随着结核病的诊断和治疗方法的进步，结核病的防治工作有了很大的发展。WHO在《2015年全球结核病报告》中指出^[1]：全球约3.3%的初治结核病例和20%的复治结核病例均为耐药结核病，2014年估计有19万人死于耐药结核病。中国既是世界上22个结核病高负担国家之一，同时也面临着耐多药结核病(multi-drug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的挑战，结核病患者中22%~30%为耐药结核病患者^[1]。耐药结核病的传播，特别是耐多药结核病(至少对异烟肼和利福平同时耐药的结核病)的流行，究竟是受获得性耐药还是原发性耐药的影响，传统的流行病学调查无法进行详尽的解释。

结核分枝杆菌基因分型技术的出现与发展有助于更好地揭示结核病的流行和传播规律，将基因分型结果和病例流行病学资料相结合，成为监测结核病流行和传播的有效手段。近些年来发展起来的结核分枝杆菌散在重复单位可变数目串联重复序列(mycobacterium interspersed repetitive units-variable number tandem repeat，MIRU-VNTR)方法，分辨率高，更为快速、便捷。分子流行病学证实：受环境和宿主双重因素的影响，不同区域流行的致病结核分枝杆菌的基因型并不相同，传播速度和方式也不相同。有研究对结核患者耐药趋势的分子特点和趋势进行了一些探讨^[2-4]，但重庆地区耐多药结核分枝杆菌的分子特点尚不清楚。本研究采用MIRU-VNTR分型技术对重庆地区的耐多药结核分枝杆菌进行研究，以期明确重庆地区耐多药结核分枝杆菌基因分型的主要特点，为揭示耐多药结核病的病原演变特征、传播规律及更科学地制定结核病防控策略提供依据。

1 资料与方法 1.1 研究对象、仪器及试剂

1.1.1 标本来源

连续收集重庆市公共卫生医疗救治中心和重庆市第十二人民医院结核内科2013年7月至2015年3月753例耐多药肺结核患者的体液标本(痰液、脑脊液、胸水、病变部位的脓液等)，患者临床诊断为耐多药肺结核，诊断依据参考文献[5-8]。采用液体培养法分离培养分枝杆菌。503例经鉴定为结核分枝杆菌复合群或人(牛)型结核分枝杆菌的患者中，男性314例，女性189例，年龄16~78(38.9±14.9) 岁，患者临床血液检测HIV抗体均为阴性。研究取得所有患者知情同意和重庆市公共卫生医疗救治中心学术伦理委员会同意。503例结核分枝杆菌患者中，初治患者201例，复治患者302例，其中仅耐利福平和异烟肼有34例，仅耐一线药物(利福平、乙胺丁醇，链霉素、异烟肼)有61例，耐利福平和异烟肼及任意二线药物有54例，广泛耐药患者有75例，耐4种一线药物和5种二线药物(阿米卡星、氧氟沙星、卷曲霉素、力克肺疾、丙硫异烟胺)有17例。结核分枝杆菌标准参考菌株(H37Rv)来源于中国疾病预防控制中心国家结核参比实验室。

1.1.2 主要仪器及试剂来源

本研究使用的BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养监测系统、PAN-TA杂菌抑制剂、分枝杆菌培养管(Mycobacterium Growth Indicator Tubes，MGIT)及营养添加剂均来源于美国BD公司。Gene Genius全自动凝胶成像分析系统为英国Syngene公司产品。水平电泳仪、电泳槽来源于北京市六一仪器厂。结核分枝杆菌鉴定试剂盒、北京基因型鉴定RD105试剂盒、MIRU-VNTR(12位点)基因分型试剂盒均购于北京世纪康为生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

各种体液标本留取均参照中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》^[9]。肺结核患者如果无痰，可采取雾化引痰或通过纤维支气管镜取痰，痰液不合格者，需进一步指导后重新留取标本送检。

1.2.2 标本分离培养

各种体液标本培养前处理按照《分枝杆菌分离培养标准化操作及质量保证手册》^[10]中碱处理-中和离心沉淀法的要求进行，并按照BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养监测系统操作说明书将前处理后的沉淀物接种于MGIT。

1.2.3 抗酸染色

采用抗酸染色法^[11]对BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养监测系统判为阳性的培养物进行涂片镜下复检。

1.2.4 PCR分析

按照试剂盒说明书采用PCR方法对培养出的分枝杆菌DNA进行电泳分析，区分结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌，RD105方法对结核分枝杆菌进行进一步分析，区分北京家族型结核分枝杆菌及非北京家族型结核分枝杆菌。

1.2.5 MIRU-VNTR分析

采用12位点MIRU-VNTR方法对结核分枝杆菌进行成簇分析^[12]，同时对北京家族型结核分枝杆菌和非北京家族型结核分枝杆菌分别进行成簇分析。

1.2.6 基因多态性分析

以H37Rv标准株为参考，结合不同菌株的VNTR指纹图谱，计算出每个菌株在不同位点的重复次数，计算Hunter-Gaston分辨率指数(HGI)^[13]，采用Bionumerics Version 3.0软件进行各基因位点多态性和成簇分析。

1.3 统计学分析

利用医院信息系统(hospital information system，HIS，上海瑞美电脑科技有限公司)检索统计原始检验结果和相关信息；采用Microsoft Excel进行基础数据整理；采用SPSS 13.0统计软件，组间比较采用独立的两组或多组二分类资料χ²检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果 2.1 分枝杆菌培养

收集合格的体液标本753份，经BACTEC MGIT 960仪器培养后，结果显示阳性538例，占71.4%；阴性215例，占28.6%。对报阳菌液经抗酸染色确认，526例为抗酸阳性，12例为抗酸阴性，即BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养监测系统假性报阳12例。

2.2 北京基因型的鉴定

538株耐药分枝杆菌中，结核分枝杆菌503株(93.4%)，非结核分枝杆菌35株(6.6%)。503株结核分枝杆菌中北京家族基因型470株，占93.4%(470/503)，其中34株北京型属于牛型结核分枝杆菌，436株北京型属于人型结核分枝杆菌，占92.8%(436/470)。非北京型家族基因型33株，占6.6%。

2.3 聚类分析

采用12个基因位点对503例结核分枝杆菌菌株进行MIRU-VNTR检测。503株分枝杆菌菌株共分为348个基因型，267株结核分枝杆菌为单一基因型，其余236株可归入81个簇，各簇含2~24例菌株不等，成簇率为30.8%。81个簇包括1个24株菌株簇，1个11株菌株簇，2个9株菌株簇，1个8株菌株簇，2个5株菌株簇，3个4株菌株簇，11个3株菌株簇，60个2株菌株簇。470株北京家族基因型耐药结核分枝杆菌含有76个簇，成簇率为30.8%，成簇比例为35.9%。33株非北京家族基因型结核杆菌包括1个5株菌株簇，2个3株菌株簇，2个2株菌株簇，成簇菌株均来自于初治患者，成簇率为30.3%，成簇比例为33.3%。

2.4 各VNTR位点的等位基因多态性分析

Hunter-Gaston分辨率指数(HGI)显示：这12个位点组合总分辨率指数为0.99；各位点呈现不同的等位基因多态性，QUB-26和QUB-11b位点的多态性最高，HGI为0.67，ETR-F位点的多态性最低，HGI为0.29(表 1)。

2.5 重庆地区不同特征的耐多药结核人群对结核分枝杆菌北京基因型菌株易感因素分析

感染北京基因型菌株与性别无显著性关联，与年龄呈显著性关联(P＜0.05)；≤30岁的耐多药人群感染北京基因型概率最高(表 2)。

3 讨论

结核分枝杆菌的北京基因型是Soolingen在1995年首次发现。此后，多个研究报道称北京基因型结核分枝杆菌是结核病患者的主要致病分子类型^[14-16]。在中国，许多关于结核分枝杆菌在不同省份的分子流行病学的研究报告^[17-21]均显示北京基因型占主要的地位，但北京家族的流行是否会引起结核病的耐药目前没有定论。本研究汇集了重庆市两大耐多药结核患者定点医疗机构的大量患者样本，系统地分析了重庆地区耐多药结核分枝杆菌的基本类型，发现本区域耐多药结核分枝杆菌主要为北京家族型，占92.8%，这与目前大多数致病结核杆菌分子类型的研究报告相似，但不完全相同。全国结核病耐药基线调查资料分析结果显示^[22]：我国北京基因型菌株比率为63.97%，西南地区为59.97%，而重庆地区耐多药结核患者人群中主要流行的北京基因型高达92.8%。全国结核病耐药基线调查及其他省份分型研究^[22-24]中, 耐多药结核患者占整个研究对象的比例仅为12%~30%。这说明在本区域北京型家族的流行可能造成了耐多药结核的传播，应该加强对耐多药结核患者的治疗与监管。

本研究503例耐多药结核分枝杆菌菌株共分为81个簇，348个基因型，成簇率为30.8%。267例患者分离株为单一基因型，占全部患者的53.1%(267/503)，可认为这些是无关分离株，可能患者之间没有相互传播，而是独立的感染或是内源性复燃引发疾病。81个簇包含236例菌株，各簇含2~24例菌株，最大1个簇包含24例菌株，均为北京型，有20例是来自重庆市公共卫生医疗救治中心的患者，另4例是来自重庆市第十二人民医院。非北京型菌株中有15例菌株成3个簇，均为初治患者，其中1个簇包含5例菌株，2个簇各包含3例菌株，2个簇各包含2例菌株。对于各成簇菌株，高度提示这些患者属于各自的群，群内个体间可能存在一定的联系；同时也提示耐多药结核患者之间的交叉感染，即这些耐多药结核患者是原发性耐药，而不是由于停药、复发等因素引起的耐药。继续跟踪这些成簇患者，确定耐药原因，将成为我们后续研究的重点。

结核分枝杆菌基因分型鉴定技术可以从分子水平解释结核分枝杆菌的流行、感染、发病、耐药机制，在结核病流行病学调查、结核病监测、传染源发现、传播途径等方面有着重要的作用。MIRU-VNTR根据不同菌株间各位点拷贝数的差异进行分型，该方法分析简单，结果数字化，分辨力高，便于不同实验室间的比较。不同的研究报告显示：采用不同的分型方法对结核分枝杆菌成簇有着一定的差异性，如文献[23]采用MIRU-VNTR基因分型指出191个北京家族型结核分枝杆菌分为110种独特类型和27个簇，在四川的分析报告采用MIRU分型191个北京族型结核分枝杆菌有65个独特的MIRU类型和8个簇^[24]，中国疾病预防与控制中心对全国31个省份抽取的4 017个结核分枝杆菌采用间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)分为161个簇和407个分离株^[25]。另外，还有限制性片段长度多态分析(IS6110-RFLP)、检测差异区域105(RD105) 的缺失等方法来检测结核分枝杆菌的遗传类型。目前IS6110-RFLP被认为是结核分枝杆菌的DNA指纹图谱的“金标准”，但是由于耗时和技术要求高以及需要大量DNA，没有被广泛使用。在检测结核分枝杆菌遗传类型的实际研究中，研究者使用了不同的方法^{[24, 26-28]}。根据不同方法的结果比较，RD105或spoligotyping是鉴定菌株是否属于北京家簇较为标准的、可靠的方法，且鉴别能力可能与IS6110-RFLP相当；MIRU-VNTR或spoligotyping对菌株进一步的遗传分化研究更为简单、快捷，高度重现性及准确性、可对比性是其主要优点^{[24, 26, 29]}。因此，从事结核病分子流行病学研究时，应根据不同的研究目的，选择合适的分型技术，或多种方法联合使用，以便提高工作效率和结果准确度。

MIRU-VNTR的分辨力取决于所采用位点的分辨力，应根据不同地区结核分枝杆菌的基因多态性，选择适合本地区的VNTR位点进行分型。本研究采用在国际和国内均具有代表意义的12个位点进行VNTR基因分型，通过对菌株的等位基因多态性分析，12个位点的多态性处于0.29~0.67，说明各等位基因均呈现一定的多态性，VNTR基因分型技术中可变数目串联重复序列的选择有一定的高分辨力。分型结果提示QUB-11b、QUB-18、QUB-26、MIRU26、MIRU31、Mtub21、Mtub04这7个位点在重庆地区对耐多药结核分枝杆菌分型意义较大。邻近重庆的四川省MIRU-VNTR基因分型^[30]中QUB-11b、QUB-26、MIRU26、Mtub21、Mtub04这5个位点的分辨率指数(HGI)较高，这与本研究结果一致，但重庆地区MIRU10和MIRU31这2个位点分辨率远远低于四川省的研究结果。与重庆永川区的分型比较^[31]，本研究选择的Mtub04位点分辨率相对较高，而MIRU10和ETR-F相对较低，这可能与选择研究样本范围的大小有关系。因此，在今后的分型工作中可以选择多态性较高的位点组合，如QUB-11b、QUB-18、QUB-26、MIRU26、MIRU31、Mtub21和Mtub04，剔去低分辨率位点，对分型效率的提高有很大的帮助。