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大鼠小胶质细胞及巨噬细胞对胶质瘤C6细胞株迁移能力的影响
吴栋栋, 徐伦山, 许民辉, 欧阳庆, 易良     
400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经外科
[摘要] 目的 探讨大鼠小胶质细胞及外周血巨噬细胞对胶质瘤C6细胞株迁移能力的影响。 方法 将大鼠小胶质细胞及外周血单核细胞诱导分化形成的巨噬细胞分别与胶质瘤C6细胞共培养,以大鼠成纤维细胞共培养为阳性对照,单纯胶质瘤C6细胞为空白对照,共培养0、24、48 h分别行划痕实验,于划痕后6 h观察划痕实验结果;共培养24、48 h时以CD11b标记、流式分选分离小胶质/巨噬细胞及C6细胞,行Western blot检测0、24、48 h小胶质/巨噬细胞IL-10、IL-18和MMP-9及C6细胞株TGF-β、FAS配体表达水平的改变。 结果 早期小胶质细胞及巨噬细胞均抑制胶质瘤的迁移,巨噬细胞的抑制效果更强(P<0.05);与胶质瘤细胞共培养后两种细胞对肿瘤的抑制作用消失且差异无统计学意义,均表现为促进肿瘤迁移。小胶质细胞、巨噬细胞在初始阶段IL-10、IL-18、金属基质蛋白酶MMP-9表达略有不同,但共培养后两种细胞的上述蛋白表达均升高且一致;共培养后的胶质瘤细胞的TGF-β、FAS配体较共培养前表达均升高且一致。 结论 小胶质细胞及巨噬细胞与C6胶质瘤细胞共培养后被驯化成同样的GAMs,对C6细胞迁移影响的生物学表现一致。
[关键词] 小胶质细胞     巨噬细胞     肿瘤迁移    
Effects of microglia and macrophages on migration of rat C6 glioma cells
Wu Dongdong , Xu Lunshan , Xu Minhui , Ouyang Qing , Yi Liang     
Department of Neurosurgery, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042, China
the National Natural Science Foundation of China (81172413)
Corresponding author: Xu Lunshan, E-mail:xuliu559@163.com
[Abstract] Objective To determine the effect of microglia and peripheral blood macrophages on the migration of C6 glioma cells. Methods The rat microglial cells and macrophages differentiated from peripheral blood mononuclear cells were co-cultured with C6 glioma cells. Co-cultured with rat fibroblasts served as positive control and singly cultured C6 cells as blank control. Scratch wound healing assay was carried in 0, 24 and 48 h after co-culture, and the results were observed in 6 h later. In 24 h and 48 h after co-culture, CD11b+ flow cytometry was used to sort and isolate microglia/macrophages and C6 cells. The expression levels of IL-10, IL-18 and MMP-9 in microglia and macrophages and those of TGF-β and FAS ligand in glioma cells were detected by Western blotting when co-cultured for 0, 24 and 48 h. Results At the initial state, both microglia and macrophages inhibited the migration of glioma, and the inhibitory effect of macrophage was stronger (P < 0.05). The tumor inhibitory effect of 2 kinds of cells disappeared after co-culture with glioma C6 cells, and all of them showed the effect of promoting tumor migration. The expression levels of IL-10, IL-18 and MMP-9 in the microglia and macrophages were different in the initial stage. But the levels of these proteins were increased in these cells and consistent after co-culture. The expression levels of TGF-β and FAS ligand were also increased and consistent in glioma cells C6 after co-culture. Conclusion Microglia and macrophages are domesticated into the same glioma associated microglia/macrophages after co-culture with C6, and 2 kinds of cells show the same biological effects when co-culture with C6 cells.
[Key words] microglia cells     macrophage     tumor migration    

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,在国内占颅内肿瘤的35.26%~60.96%,平均44.69%[1]。尽管各种治疗方法已取得一些进展,但是治疗效果却未能获得明显改善,死亡率极高,成为神经外科领域的一个难题[2]。肿瘤细胞增殖快、侵袭性高和肿瘤微环境血管生成等是胶质瘤的基本病理特征,肿瘤细胞高度侵袭是恶性胶质瘤高死亡率的主要原因之一[3]。胶质瘤中有大量的小胶质细胞/脑巨噬细胞浸润,在不同的文献中,这些细胞有的被称为小胶质细胞,有的被称为巨噬细胞,也有的被称为胶质瘤相关性小胶质/巨噬细胞(glioma associated microglia/macrophages,GAMs)。结合文献内容,这三者所指的是同一细胞群[4]。在胶质瘤的生长中,小胶质细胞被肿瘤释放的多种趋化因子招募,浸润到肿瘤中心和周围,同时由于血脑屏障的破坏,外周的巨噬细胞[5]也浸润其中,它们和小胶质细胞一起,共同组成了胶质瘤相关性小胶质细胞/巨噬细胞(GAMs)。

小胶质细胞是大脑中常驻的免疫细胞,被称为中枢神经系统的“巨噬细胞”,在维持中枢神经系统稳态和抵御外来病原侵入的过程中起着重要作用。近年的研究结果提示尽管胶质瘤组织中伴随着大量小胶质细胞浸润,但因其固有的免疫特性被显著抑制,不再扮演神经系统“守护者”的角色,反而积极改造肿瘤微环境,为胶质瘤的生长演进,尤其是胶质瘤的侵袭和免疫抑制营造有利条件。

胶质瘤中血脑屏障完整性被破坏,导致血液中的单核细胞进入肿瘤并分化为巨噬细胞[5],和小胶质细胞一起组成GAMs群体。由于上述两类细胞祖细胞同源,且分子标志物也大多相似,使这两种细胞难以区分。这两种具有同源性的不同来源的小胶质细胞/巨噬细胞进入胶质瘤中后生物学效应是否一致,目前尚无明确结论。本研究拟通过观察分析小胶质细胞、巨噬细胞与胶质瘤共培养时划痕实验、Western blot探讨小胶质细胞与巨噬细胞对胶质瘤迁移影响的异同。

1 材料与方法 1.1 实验材料

新生SD大鼠12只(1日龄,平均体质量6 g),成年SD大鼠4只(6月龄,平均体质量300 g),均由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。胶质瘤C6细胞株、大鼠成纤维细胞株(实验室冻存)。

1.2 主要试剂

DMEM/F12培养基、Hanks平衡盐溶液(HyClone公司),EBSS(Gibco,Invitrogen公司),多聚L-赖氨酸、胰蛋白酶(Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青生物)等。

1.3 器械与仪器

眼科剪、眼科镊子、75 cm2培养瓶、6孔板、24孔板、倒置显微镜、荧光显微镜(德国lica公司),CO2恒温细胞培养箱、全自动酶标仪(Thermo公司)等。

1.4 小胶质细胞分离、培养及纯化

采用温和消化法分离新生SD大鼠小胶质细胞[6-7],在无菌条件下分离1~2 d龄的新生SD大鼠大脑,仔细去除脑膜和血管并剪碎后,含0.1 mL/L DNaseⅠ的0.25 g/L胰酶消化15 min,终止消化后将所获的上层细胞按每瓶2×107个细胞种植于75 cm2培养瓶中,培养液为含10% FBS的DMEM,在5% CO2的培养箱37 ℃中培养,每3天换液,至12 d混合细胞分层后按文献[8]的方法,先用不含Ca2+、Mg2+的PBS洗涤胶质细胞/神经元3遍,然后0.8 g/L胰酶-EDTA 37 ℃消化,直到上层小胶质细胞开始出现大片收缩脱落时终止消化,用PBS液冲洗3遍后收集脱落的细胞,接种至25 cm2培养瓶中培养1 h,弃去未贴壁的细胞,此时贴壁生长的细胞即为纯化的小胶质细胞。选择CD11b作为小胶质细胞的标志物,待小胶质细胞贴壁生长24 h,0.01 mmol/L PBS洗涤5 min×3次,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗涤5 min×3次,0.25% Triton-100室温穿孔20 min,PBS洗涤5 min×3次,加入10%羊血清室温封闭30 min,滴加CD11b单克隆抗体(稀释度1:100), 4 ℃过夜, PBS漂洗3次,滴加生物素标记二抗工作液(生物素标记羊抗兔IgG试剂)37 ℃ 30 min, PBS漂洗3次,滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液, 37 ℃孵育10~15 min, PBS漂洗3次,荧光显微镜下拍照。

1.5 巨噬细胞的培养及鉴定

取成年SD大鼠外周血4 mL采用梯度密度离心法分离单核细胞,以含PMA 10 ng/mL完全培养基于25 cm2培养瓶中诱导其贴壁,培养3 d后所得细胞即为巨噬细胞。IL-18的ELISA试剂盒检测诱导前后IL-18含量,诱导分化后的巨噬细胞IL-18细胞因子(120 pg/mL)较单核细胞(10 pg/mL)显著升高。

1.6 划痕实验

生长良好的胶质瘤C6细胞株接种于6孔板中预培养24 h贴壁,分别加入约1/2胶质瘤细胞量的小胶质细胞、巨噬细胞、成纤维细胞与之共培养,于共培养0、24、48 h行划痕实验,于划痕后6 h观察划痕实验结果。

1.7 Western blot检测

以未共培养的小胶质细胞、巨噬细胞、C6胶质瘤细胞记做0 h,分别取划痕实验中共培养24、48 h的混合细胞CD11b荧光标记后流式细胞分选分离小胶质细胞、巨噬细胞与C6胶质瘤细胞(分别收集106个细胞)标记为24、48 h,将上述不同时间节点的小胶质细胞、巨噬细胞、胶质瘤细胞(两种)分别冰浴裂解、提取蛋白后BCA定量,各取80 μg样品上样后凝胶电泳分离蛋白质,冰浴中电泳转膜,室温封闭膜后依次一抗孵育、辣根过氧化物酶二抗孵育、化学发光液孵育后曝光。Quantity one(Bio-Rad)软件对目的条带进行灰度检测,检测小胶质细胞/巨噬细胞IL-10、IL-18、MMP-9及胶质瘤细胞TGF-β、FAS配体表达的改变。

1.8 统计学分析

数据用x±s表示,应用SPSS 13.0统计软件进行方差分析和t检验。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 小胶质细胞及巨噬细胞的鉴定

混合胶质细胞可采用温和消化法分离获得小胶质细胞,以CD11b免疫荧光染色进行鉴定(图 1)。单核细胞经PMA诱导分化所得巨噬细胞IL-18表达量(125.0±10.0) pg/mL较单核细胞(6.5±1.0) pg/mL显著上调(P<0.05)。

图 1 小胶质细胞CD11b免疫荧光染色观察(×200)

2.2 划痕实验结果

划痕实验结果及愈合率结果见图 2表 1。小胶质细胞、巨噬细胞于0 h较对照组(成纤维细胞对照及单纯胶质瘤对照)均抑制胶质瘤的迁徙,但巨噬细胞抑制效果更佳(P<0.05);共培养24、48 h后两种细胞均促进胶质瘤迁徙(愈合率均在44%左右),且促进效果差异无统计学意义。

对照组上方两张为胶质瘤划痕前后阴性对照,下方两张为成纤维细胞划痕前后对照 图 2 不同时间点两组共培养细胞划痕实验观察(×200)

表 1 不同时间点两组共培养细胞划痕实验愈合率结果(%,x±s)
共培养细胞0 h24 h48 h
小胶质细胞20.7±1.2a44.6±2.6a43.2±1.8a
巨噬细胞14.4±2.3a42.6±2.0a45.2±2.5a
 成纤维细胞愈合率为(47.6±4.2)%,空白对照愈合率为(28.0±1.4)%;a:P<0.05,与空白对照比较

2.3 Western blot检测结果

与胶质瘤共培养24、48 h后的小胶质细胞、巨噬细胞行Western blot凝胶电泳,检测结果显示两种细胞的IL-10、IL-18、MMP-9表达均较0 h升高,但同一时刻两种细胞之间蛋白表达水平差异无统计学意义,即经胶质瘤驯化后小胶质细胞与巨噬细胞产生的促进胶质瘤转移的细胞因子表达一致,差异无统计学意义。共培养24、48 h的胶质瘤细胞TGF-β、FAS配体表达水平较共培养前(0 h)升高且两组间差异无统计学意义,说明共培养的C6细胞受小胶质细胞、巨噬细胞的影响也一致,差异无统计学意义(图 3表 23)。

1:巨噬细胞;2:小胶质细胞;3:与巨噬细胞共培养的胶质瘤C6细胞株;4:与小胶质细胞共培养的胶质瘤C6细胞株 图 3 Western blot检测不同细胞各时间点蛋白表达

表 2 Western blot检测共培养不同时间小胶质细胞/巨噬细胞IL-10、IL-18、MMP-9表达(x±s)
时间IL-10IL-18MMP-9
0 h
 小胶质细胞0.113±0.0250.193±0.0700.103±0.039
 巨噬细胞0.116±0.0260.192±0.0470.097±0.045
24 h
 小胶质细胞0.368±0.0760.278±0.0220.123±0.052
 巨噬细胞0.328±0.0730.279±0.0580.098±0.045
48 h
 小胶质细胞0.360±0.1040.397±0.0610.289±0.076
 巨噬细胞0.362±00520.385±0.0650.281±0.064

表 3 Western blot检测共培养不同时间C6细胞TGF-β和FAS配体表达(x±s)
时间TGF-βFAS配体
0 h
 小胶质细胞0.185±0.0310.053±0.013
 巨噬细胞0.213±0.0520.051±0.014
24 h
 小胶质细胞0.222±0.0640.104±0.013
 巨噬细胞0.243±0.0690.107±0.035
48 h
 小胶质细胞0.419±0.0780.176±0.049
 巨噬细胞0.377±0.0720.154±0.051

3 讨论

目前的研究已经明确,原发胶质瘤中的GAMs有两个来源,即脑组织固有的小胶质细胞趋化和外周血单核细胞穿透血脑屏障后分化形成。GAMs能够分泌多种细胞因子(IL-10、IL-18、MMP-9等),直接、间接影响恶性胶质瘤的增殖与迁移。IL-10、IL-18[9-10]与胶质瘤表面相应受体结合抑制肿瘤免疫,促进肿瘤侵袭。IL-10具有广谱的免疫抑制效应,IL-18能够通过与胶质瘤表面的相应受体结合,促进胶质瘤向周围浸润。在此免疫抑制的微环境中,GAMs的MMP-9[11]表达上调,促进肿瘤迁移及新生血管形成。因此检测IL-10、IL-18、MMP-9表达水平可反映小胶质细胞/巨噬细胞对胶质瘤迁移的促进作用。胶质瘤细胞产生的抑制小胶质/巨噬细胞功能的细胞因子包括TGF-β、FAS配体等。TGF-β可抑制抗原递呈细胞和自然杀伤细胞的活性,并能阻止细胞毒性T细胞的分化和激活,导致小胶质细胞吞噬活性降低。FAS配体与其受体FAS结合,可诱导表达FAS的细胞凋亡。FAS-FAS配体结合被认为是主要的介导程序性细胞死亡的机制之一。有研究[12]发现,多种人胶质母细胞瘤细胞、大鼠胶质瘤细胞系都能表达FAS配体,而小胶质细胞和活化的T细胞都表达FAS,因此小胶质细胞容易受到胶质瘤细胞表面功能活跃的FAS配体影响;下调胶质瘤FAS配体的表达能增强T淋巴细胞在肿瘤中的浸润并抑制肿瘤的生长。检测TGF-β、FAS配体可反映胶质瘤对GAMs的抑制作用。

有研究[13]发现小胶质细胞与C6胶质瘤细胞共培养时,早期表现为抗肿瘤作用,但共培养一段时间(约6 h后)小胶质细胞被驯化,抗肿瘤作用消失,反而表现为促进肿瘤生长。正常激活后的小胶质细胞及血液来源单核-巨噬细胞均具有广泛的免疫功能,与肿瘤共培养初期可抑制、吞噬肿瘤细胞;然而在胶质瘤微环境中,GAMs很快被驯化不再产生有效的抗肿瘤免疫。本实验中3次不同时间节点的划痕实验(0、24、48 h)再次证实了这一点,即早期小胶质细胞、巨噬细胞与胶质瘤细胞共培养时均抑制胶质瘤的迁移,但共培养一段时间后这种抑制效果消失,反而表现出促进肿瘤迁移的效果。小胶质细胞与巨噬细胞早期对胶质瘤侵袭的抑制效果略有不同,巨噬细胞的抑制效果较小胶质细胞更强。这种差异考虑与小胶质细胞及诱导分化的巨噬细胞的初始状态有关,即原代小胶质细胞与巨噬细胞在共培养初期(0 h)产生的促进肿瘤迁移的相关蛋白(IL-10、IL-18、MMP-9等)在早期的表达水平不完全一致有关。

结合划痕实验及Western blot结果,比较胶质瘤驯化前后(共培养0、24 h及48 h)可发现,驯化后的小胶质/巨噬细胞生物学表现趋于一致,其分泌的免疫抑制及促进肿瘤迁徙的蛋白(IL-10、IL-18、MMP-9) 表达较驯化前均明显上调,且组间差异无统计学意义。这一结果说明小胶质细胞及巨噬细胞经胶质瘤驯化后转化为同样的GAMs细胞。小胶质细胞和巨噬细胞同源同祖,在肿瘤微环境中经过驯化后两者回归一致。这可能是目前应用巨噬细胞进行肿瘤免疫治疗效果不太理想的原因之一,即体外诱导的巨噬细胞回输进入体内后在肿瘤微环境的诱导下发生再分化,逐渐失去抗肿瘤能力。

C6胶质瘤细胞在共培养24、48 h时所产生的TGF-β、FAS配体表达较共培养前(0 h时)升高,且组间差异无统计学意义。证明胶质瘤细胞受小胶质细胞、巨噬细胞影响后产生的具有免疫抑制效果的细胞因子表达水平一致,从另一方面证明小胶质细胞、巨噬细胞受胶质瘤细胞免疫抑制是一致的,提示两种细胞经胶质瘤驯化后转变为共同的GAMs。

体外实验中初期略有不同的小胶质细胞、巨噬细胞是如何被胶质瘤驯化为相同的肿瘤相关巨噬细胞,目前有多种观点。有研究者[14]认为转录信号转导子与激活子3(STAT3) 信号通路在GAMs的转化过程中发挥了重要作用,也有研究者[15-16]认为Tool2受体通路上调中GAMsⅠ型膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)和MMP-9的表达发挥了重要作用,还有研究者认为TLR2-p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路调节MMP表达从而在GAMs转化过程中有显著效果。本实验未涉及这一方面的研究,但我们认为GAMs的驯化过程是一个多信号通路共同作用的结果,以上几个信号通路均发挥了一定的作用,不同信号通路分别对小胶质细胞、巨噬细胞GAMs转化所做贡献的权重有待进一步研究。

在肿瘤微生态环境中,GAMs具有M1、M2两种不同表型,其中M1型细胞能够吞噬胶质瘤细胞,发挥着抗胶质瘤生长的作用;而M2型细胞则参与了恶性胶质瘤免疫抑制微环境的构建,使小胶质细胞从胶质瘤的“杀伤者”转变为“肿瘤细胞的支持者”。Komohara等[17]的研究发现胶质瘤中浸润的M2型细胞的比例与胶质瘤的生长及患者的预后呈显著负相关。周长胜等[18]研究发现M1和M2型GAMs细胞表达与胶质瘤发生及恶性程度相关,M1型GAMs表达强度与病理分级呈负相关;M2型GAMs表达强度与病理分级呈正相关,M2型GAMs高表达组患者的无进展生存期和总生存期明显低于低表达组。TGF-β、STAT3等细胞因子均促进GAMs由M1型向M2型转化,而转化后的M2型细胞则通过STI1、MMP-9等途径促进胶质瘤的迁移。有研究结果显示阻断GAMs的巨噬细胞集落刺激因子-1受体(CSF-1R)可改变其M2表型而阻止肿瘤生长[19],使其由M2型向M1型转化发挥肿瘤免疫杀伤作用,IFN-g、TFN、IL-2、miRNA-155等也可诱导其由M2型向M1型转化。因此,研究并阐明M1、M2型GAMs之间如何相互转化,最终采取适当措施使GAMs总体向M1型靠拢发挥抗肿瘤作用,将为胶质瘤的临床治疗提供新思路及新策略。

本实验的主要意义在于明确了尽管胶质瘤中有两种不同来源的巨噬细胞,但这两种不同来源的巨噬细胞在体外实验的胶质瘤微环境中经驯化后转变为相同免疫表型的GAMs。它们产生同样的促进胶质瘤迁移的细胞因子,受到同样程度的胶质瘤细胞免疫抑制,对肿瘤迁移具有同样的促进作用,即在进行胶质瘤迁移实验研究时经驯化的不同来源的小胶质细胞和巨噬细胞可以视为同一种细胞群。

大鼠原代小胶质细胞须由新生大鼠中提取,其分离、培养至少需2周时间,操作复杂,来源相对受限;而巨噬细胞来自成年大鼠外周血单核细胞,其来源广泛,分离、诱导分化相关操作简单,3 d即可获得。在进行其它需要小胶质细胞的胶质瘤实验时如果能以驯化后的巨噬细胞替代小胶质细胞,可以简化相关操作,扩大细胞来源,节约实验时间。受伦理学限制,人小胶质细胞来源相对受限,如果这一结论可推广到人,扩大人小胶质细胞来源,节约实验成本,规避伦理学风险,方便研究人员进行相关实验,其意义将更加重要。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201701109
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吴栋栋, 徐伦山, 许民辉, 欧阳庆, 易良.
Wu Dongdong, Xu Lunshan, Xu Minhui, Ouyang Qing, Yi Liang.
大鼠小胶质细胞及巨噬细胞对胶质瘤C6细胞株迁移能力的影响
Effects of microglia and macrophages on migration of rat C6 glioma cells
第三军医大学学报, 2017, 39(11): 1117-1122
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(11): 1117-1122
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201701109

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收稿: 2017-01-19
修回: 2017-03-04

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