 2。
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| A：SBP1组；B：SBP2组；C：SBP3组 图 2 各组患者的降钙素原与中性粒细胞比例的受试者工作特征曲线分析 |
| 组别 | 诊断方式及最佳截断值 | 曲线下面积 | 敏感度(%) | 特异度(%) | 阳性预测值(%) | 阴性预测值(%) | 约登指数 |
| SBP1组 | 降钙素原≥0.795 ng/mL | 0.963(0.914~1.000) | 100.00 | 92.70 | 76.92 | 100.00 | 0.927 |
| 血常规中性粒细胞≥68.45% | 0.878(0.786~0.970) | 100.00 | 75.60 | 50.00 | 100.00 | 0.756 | |
| 串联诊断 | 0.976(0.935~1.000) | 100.00 | 95.10 | 83.33 | 100.00 | 0.951 | |
| 并联诊断 | 0.866(0.769~0.963) | 100.00 | 73.20 | 47.62 | 100.00 | 0.732 | |
| SBP2组 | 降钙素原≥0.265 ng/mL | 0.767(0.618~0.916) | 90.00 | 63.40 | 40.00 | 96.92 | 0.534 |
| 血常规中性粒细胞≥62.65% | 0.756(0.622~0.890) | 100.00 | 51.20 | 33.33 | 100.00 | 0.512 | |
| 串联诊断 | 0.865(0.736~0.993) | 90.00 | 82.90 | 56.25 | 94.44 | 0.729 | |
| 并联诊断 | 0.659(0.497~0.820) | 100.00 | 31.70 | 28.21 | 100.00 | 0.317 | |
| SBP3组 | 降钙素原≥0.405 ng/mL | 0.714(0.608~0.819) | 62.30 | 80.50 | 83.33 | 54.10 | 0.428 |
| 血常规中性粒细胞≥65.00% | 0.669(0.557~0.780) | 67.90 | 65.90 | 72.00 | 61.36 | 0.338 | |
| 串联诊断 | 0.706(0.601~0.811) | 50.90 | 90.20 | 87.10 | 47.44 | 0.411 | |
| 并联诊断 | 0.677(0.565~0.789) | 79.20 | 56.10 | 73.13 | 54.76 | 0.353 |
综合分析3组患者两项指标串联试验的ROC曲线下面积AUC值(点估计)和约登指数均高于并联试验，串联诊断分别为：SBP1组(PCT≥0.795 ng/mL且中性粒细胞比例≥68.45%)，SBP2组(PCT≥0.265 ng/mL且中性粒细胞比例≥62.65%)，SBP3组(PCT≥0.405 ng/mL且中性粒细胞比例≥65.00%)。
3 讨论晚期肝病患者易产生腹水，其会增加SBP、肝肾综合征等并发症的风险，可导致1、2年死亡率达到40%和50%[7]。SBP发生的机制尚不清楚，肠道菌群紊乱、有益菌比例降低、有害菌异常增生所致的细菌移位为其主要机制之一。SBP临床表现多样且不典型，诊断主要依靠腹水培养及腹水WBC或PMN计数，其中腹水培养仍被临床公认为“金标准”，但培养耗时且阳性率低，很难实现SBP的早期诊断和及时指导治疗监测。在我科前期研究中，腹水培养总体阳性率仅为6.8%[11]，本研究发现即使在PMN≥250×106/L的腹水患者中，培养阳性率仅为12.8%，低于国外文献[12]报道的26.7%。因此, 寻找快速、准确、易于临床实施的检测指标用于SBP的早期快速预警，可有效降低因漏诊或延误抗感染治疗而导致病情加重的风险。PCT是一种糖蛋白，在无感染情况下血中几乎不能检测到( < 0.05 ng/mL)，但在细菌感染时明显升高，而非细菌感染时不升高或轻微升高[10, 13]。本研究中腹水PMN≥250×106/L和PMN < 250×106/L人群中，培养阳性的患者PCT水平均显著高于培养阴性的患者。提示在SBP中PCT水平增高与腹水细菌感染密切相关，不论腹水细胞数是否达到诊断标准，均能有效鉴别细菌感染。
在临床常见腹水感染所致的3组类型SBP中，采用ROC评估血PCT的诊断能力，AUC值分别为0.963、0.767、0.714，与Fernández[14]报道的肝硬化人群PCT诊断能力一致(AUC:0.608~0.819)，其CUT-OFF值为0.5 ng/mL；本研究进一步区分PCT在3种类型SBP的CUT-OFF值分别为：培养阳性且PMN≥ 250×106/L组(0.795 ng/mL)，培养阳性但PMN < 250× 106/L组(0.265 ng/mL)，培养阴性但PMN≥250×106/L组(0.405 ng/mL)。Cekin等[12]研究也显示，PMN≥250×106/L的肝硬化腹水患者PCT诊断界值为0.42 ng/mL，而PMN≥250×106/L且培养阳性的SBP诊断界值为0.61 ng/mL，与我们的研究结果相符。朱龙川等[15]报道，血PCT在非多形核细胞性SBP中的诊断界值为0.43 μg/L。提示在不同类型的SBP，可能因感染程度或感染时期不同，对应的炎症反应指标水平有差异，临床需结合具体情况选择参考不同的CUT-OFF值。本研究中，SBP3组(腹水培养阴性但PMN≥250×106/L)血降钙素原特异度为80.50%、灵敏度62.30%，低于SBP1组和SBP2组(腹水培养阳性组)，说明血降钙素原在细菌培养阳性SBP组的特异性高于细菌培养阴性的SBP组，与之前研究中降钙素原诊断SBP的特异度和敏感度一致：朱龙川等[15]研究中特异度76.5%，敏感度70.0%；Cekin等[12]研究中，特异度50.0%，敏感度82.0%，略低于本研究。提示传统的培养方法可能受到腹水稀释、送检时间、培养条件等因素影响导致阳性率低，可考虑结合分子生物学等方法提高感染病原体检出率。
此外，本研究发现3种类型SBP患者血中性粒细胞比例显著高于非感染腹水组，通过ROC曲线分析获得其最佳CUT-OFF值分别为68.45%、62.65%、65.00%。血中性粒细胞比例在3种类型SBP的AUC值、特异性和阳性预测值均低于PCT，对应的最佳CUT-OFF值处于正常参考值范围内，以此作为感染诊断的依据稍显不足；但本研究提示当临床遇到培养条件受限或腹水量少穿刺困难等时，临床应结合实际情况，即使血中性粒细胞小于正常参考值上限(70%)，仍不能排除肝硬化患者合并SBP的可能性，可通过与降钙素原的联合提高对SBP患者的早期综合判断效能。
综上所述，慢性肝病患者合并SBP具有局部隐匿性感染的特殊性和复杂性，不同类型SBP感染时降钙素原的升高程度不同。通过对3组SBP患者人群的探索性分析，本研究发现血降钙素原和血常规中性粒细胞比例在SBP中具有一定的预警效果和诊断价值，不同类型SBP其CUT-OFF值不同，临床可根据实际情况综合分析。但由于本研究为回顾性分析，且样本量较小，对于肝病患者不同疾病阶段、发生SBP不同时相点，血浆PCT的变化尚需要进行大样本前瞻性研究。
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