2. 614000 四川 乐山,四川武警总队乐山医院神经外科
2. Department of Neurosurgery, Leshan Hospital of Sichuan Provincial Armed Police Corps, Leshan, Sichuan Province, 614000, China
Zhu Gang, E-mail:gangzhu6666@sina.com
缺血性脑卒中是最常见的神经系统疾病之一,占脑血管疾病的70%[1],致死、致残率高,给家庭和社会带来巨大的精神和经济负担[2]。近年来针对缺血性脑卒中的研究已成为神经科学研究的热点,但其病理机制及干预靶点仍不清楚,临床上缺乏有效治疗手段。
米诺环素是半合成第2代四环素类衍生物,具有抗炎、杀菌功效,作为抗生素已广泛使用于临床[3]。米诺环素易透过血脑屏障的特性备受神经科学研究者青睐。近年大量研究证实米诺环素在脑出血[4]、脑外伤[5]等多种神经系统疾病中具有神经保护效应。Tang等[3]发现米诺环素可通过内源性大麻素受体激活,调控小胶质细胞从M1型(细胞毒)向M2型(神经保护)转换,改善新生儿脑出血后神经功能障碍。项目组前期研究发现米诺环素能显著抑制新生儿脑出血后小胶质细胞增殖、炎症因子释放的脑继发损伤因素[3];Yrjänheikki等[6]通过动物实验及离体细胞培养首次证实米诺环素可减少MCAO诱导的大鼠神经元凋亡,但米诺环素的治疗靶点及相关分子机制仍不清楚。研究证实激活后的M1型小胶质细胞是神经炎症的主要参与者,分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6, IL-6) 等多种神经炎症因子,促进周围神经细胞凋亡,加重脑损伤;M2型小胶质细胞可分泌脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors -1, IGF)等神经保护因子,促进神经元修复从而发挥神经保护作用。
核转录因子Kappa B(nuclea factor-kappa B, NF-κB)是多种炎症介质的关键调节蛋白,其中发挥主要生理功能的是两个亚基蛋白P50与P65,两者构成二聚体[7]。NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)的磷酸化降解是NF-κB激活的主要途径。近期研究证实NF-κB可调控NLRP炎症小体激活参与缺血性脑卒中后继发脑损伤,是细胞凋亡的主要调控途径之一[8]。
本研究拟通过MCAO模型观察大鼠缺血后早期脑梗死面积、神经元凋亡、小胶质细胞形态变化以及学习记忆功能改变,探讨米诺环素在大鼠局灶性短暂性脑缺血后脑损伤早期神经保护作用及可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 试剂与器材主要试剂:米诺环素(Minocycline, 美国Sigma), TUNEL试剂盒(11684817910-50T,美国罗氏公司),组织包埋剂(O.C.T Compound-4583,日本樱花公司), 兔抗大鼠Iba-1一抗(Wako, Japan)、小鼠抗大鼠CD206一抗( & SYSTEMS)。仪器:冰冻切片机(CM1860UV, 德国徕卡公司),手术显微镜(Pico,德国卡尔蔡司公司),激光共聚焦显微镜(Zeiss, Germany),电子天平(赛多利斯仪器系统有限责任公司),舒锐无菌胰岛素注射器(29G,美国BD公司)。
1.2 大鼠MCAO模型制备清洁级健康成年雄性Sprague-Dawl (SD)大鼠128只,体质量250~300 g,由第三军医大学实验动物中心提供(SCXK(渝)2012-0003)。按本课题组既往方法建立SD大鼠脑局灶性脑缺血模型(MCAO),简述如下:大鼠以0.5 mL/100 g的剂量,腹腔注射5%水合氯醛麻醉。大鼠颈部备皮,手术剪剪开皮肤,钝性分离肌肉及筋膜,暴露左侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉,结扎颈总动脉近心端、颈外动脉,动脉夹夹闭颈内动脉。在距颈总动脉分叉约10 mm处剪一小口,将备好的线栓从小口插入,轻轻扎紧备线。移开颈内动脉上的动脉夹,将线栓缓慢推入,注意用力轻柔。当插线遇阻力时(约距颈总动脉分叉处1.6~1.9 cm处),停止插线并夹闭,此时“线栓”的前端已到达大脑中动脉起始部并阻断大脑中动脉血液供应,扎紧备线,并剪去血管外的线栓,逐层缝合切口。
1.3 实验分组及给药实验室适应性喂养大鼠3 d后分为对照组(假手术组,n=16) 和6 h脑缺血组(MCAO 6 h组,n=28),24 h脑缺血组(MCAO 24 h组,n=28),6 h脑缺血+米诺环素治疗组(MCAO 6 h+米诺环素组,n=28) 以及24 h脑缺血+米诺环素治疗组(MCAO 24 h+米诺环素组, n=28)。大鼠MCAO术后15 min给予腹腔注射米诺环素(45 mg/kg),12 h后22.5 mg/kg维持剂量,1次/12 h,维持72 h。术后28 d行水迷宫实验(Morris Water Maze, n=10), 术后72 h行TTC染色(n=6)、RT-PCR(n=6)、TUNEL染色(n=6)、尼氏染色(n=6) 以及免疫荧光双标(n=6) 和Western blot(n=6) 实验。若大鼠造模后死亡,补充至实验设计数量。
1.4 TTC染色观察脑梗死面积术后72 h,每组随机选取6只大鼠,使用10%水合氯醛(5%,7 mL/kg)深度麻醉后,迅速断头取脑并去掉小脑和低位脑干并将脑组织置于-20 ℃冰箱快速冷冻15 min。自额极后2 mm开始向后每间隔2 mm做大脑连续冠状切片8片,将脑片置于2%TTC(生理盐水配置,pH 7.4~7.6) 中,避光37%恒温孵育30 min。整理脑片,数码相机拍照后使用Image J图像分析软件进行梗死体积测量。使用GraphPad prism 6软件整理、分析数据。
1.5 TUNEL细胞凋亡及尼氏染色大鼠脑片制备按照项目组前期研究所列模型制作后72 h,水合氯醛(5%, 7 mL/kg)麻醉各组大鼠,250 mL生理盐水(0.9%NaCl)心内灌注排净血液,换用预冷4%多聚甲醛250 mL体内循环固定,再取脑置于中内固定24 h,后转入4%多聚甲醛30%蔗糖脱水至沉底。OCT(Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA)包埋脑组织后,使用冰冻切片机(Leica, CM1860UV)切18 mm脑片,37 ℃恒温箱烤干备用。TUNEL染色严格按照罗氏TUNEL说明书(Roche, 06432344001) 步骤进行。尼氏染色大体步骤如下:0.1 g焦油紫、1%冰醋酸、99 mL蒸馏水配置焦油紫染液,将18 mm脑片浸入氯仿,无水酒精,90%、75%酒精各1 min,再蒸馏水洗净,浸入备用焦油紫染液30 min,使用95%酒精分色后常规脱水、透明、封片。荧光显微镜(Zeiss, Germany)拍照,观察病灶周围神经元的变化。Image-J软件分析20倍镜下阳性细胞数(n=6,每个脑组织隔10张片取1张观察,并获取病灶周围4个视野,求平均值)。
1.6 免疫荧光染色取假手术组、MCAO 6 h组以及MCAO 6 h米诺环素治疗组脑组织冰冻切片经0.5% Triton X-100室温穿膜1 h, 小牛血清白蛋白37 ℃封闭1 h,兔抗大鼠Iba-1一抗(Wako, 日本,1∶500)、小鼠抗大鼠CD206一抗( & SYSTEMS, 1∶200)-4 ℃孵育过夜,山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(1∶500) 37 ℃孵育1 h后DAPI染核,封片,使用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss, LSM780, 德国)观察。
1.7 Western blot检测蛋白表达用Western blot检测NF-κB的表达变化。参照碧云天蛋白提取试剂盒(Beyotime, P0028) 操作说明提取总蛋白,采用BCA测定浓度。将各组组织样品的蛋白浓度调整一致后,各取50 μg上样进行SDS-PAGE,电泳完毕转膜,PVDF膜以含5%脱脂奶粉的TBST液室温封闭4 h,加兔抗大鼠NF-κB p65一抗(Beyotime,AF0246,1∶1 000)4 ℃孵育过夜,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000) 室温孵育1 h,漂洗后ECL法显色,并采用凝胶成像系统(Bio-Rad, Hercules,CA,USA)扫描。Image J图像分析软件分析光密度值。蛋白水平由目的条带与内参β-actin的平均光密度比值表示,重复实验3次。
1.8 Morris水迷宫实验观察学习记忆能力采用Morris水迷宫检测大鼠学习和记忆能力, 具体方法参照文献[9]。Morris水迷宫(RD1101-MWM,上海欣软信息科技有限公司)为直径2 m的圆形水池,水深30 cm,等分为4个象限并将水温调至24 ℃。从手术结束后第28天开始,连续4 d共8次对大鼠进行训练,将大鼠由东、西、南、北4个入水点面向池壁放入水中,记录大鼠寻找并爬上平台所需时间。如果大鼠在120 s内仍未找到平台,则将其引至平台。手术后32 d对大鼠进行测试,将大鼠从第2象限入水点放入水槽,记录120 s内其穿越目标平台的轨迹图、穿越目标平台所在位置次数以及平台所在象限百分比。图像采集系统自动记录并分析逃避潜伏期和游泳总路程。
1.9 统计学分析数据均以x±s表示,采用SPSS 17.0统计软件对脑缺血面积、阳性细胞数以及行为学实验数据行正态分布和方差齐性检查,数据比较采用两独立样本t检验。部分数据分析使用GraphPad Prism 6.01软件。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 米诺环素对缺血性脑损伤早期大鼠脑梗死体积影响MCAO 6 h后米诺环素治疗组脑梗死体积较手术组显著减少(P<0.05);MCAO术后24 h给予米诺环素治疗对大鼠脑梗死体积改善差异无统计学意义(P>0.05),显示早期米诺环素治疗可减缓脑缺血的进一步发生(图 1)。
2.2 米诺环素对大鼠缺血性脑损伤神经细胞凋亡的影响
MCAO后脑缺血组织周围TUNEL阳性细胞以及尼氏染色阳性细胞密集分布,MCAO 6 h后腹腔注射米诺环素可显著减少TUNEL阳性细胞(P<0.01,图 2)以及尼氏染色阳性细胞数(P<0.01,图 3)。MCAO 24 h后腹腔注射米诺环素能减少缺血脑组织周围TUNEL阳性细胞数(P<0.05),但对尼氏染色阳性细胞数减少差异无统计学意义(P>0.05,图 3)。
2.3 米诺环素对大鼠早期脑缺血周围脑组织小胶质细胞形态的影响
使用免疫荧光双标技术检测脑组织小胶质细胞形态。假手术组大鼠脑组织小胶质细胞多呈分支状,早期MCAO大鼠脑组织小胶质细胞多成阿米巴样(类圆形巨噬细胞形态,少分支)。MCAO 6 h后给予米诺环素腹腔注射显著增加了M2型(CD206阳性)细胞数(P<0.01)。RT-PCR检测M1型小胶质细胞(CD68) 以及M2型小胶质细胞(CD206) mRNA表达情况,发现早期MCAO大鼠脑组织CD68 mRNA水平较假手术组显著增加(P<0.01),CD206 mRNA水平较假手术组减少(P<0.01),MCAO 6 h后米诺环素治疗促进了小胶质细胞由M1型向M2型转换(图 4)。
2.4 米诺环素对凋亡通路NF-κB蛋白表达的影响
大鼠早期MCAO后凋亡通路调控蛋白NF-κB的表达较假手术组显著提高(P<0.05)。MCAO 6 h后给予米诺环素腹腔注射能显著减少脑组织NF-κB的表达(P<0.01),但在术后24 h给予治疗,米诺环素对NF-κB表达的影响差异无统计学意义(P>0.05,图 5)。
2.5 米诺环素对大鼠学习记忆能力的影响
MCAO 28 d后大鼠在Morris水迷宫实验中穿越站台次数较假手术组显著减少(P<0.01),在第三象限路程百分比较假手术组亦减少(P<0.01);MCAO 6 h给予米诺环素治疗可显著增加大鼠穿越平台次数(P<0.05),增加大鼠在第三象限的路程百分比(P<0.01);MCAO 24 h后米诺环素治疗对大鼠学习记忆能力影响差异无统计学意义(P>0.05,图 6)。
3 讨论
近年来大量研究聚焦于缺血性脑卒中的干预靶点,力求为临床治疗提供有力证据[10-11]。本研究使用线栓法制备大鼠MCAO模型,模拟临床缺血性脑卒中的病理生理特点,通过缺血后大鼠学习记忆能力评估、脑梗死体积比较以及小胶质细胞形态检测等实验,发现大鼠MCAO 6 h后给予米诺环素治疗能显著改善大鼠远期学习记忆能力,抑制缺血面积进一步增加。进一步发现,米诺环素在大鼠早期MCAO后发挥神经保护效应的细胞、分子机制包括:① 通过促进缺血周围激活的小胶质细胞从细胞毒性(M1型)向神经保护型(M2型)转换;② 米诺环素显著抑制MCAO早期激活的细胞凋亡分子NF-κB信号通路。
长期以来,米诺环素被认为是小胶质细胞抑制剂,抑制金属基质蛋白(MMP)的表达,从而发挥神经保护效应。大量研究表明米诺环素在多种神经系统疾病中具有抗氧化、抗细胞凋亡以及抗炎效应,如出血性卒中、脑外伤以及神经退行性疾病如帕金森病、亨廷顿病等[12]。据此,本研究发现缺血性脑卒中后早期使用米诺环素治疗,疗效更佳,随着缺血时间增加,脑组织缺血体积有进一步增加趋势,米诺环素将难以改善大鼠远期学习记忆能力(缺血半暗带神经细胞不可逆转坏死)。
小胶质细胞激活是神经系统病理状态时脑组织自身免疫激活的主要表现形式[13]。前期研究证实小胶质细胞大体分为M0、M1、M2三型,其中后两者是激活后的主要表现形式,具有不同的特异性蛋白分子表达[14-15]。本研究通过对M1型(CD68) 以及M2型(CD206) 小胶质细胞的形态分析,证实米诺环素能减少早期MCAO介导的M1型小胶质细胞,并增加具有神经保护作用的M2型小胶质细胞特异性蛋白-CD206的表达。NF-κB信号通路是神经炎症的主要调控机制,是缺血性脑卒中病理发展过程的关键调控环节[7]。NF-κB的磷酸化促使神经元细胞膜NF-κB异二聚体P65/P50核转录移位,从而导致细胞凋亡[16]。本研究发现MCAO早期使用米诺环素可显著抑制NF-κB表达,减少TUNEL阳性凋亡细胞数。
综上所述,缺血性脑卒中伴有明显学习记忆能力降低,与脑梗死体积、神经元凋亡以及神经炎症等多种病理生理机制相关,其干预靶点众多。米诺环素是临床常用抗生素,但在缺血性脑卒中的应用仍需大量的基础研究支持。本研究通过MCAO动物模型研究发现米诺环素可通过促进小胶质细胞从神经毒型向神经保护型转换,抑制凋亡分子NF-κB等机制,减少脑缺血体积及细胞凋亡,从而改善大鼠远期学习记忆能力,为米诺环素在缺血性脑卒中的转化应用提供理论依据。
[1] |
王拥军, 张苏明. 中国缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作二级预防指南2010[J].
中华神经科杂志, 2010, 43(2): 154–160.
Wang Y J, Zhang S M. Guidelines for the second level prevention of ischemic stroke and transient ischemic attack in China 2010[J]. Chin J Neurol, 2010, 43(2): 154–160. DOI:10.3760/cma.j.issn.1006-7876.2010.02.023 |
[2] | Chamorro á, Dirnagl U, Urra X, et al. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation[J]. Lancet Neurol, 2016, 15(8): 869–881. DOI:10.1016/S1474-4422(16)00114-9 |
[3] | Tang J, Chen Q, Guo J, et al. Minocycline Attenuates Neonatal Germinal-Matrix-Hemorrhage-Induced Neuroinflammation and Brain Edema by Activating Cannabinoid Receptor 2[J]. Mol Neurobiol, 2016, 53(3): 1935–1948. DOI:10.1007/s12035-015-9154-x |
[4] | Wu Z, Zou X, Zhu W, et al. Minocycline is effective in intracerebral hemorrhage by inhibition of apoptosis and autophagy[J]. J Neurol Sci, 2016, 371: 88–95. DOI:10.1016/j.jns.2016.10.025 |
[5] | Lopez-Rodriguez A B, Siopi E, Finn D P, et al. CB1 and CB2 cannabinoid receptor antagonists prevent minocycline-induced neuroprotection following traumatic brain injury in mice[J]. Cereb Cortex, 2015, 25(1): 35–45. DOI:10.1093/cercor/bht202 |
[6] | Yrjänheikki J, Tikka T, Keinänen R, et al. A tetracycline derivative, minocycline, reduces inflammation and protects against focal cerebral ischemia with a wide therapeutic window[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96(23): 13496–13500. DOI:10.1073/pnas.96.23.13496 |
[7] | Ridder D A, Schwaninger M. NF-kappaB signaling in cerebral ischemia[J]. Neuroscience, 2009, 158(3): 995–1006. DOI:10.1016/j.neuroscience.2008.07.007 |
[8] | Fann D Y, Lim Y A, Cheng Y L, et al. Evidence that NF-κB and MAPK Signaling Promotes NLRP Inflammasome Activation in Neurons Following Ischemic Stroke[J]. Mol Neurobiol, 2017. DOI:10.1007/s12035-017-0394-9 |
[9] |
张渊, 张建波, 唐俊, 等. 900MHz电磁辐照对大鼠学习记忆能力和血脑屏障通透性的影响[J].
第三军医大学学报, 2014, 36(3): 217–221.
Zhang Y, Zhang J B, Tang J, et al. Continuous exposure to 900 MHz electromagnetic field alters spatial memory and blood-brain barrier permeability in rats[J]. J Third Mil Med Univ, 2014, 36(3): 217–221. |
[10] | Stetler R A, Leak R K, Gan Y, et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance[J]. Prog Neurobiol, 2014, 114: 58–83. DOI:10.1016/j.pneurobio.2013.11.005 |
[11] | Dirnagl U, Simon R P, Hallenbeck J M. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection[J]. Trends Neurosci, 2003, 26(5): 248–254. DOI:10.1016/S0166-2236(03)00071-7 |
[12] | Zemke D, Majid A. The potential of minocycline for neuroprotection in human neurologic disease[J]. Clin Neuropharmacol, 2004, 27(6): 293–298. DOI:10.1097/01.wnf.0000150867.98887.3e |
[13] | Murray P J, Wynn T A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets[J]. Nat Rev Immunol, 2011, 11(11): 723–737. DOI:10.1038/nri3073 |
[14] | Lee J H, Wei Z Z, Cao W, et al. Regulation of therapeutic hypothermia on inflammatory cytokines, microglia polarization, migration and functional recovery after ischemic stroke in mice[J]. Neurobiol Dis, 2016, 96: 248–260. DOI:10.1016/j.nbd.2016.09.013 |
[15] | Hu X, Li P, Guo Y, et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia[J]. Stroke, 2012, 43(11): 3063–3070. DOI:10.1161/STROKEAHA.112.659656 |
[16] | Hayden M S, Ghosh S. Shared principles in NF-kappaB signaling[J]. Cell, 2008, 132(3): 344–362. DOI:10.1016/j.cell.2008.01.020 |