肺癌是世界范围内因恶性肿瘤致死的第一要因[1]，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占85%~90%[2]。随着对肿瘤分子生物学和基因水平研究的深入，分子靶向治疗取得了革命性进展。表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)，如吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)，已成为EGFR敏感突变(19外显子缺失和/或21外显子突变)晚期NSCLC的标准一线治疗方案，明显延长了患者的无进展生存期(progress-free survival，PFS)并提高了生活质量[3-4]。然而，临床治疗有效的患者终将产生耐药，出现疾病进展[5]。因此，NSCLC EGFR-TKIs继发耐药已成为亟待解决的问题，所以深入探讨并阐明继发耐药的发生机制对克服耐药有着重大意义。
近年来，NSCLC EGFR-TKIs继发耐药机制的研究一直是相关领域的热点，并取得了重大突破。目前已明确的原因有T790M点突变[5]、MET基因扩增[6]、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)过表达[7]等，但仍有部分患者发生继发耐药的原因尚不清楚。NEDD4(neural precursor cell expressed developmentally protein 4) 家族是一类具有E3泛素连接酶活性的蛋白质，通过影响多种肿瘤相关信号通路在肿瘤进展中发挥重要作用[8]。本课题组前期工作发现，NSCLC厄洛替尼耐药细胞中NEDD4的表达明显高于敏感细胞，但其在NSCLC厄洛替尼继发耐药的过程中是否发挥作用尚不清楚。故本研究选取了对EGFR-TKIs敏感的EGFR 19外显子缺失突变型的HCC827肺腺癌细胞株，以及前期实验室诱导出的厄洛替尼获得性耐药细胞(HCC827/ER)作为细胞模型，探讨NEDD4在NSCLC厄洛替尼耐药中的作用及其可能机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人肺腺癌HCC827细胞株购于美国标准菌库；获得性耐药细胞株(HCC827/ER)由本实验室韩静[9]博士利用HCC827细胞在大剂量厄洛替尼(1~5 μmol/L)冲击诱导并低剂量厄洛替尼(0.01 μmol/L)维持培养8个月的条件下获得。
1.1.2 主要试剂RPMI1640培养基、TBD标准胎牛血清(购于上海拜力生物科技公司)；盐酸厄洛替尼(购于上海安格化工有限公司)；RNA提取、反转录及荧光实时定量PCR试剂盒(均购于TaKaRa公司)；蛋白提取、BCA蛋白浓度测定、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒(均购于江苏碧云天生物技术有限公司)；CCK-8(Cell Counting Kit 8) 细胞毒性检测试剂盒(购于上海东仁化工科技有限公司)；h_NEDD4单基因siRNA套装B(购于广州锐博生物科技有限公司)；siNEDD4的慢病毒(合成并购自于上海汉恒生物科技有限公司)。一抗：GAPDH(购于武汉三鹰生物技术有限公司), NEDD4、Akt、p-Akt(购于美国Cell signaling technology公司)；二抗：山羊抗兔及山羊抗鼠辣根过氧化物酶(均购于武汉博士德生物工程有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养HCC827及HCC827/ER细胞均培养由全血清培养基(90% RPMI1640培养基加10%标准胎牛血清和100 U/mL的青霉素-链霉素溶液制成)培养，置于5%CO2、37 ℃恒温孵箱中培养，HCC827/ER细胞的培养液加0.01 μmol/L的厄洛替尼。
1.2.2 CCK-8法检测厄洛替尼对细胞的影响将目的细胞以4.5×103/孔的细胞量均匀铺种于96孔板，待细胞贴壁后。在含0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L厄洛替尼的培养基中培养48 h(每组设有3个复孔)。然后以CCK-8法检测细胞生长情况，即各孔均加入无血清培养基和CCK-8液配制成的混合液(体积比9: 1)100 μL，室温孵育30 min后，在酶标仪中检测450 nm波长处的光密度值[D(450)]。并按如下公式计算肿瘤细胞的生存分数，利用GraphPad Prism 5.0计算IC50值并绘制药物浓度-生存分数曲线图。
1.2.3 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)
按试剂盒说明书抽提目的总RNA，测定总RNA浓度和纯度，并按TaKaRa反转试剂盒说明书进行反转录获得cDNA后，在Real-time PCR仪(ABI7500) 上进行扩增检测。扩增引物：NEDD4(上游：5′-GGTGGAGGTGTTCGGGCT-3′下游：5′-GCAAGGCCTATTCCGGCTA-3′)；β；CAAGG(上游：5′-GCGAGCACAGAGCCTCGCCTT-3′下游：5′-CATCATCCATGGTGAGCTGGCGG-3′)。扩增条件：95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s，共40个循环。数据采用2-△△Ct法进行分析。
1.2.4 Western blot检测按试剂说明书提取目的细胞总蛋白。用BAC试剂盒测总蛋白浓度，加入1/4体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，于沸水中浸5 min至充分变性。在10%的SDS-PAGE凝胶中进行电泳(上层胶80 V 40 min，下层胶120 V 90 min)，之后用200 mA 90 min恒流湿转到PVDF膜上。PVDF膜经5%BSA室温封闭1 h后，置于相应稀释好的抗体NEDD4(1: 1 000)、Akt(1:500)、p-Akt (1: 1 000)、GAPDH(1:1 000)4℃孵育过夜。翌日取出PVDF膜复温30 min，TBST溶液洗涤3次(每次5 min)后，于对应种属辣根过氧化物酶标记的二抗(1: 5 000) 中孵育1 h，再以TBST溶液洗膜3次后滴加显影剂，并在凝胶成像分析仪上曝光。
1.2.5 转染HCC827/ER细胞实验分为敲减组和阴性组，因h_NEDD4单基因siRNA套装B中siNEDD4共有3个序列，故敲减组标为siNEDD4#1、siNEDD4#2、siNEDD4#3。将HCC827/ER细胞以5×105/孔接种6孔板, 轻轻摇动使其均匀分布。贴壁后按siRNA产品说明书，对HCC827/ER细胞进行转染。24 h后检测RNA水平敲减效率，48 h后检测蛋白水平的敲减效率。
1.2.6 裸鼠成瘤实验裸鼠(雌性，4~6周龄)购于中国医学科学院(北京)，置于SPF层流室饲养，室温控制在(22±2)℃，湿度低于40%。裸鼠共分为4组，每组3只。分别将HCC827、HCC827/ER、HCC827/ER-EV、HCC827/ER-siNEDD4细胞1×106/只接种于各组小鼠左侧腋下，6~9 d后，可观察到明显瘤体。肿瘤体积达100~150 mm3后，予厄洛替尼(60 mg/kg，1次/d)灌胃2周后，处死小鼠，观察肿瘤生长情况。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行，计量资料数据以x±s表示。两组均数比较采用t检验。分析数据及绘制图形应用GrapPad Prism 5.0软件。
2 结果 2.1 HCC827和HCC827/ER细胞对厄洛替尼的敏感性随着厄洛替尼浓度的增加，传代培养的HCC827细胞及本实验室前期诱导的获得性耐药HCC827/ER细胞的生存分数均有不同程度的下降(图 1)。在厄洛替尼物质的量浓度为0.01~10 μmol/L区间内，暴露在相同浓度时，HCC827细胞的生存分数明显低于HCC827/ER细胞。经计算，厄洛替尼对HCC827/ER的IC50值为(11.6±0.90)μmol/L，对HCC827细胞的IC50值(0.10±0.12)μmol/L，差异具有统计学意义(P＜0.01)。HCC827/ER细胞的耐药指数为(118.23± 23.77)。提示HCC827/ER细胞对厄洛替尼明显耐药。
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| a: P＜0.05；b: P＜0.01，与HCC827/ER比较 图 1 不同物质的量浓度厄洛替尼对HCC827细胞及HCC827/ER细胞生存分数的影响(n=3, x±s) |
2.2 NEDD4以及AKT、p-AKT在HCC827及HCC827/ER中的表达
因厄洛替尼在0.01 μmol/L时对HCC827及HCC827/ER细胞的影响开始出现差异，故本实验均以0.01 μmol/L厄洛替尼处理各组细胞，观察NEDD4以及Akt、p-Akt的表达差异。qPCR结果显示，NEDD4 mRNA在HCC827/ER细胞中的表达是HCC827细胞的(2.33±0.12) 倍(n=3，P＜0.05)。Western blot检测结果显示，HCC827/ER细胞中NEDD4蛋白表达量较HCC827细胞明显升高；p-Akt蛋白表达也提高显著(图 2)。提示NEDD4表达增高可能是通过活化PI3K/Akt信号通路，促进HCC827/ER厄洛替尼耐药的发生。
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| 1: HCC827; 2: HCC827/ER 图 2 0.01 μmol/L厄洛替尼处理48 h后两种细胞中NEDD4、AKT及p-AKT的表达 |
2.3 敲低NEDD4在HCC827/ER细胞中的表达
qPCR结果显示，与阴性对照组相比，3个敲减组NEDD4 mRNA相对表达量均有下降，siNEDD4#2、siNEDD4#3更为显著(图 3A)。Western blot检测结果显示，siNEDD4#3能显著敲低NEDD4蛋白表达水平(图 3B)。故后续实验以siNEDD4#3的序列构建慢病毒，进而构建稳定的NEDD4低表达的HCC827/ER细胞。
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1~4分别为阴性对照组、siNEDD4#1组、siNEDD4#2组、siNEDD4#3组 A：qPCR检测mRNA表达(n=3，x±s) a:P＜0.05，与阴性对照组比较；B：Western blot检测蛋白表达 图 3 检测HCC827/ER细胞NEDD4的敲减效率 |
2.4 敲低NEDD4增加HCC827/ER细胞对厄洛替尼的敏感性
在厄洛替尼浓度为0.01~100 μmol/L区间内，相同浓度的厄洛替尼对NEDD4敲减组(siNEDD4#3) 细胞的抑制率明显高于阴性对照组(图 4)。厄洛替尼对NEDD4敲减组细胞的IC50值为(0.72±0.12)μmol/L，明显低于其对阴性对照组细胞的IC50值(13.88±1.96)μmol/L(P＜0.05)，提示敲低NEDD4的表达能明显增加HCC827/ER细胞对厄洛替尼的敏感性。
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| a:P＜0.05；b:P＜0.01，与阴性对照组比较 图 4 不同物质的量浓度厄洛替尼对各转染组细胞生存分数的影响(n=3，x±s) |
2.5 敲低NEDD4改善耐药性机制探讨
为探索敲低NEDD4表达改善HCC827/ER细胞耐药的机制，在siNEDD4转染HCC827/ER细胞后，检测NEDD4、Akt及p-Akt蛋白的表达(图 5)。结果显示，转染siNEDD4的HCC827/ER细胞中，NEDD4和p-Akt蛋白的表达较阴性对照组细胞都有明显的降低。提示敲低NEDD4从而增加HCC827/ER细胞对厄洛替尼的敏感性是通过降低PI3K/Akt信号通路的活性来实现的。
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| 1：阴性对照组；2：siNEDD4#3组 图 5 抑制NEDD4的表达后NEDD4、Akt、pAkt蛋白的变化 |
2.6 敲低NEDD4增强肿瘤对厄洛替尼的敏感性，并增加裸鼠的治疗获益
为进一步验证敲低NEDD4能增强肿瘤细胞对厄洛替尼的敏感性，将目的细胞接种于裸鼠(图 6), HCC827组[(4.7±0.6) mm]肿瘤直径显著低于HCC827/ER组[(11.0±2.6) mm, P＜0.05], HCC827/ER-siNEDD4组[(5.7±0.6) mm]肿瘤直径也显著低于HCC827/ER-EV组[(10.3±2.5) mm, P＜0.05]。说明厄洛替尼能明显抑制HCC827细胞组肿瘤的生长。HCC827/ER-siNEDD4组肿瘤生长较HCC827/ER-EV组也受到了明显抑制。
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 :示肿瘤结节
图 6
厄洛替尼抑制NEDD4敲低组小鼠肿瘤增长的大体观察
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3 讨论
NEDD4是E3泛素连接酶家族的重要成员，在前列腺癌、膀胱癌、结肠癌以及乳腺癌等多种肿瘤组织中均有异常表达[8, 10-11]。AMODIO等[12]对103例原发性NSCLC标本进行检测，发现82例NEDD4表达增强，且其表达水平与肿瘤远处转移呈正相关。提示其异常表达与肿瘤的发生与进展有着密切的关系。但其与肿瘤耐药的关系鲜有报道。本实验通过对比HCC827和HCC827/ER细胞中NEDD4 mRNA及蛋白表达，发现HCC827/ER细胞中NEDD4 mRNA和蛋白表达明显高于其亲本细胞。敲低NEDD4在HCC827/ER细胞中的表达后，HCC827/ER细胞对厄洛替尼的敏感性获得明显提高。活体实验也证实敲低HCC827/ER细胞中NEDD4的表达能够明显增加厄洛替尼对荷瘤小鼠的治疗获益。提示NEDD4的表达增高是HCC827/ER细胞厄洛替尼继发耐药的一个重要原因。
NEDD4具有E3泛素连接酶活性，可通过蛋白质泛素化途径降解多种蛋白, 从而发挥其生物学功能。有研究表明，NEDD4通过泛素化降解LATS1(large tumour suppressor kinase 1，LATS1)，使YAP1的表达增高，从而调节Hippo信号通路的活性[13]。WANG等[14]指出，NEDD4促进PTEN多泛素化降解，致使PI3K/PTEN/Akt信号通路活化，发挥其促肿瘤功能。也有报道称NEDD4能与衔接蛋白Grb10结合，从而调节IGF-1/PI3K/Akt信号通路的活性[15]。CAO等[16]发现NEDD4-/-的小鼠因IGF-1的降低而生长迟滞，更进一步证明了NEDD4是通过调节IGF-1的表达来调控细胞增殖、生长、分化及迁移的。本课题组前期研究结果显示[9, 17-18]，IGF-R、YAP1的增高和PTEN降低均是NSCLC厄洛替尼继发耐药的重要原因。但NEDD4是通过何种途径促进NSCLC厄洛替尼继发耐药仍需进一步探讨。本研究结果显示，在NEDD4高表达的HCC827/ER细胞中，其PI3K/Akt信号通路的活性也较HCC827细胞中明显增高，抑制NEDD4的表达后，PI3K/Akt通路活性随之下降，提示NEDD4促进NSCLC厄洛替尼继发耐药是通过PI3K/Akt通路活化实现的。后续的研究我们将围绕NEDD4是通过何种途径促使PI3K/Akt通路活化展开，进一步阐明NEDD4促进NSCLC继发厄洛替尼耐药的分子机制。
YE等[19]提出，NEDD4调节着诸多肿瘤发生与进展相关的信号通路，是一个很有前景的肿瘤治疗的靶点。本实验证实，NEDD4高表达在NSCLC厄洛替尼继发耐药中发挥着重要作用，抑制NEDD4的表达能够显著提高NSCLC对厄洛替尼的敏感性。因此，NEDD4可以作为克服NSCLC厄洛替尼继发耐药的一个靶点。聚焦NEDD4的调节，也将为克服耐药打开新的思路，同时也为NSCLC患者的个体化治疗提供指导性建议。
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