新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是早产儿和低出生体质量新生儿最常见的胃肠道病症，病死率较高，存活患儿遗留不同程度后遗症。早产儿肠道屏障功能不成熟，肠道菌群异常定植，菌群及其产物通过模式识别受体(microbial-associated molecular patterns，MAMPs)被肠道上皮Toll样受体识别，并使其活化，启动一系列信号转导途径，导致细胞因子和趋化因子的产生(如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8以及PAF等因子)，促进炎症发生，加重肠道损伤[1-2]。
Syndecan-1可维持肠道紧密连接完整性。在损伤和炎症时，上皮细胞的Syndecan-1蛋白水平下调，其胞外域游离蛋白增多，游离HS链可通过抑制白细胞的黏附，参与炎症[3]。Syndecan-1HS链的脱落是一个依赖金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7) 的过程。而IL-1β通过细胞内信号转导可增强MMP-7的表达[4]，TNF-α可以诱导细胞IL-1β的产生。
那么Syndecan-1在新生大鼠发生坏死性小肠结肠炎时表达有何变化？研究表明生后1~2周的早产儿肠道中双歧杆菌缺失，而补充双歧杆菌可以降低NEC的发生率[5]。但是双歧杆菌保护NEC肠道炎症的具体机制不清楚。有研究表明双歧杆菌通过调节紧密连接而改善肠道通透性[6]，但是，双歧杆菌如何调节Syndecan-1目前研究较少。
本研究采用新生大鼠NEC模型，双歧杆菌治疗NEC模型，检测TNF-α、IL-1β、MMP-7和Syndecan-1的表达，探究在NEC肠道损伤时，Syndecan-1在其中的意义，以及双歧杆菌的保护作用，为双歧杆菌治疗NEC提供进一步理论支持。
1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂与仪器30只清洁级新生1 d龄SD大鼠，购自重庆医科大学实验动物中心，雌雄不限，体质量5~10 g。雅培加营素蛋白质粉购自美国雅培公司，多美滋婴儿配方奶粉购自法国多美滋公司，中/长链脂肪乳注射液(C6-24)购自华瑞制药有限公司。E-coli O55：B5脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自美国Sigma公司。Syndecan-1(ab34164) 单克隆抗体购自美国Abcam公司，山羊抗小鼠二抗购自中杉金桥公司，DAB显色试剂盒购自中杉金桥公司，各相关因子引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。RNA提取试剂盒美国Promega试剂盒，购自重庆荣达生物技术有限公司。反转录试剂盒Promega试剂盒。RT-PCR扩增试剂盒Bio-Rad试剂盒购自美国Bio-Rad。蛋白提取试剂盒购自凯基生物技术股份有限公司。便携式数字测氧仪(CY-100) 购自浙江建德仪器设备厂，根据实验要求自制新生鼠保育箱及缺氧箱。
1.2 实验方法 1.2.1 建立NEC大鼠模型参照本课题组新生大鼠人工喂养+LPS灌胃+缺氧复氧冷刺激建立NEC模型构建[7-8]。新生SD大鼠在出生后24 h与母鼠分离，放置在自制保育箱内(控制保育箱内温度28 ℃~30 ℃，湿度45%~65%)，采用鼠乳代用品喂养。代乳品参考AUESTAD等[9]报道配制，用清洁无菌1.9 F硅胶管每4 h经口插管喂养1次，首次喂养量为0.1 mL，以后每24 h增加0.1~0.3 mL。LPS以5 mg/kg稀释于0.1 mL灭菌水中，每日灌胃1次，连续3 d。将新生SD大鼠置入缺氧箱中，测氧仪调零后将探头连接于密闭缺氧箱顶端缺口处，胶布封闭，入气孔中充入纯N2，控制N2流量为15 L/min，箱内氧气浓度降至零后迅速将新生鼠置入，持续通入N2，维持1 000 mL/L N2 3 min后打开箱盖取出新生鼠，随即将其置于1 000 mL/L氧气环境之氧仓中，保持3 min后立即将其置于4℃冰箱中刺激10 min。每日在10：00和20：00分别进行一次缺氧+复氧+冷刺激，连续3 d。
1.2.2 实验动物分组及处理新生大鼠生后24 h分成3组，每组10只。健康对照组：生后24 h继续与母鼠同笼，鼠乳喂养，共3 d；NEC组：新生大鼠生后24 h进行新生鼠NEC动物模型构建；双歧杆菌干预组(C组)：建立新生鼠NEC动物模型后，双歧杆菌(0.04 g/只，即2×108CFU/只)灌胃3 d，每天2次。
1.2.3 标本的收集造模成功后新生大鼠，空腹24 h后脱臼处死，清洁并消毒腹部皮肤，打开腹腔，仔细分离肠系膜及血管后取出十二指肠下端至回盲部肠管，取近回盲部肠组织2~3 cm固定于多聚甲醛中，石蜡包埋、切片，进行HE染色镜检，免疫组化检测Syndecan-1蛋白表达。剩余肠段组织置于冻存管中-80 ℃保存备用，提取RNA。
1.2.4 qRT-PCR检测TNF-α、IL-1β、MMP-7和Syndecan-1的mRNA表达水平严格依据检测试剂盒说明书操作如下：肠组织称量后，提取RNA，检测RNA浓度后，使用Eastep RT Master Mix反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA。反转录反应条件为：37 ℃ 15 min，98 ℃ 15 min，4 ℃保存。获取的cDNA稀释5~10倍，-20 ℃保存备用。利用2×SYBR Real-time PCR premixture试剂盒，行实时荧光定量PCR，加样体系为2×Mix 10 μL，Primer 1.6 μL，cDNA 2 μL，加水至20 μL，在Bio-Rad实时荧光定量PCR仪上程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃(或每对引物的最适退火温度)退火延伸30 s共计40个循环，65 ℃下30 s，逐渐升温至95 ℃下溶解曲线分析。待测目的基因均以GAPDH为内参。IL-1β(118 bp)的引物序列正义链为5′-ATGCCTCGTGCTGTCT-3′，反义链为5′-TCGTTGCTTGTCTCTCCTTG-3′；MMP-7(107 bp)的引物序列正义链为5′-GGACAAACTGAGGGAAATGC-3′，反义链为5′-CATCTGGCACTCCACACCT-3′；TNF-α(147 bp)的引物序列正义链为5′-GTCGTAGCAAACCACCAAGC-3′，反义链为5′-GAAGAGAACCTGGGAGTAGATAAGG-3′；Syndecan-1(120 bp)的引物序列正义链为5′-TGAAACATCTGGGGAGAACA-3′，反义链为5′-AGCACTTCCTTCCTGTCCAA-3′；GAPDH(110 bp)的引物序列正义链为5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAG-3′，反义链为5′-CACAGGAGACAACCTGGTCC-3′。
1.2.5 Western blot检测Syndecan-1蛋白表达水平称取等质量肠组织提取总蛋白。蛋白变性后行电泳、转膜、孵育抗体，一抗(抗Syndecan-1抗体，稀释度为1：400，抗β-actin抗体稀释度为1：1 000) 置于4 ℃冰箱摇床孵育过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗(抗体稀释度为1：5 000) 室温震荡孵育1 h，ECL化学发光显影。
1.2.6 免疫组化检测Syndecan-1蛋白表达水平石蜡切片，常规脱蜡、水化、抗原修复后，PBS漂洗3次每次5 min；胎牛血清在室温下封闭30 min，PBS液漂洗3次每次5 min；滴加小鼠抗大鼠Syndecan-1单克隆抗体(抗体稀释度为1：100)4 ℃冰箱孵育过夜，PBS液漂洗；滴加生物素化的山羊抗小鼠IG抗体室温孵育60 min，PBS液冲洗；DAB显色5~8 min，苏木精复染、透明、干燥后中性树脂胶封片镜下观察。
1.3 统计学方法采用GraphPad Prism 5.0统计软件，所有计量资料均以x±s表示，两两比较用t检验。
2 结果 2.1 新生大鼠肠组织病理学形态和病理评分光学显微镜观察显示：健康对照组大鼠肠组织结构清晰正常，无中性粒细胞浸润，上皮完整连续，腺体排列规则，绒毛高耸整齐，黏膜层，黏膜下层，固有层无充血水肿甚至断裂分离(图 1A)。NEC组大鼠肠组织坏死严重，肠壁绒毛参差不齐，变性水肿，部分绒毛坏死，脱落消失，腺体排列紊乱消失，肌层变薄甚至断裂，固有层与黏膜下层重度水肿，可见中性粒细胞浸润(图 1B)。C组肠黏膜及黏膜下层可见轻中度水肿充血，绒毛水肿，腺体结构紊乱，部分肠管病变不十分明显，部分可见中性粒细胞浸润(图 1C)。
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| A：健康对照组；B：NEC组；C：双歧杆菌组 图 1 HE染色观察各组大鼠肠组织病理学变化(LM ×200) |
2.2 qRT-PCR检测大鼠肠组织TNF-α、IL-1β、MMP-7和Syndecan-1的mRNA表达水平
qRT-PCR检测细胞因子TNF-α和IL-1β mRNA表达水平结果显示：NEC组TNF-α mRNA表达水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义(图 2A，P＜0.01)。NEC组IL-1β mRNA表达水平也高于健康对照组，差异有统计学意义(图 2B，P＜0.05)。双歧杆菌干预组TNF-α和IL-1β与NEC组相比明显下降(P＜0.01)，差异有统计学意义。此结果说明NEC时TNF-α、IL-1β参与了肠道炎症，并且双歧杆菌可抑制TNF-α、IL-1β的表达。
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| A：TNF-α mRNA；B：IL-1β mRNA；C：MMP-7 mRNA；D：Syndecan-1 mRNA a：P＜0.01, 与健康对照组比较；b：P＜0.01, c：P＜0.05, 与双歧杆菌组比较 图 2 qRT-PCR检测各组大鼠肠组织各因子mRNA表达水平变化(n=10，x±s) |
qRT-PCR检测各组MMP-7 mRNA表达水平，结果显示，NEC组比健康对照组明显升高(图 2C，P＜0.01)，与TNF-α、IL-1β的表达变化有相同的趋势。而双歧杆菌干预使MMP-7 mRNA表达水平下降(图 2C，P＜0.05)。
NEC组Syndecan-1 mRNA的表达水平略高于健康对照组，但二者差异无统计学意义(图 2D，P＞0.05)。NEC组和双歧杆菌组Syndecan-1的mRNA水平与对照组相比差异均无统计学意义(图 2D，P＞0.05)。说明发生NEC时，以及双歧杆菌干预均未能引起Syndecan-1的mRNA表达变化。
2.3 Western blot检测大鼠肠组织Syndecan-1蛋白表达水平Western blot结果显示(图 3)：对照组Syndecan-1蛋白呈高水平表达，而NEC组几乎未检测到Syndecan-1蛋白的表达。两组对比，表达差异有统计学意义。双歧杆菌干预后Syndecan-1又有所表达，与NEC组相比差异有统计学意义。说明发生NEC时Syndecan-1蛋白参与了炎症发生，可能发生了脱落，而双歧杆菌对其有修复作用。
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| 1：健康对照组；2：NEC组；3：双歧杆菌组；A：Western blot检测结果；B：半定量分析结果(n=10，x±s) a: P＜0.01, 与健康对照组比较；b：P＜0.01, 与双歧杆菌组比较 图 3 Western blot检测各组大鼠肠组织Syndecan-1蛋白表达 |
2.4 免疫组化检测大鼠肠组织Syndecan-1蛋白表达水平
Syndecan-1主要分布于细胞膜，炎症时从细胞膜脱落。免疫组化结果显示，对照组(图 4A)绒毛上皮细胞膜呈深棕色，而NEC组(图 4B)绒毛上皮细胞膜棕色染色明显减弱，双歧杆菌组上皮细胞膜呈淡棕色，与Western blot检测蛋白表达水平结果一致(图 4C)。
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| A：健康对照组；B：NEC组；C：双歧杆菌组 图 4 免疫组化检测各组大鼠肠组织Syndecan-1表达(二步法×200) |
3 讨论
NEC是新生儿尤其是早产儿死亡的重要原因，病死率较高。目前所知早产、缺氧、喂养不当、细菌感染、肠道缺血等多种因素可导致NEC并引起炎症连锁反应[10]，但其确切的发病原因和机制仍不十分清楚。
Syndecan-1主要于上皮细胞表达，其结构包括跨膜的核心蛋白和连接于核心蛋白上的硫酸乙酰肝素(heparansulphate，HS)链及硫酸软骨素(chondroitin sulphate，CS)链。其核心蛋白包括胞内区、跨膜区和胞外区。胞外区由HS链和CS链连接于Syndecan-1核心蛋白构成，HS链脱落后结合胞外配体发挥生理功能。研究表明在损伤和炎症时，Syndecan-1蛋白会发生胞外域HS链的脱落[11]。本研究发现NEC时肠组织的Syndecan-1 mRNA水平虽与对照组差异无统计学意义，但Western blot检测到Syndecan-1的蛋白表达水平却明显下降，推测是因为其HS链发生了脱落，而不是由于mRNA水平减少所致。Syndecan-1胞外域的脱落在炎症和肿瘤中是一个重要的生理过程，脱落后成为的游离Syndecan-1包含完整的HS链，并可在体液中[12]检测到，其可结合相关因子产生炎症反应，如可与IL-8结合，通过抑制白细胞-内皮细胞间的反应而起作用[13]。MARY[14]和THOMAS[15]的两项研究表明NEC患儿血清中IL-8是升高的。由此推测，NEC时，脱落的HS链可能与体液中IL-8作用，加剧炎症反应。
目前已知的可促进Syndecan-1胞外域脱落的因子包括MMP-7、MMP-9、MT-MMP1、ADAM10、ADAM17以及解聚素[16]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一类锌离子依赖性内肽酶，在正常创面修复期间，降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、清除失活组织、重塑底层结缔组织、迁移炎性细胞以及血管再生[17-20]。MMP-7具有MMPs的一般特性。BISTER[21]证实在NEC患儿的肠道组织中MMP-7表达上调。本研究结果也同样证实在NEC大鼠模型中，MMP-7的表达水平是升高的。我们和BISTER等[21]的结果均表明MMP-7在NEC肠道损伤中表达上调。研究证明，MMP-7切割Syndecan-1的机制可能是由于其可以与细胞膜表面的HS链结合[22]，本研究发现NEC模型组MMP-7的mRNA表达水平是升高的，而Syndecan-1的mRNA水平虽与对照组差异无统计学意义，但是蛋白水平降低，说明Syndecan-1蛋白参与了新生大鼠坏死性结肠炎的发生过程，且其减少不是由于mRNA水平减少所致，而是MMP-7与HS链结合使其从Syndecan-1蛋白脱落。
TNF-α，是一类促炎因子，在NEC模型中血浆TNF-α水平是增加的[23]，本研究发现NEC模型新生大鼠TNF-α表达水平高于对照组。大量研究表明，IL-1β在各种生理和病理情况中都与TNF-α紧密相关，且TNF-α可以诱导细胞IL-1β的产生。本研究中新生大鼠发生坏死性小肠结肠炎时IL-1β表达水平也是升高的。IL-1β通过细胞内信号转导可增强MMP-7的表达[24-25]，而MMP-7能切割Syndecan-1使其脱落，我们推测IL-1β调节了Syndecan-1在NEC中的作用。另外，研究表明，游离的HS链可以与TNF-α结合，减弱活化因子的浓度[26]。因此认为在炎症过程中，HS链发挥了调节炎症的中心作用。
早产儿肠道发育不成熟，肠道菌群异常定植，生后1~2周缺乏对肠道有益的双歧杆菌。肠道菌群紊乱的早产儿容易发生坏死性小肠结肠炎，而补充双歧杆菌后，可减少早产儿病死率，改善早产儿肠道菌群紊乱，减弱NEC的严重程度，说明双歧杆菌对新生儿的肠道具有保护作用。由于肠道中的微环境复杂，双歧杆菌发挥保护作用的机制目前还不明确。研究表明双歧杆菌通过zonulin影响肠道上皮的通透性[6]，且在一定程度上降低NEC时炎症因子的表达。文献[27]的研究发现给予外源性TNF-α后Syndecan-1表达下降，本研究证实在新生大鼠坏死性小肠结肠炎中，双歧杆菌抑制TNF-α和IL-1β的表达同时也抑制了MMP-7的表达，使得Syndecan-1蛋白表达水平降低。因此我们推测双歧杆菌通过调节MMP-7对Syndecan-1的切割，阻止了Syndecan-1的胞外域脱落，从而发挥其保护作用，为双歧杆菌的治疗作用提供了理论支持。
综上所述，本研究证实在大鼠NEC模型肠道组织中TNF-α、IL-1β、MMP-7的mRNA表达水平均上调，而Syndecan-1蛋白表达下降。我们推测，NEC炎症发生时，TNF-α促进了IL-1β的表达，IL-1β通过增强MMP-7的表达，从而完成对Syndecan-1的切割。双歧杆菌抑制炎症因子的同时保护了肠黏膜的Syndecan-1蛋白，以此来保护肠道黏膜屏障。本研究为临床应用双歧杆菌治疗NEC提供了进一步理论支持，但是在复杂的肠道微环境中，对双歧杆菌如何调节MMP-7保护Syndecan-1蛋白的机制仍需要进一步确切研究。
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