2. 343000 江西 吉安,江西省井冈山大学临床医学院内科教研室;
3. 338001 江西 新余,江西省新钢中心医院呼吸内科
2. Department of Internal Medicine Teaching, College of Clinical Medicine, Jinggangshan University, Ji'an, Jiangxi Province, 343000;
3. Department of Respiratory Diseases, Xingang Central Hospital of Jiangxi Province, Xinyu, Jiangxi Province, 338001, China
肿瘤干细胞(cancer stem cells)是一群可无限自我更新、多向分化能力和更强增殖能力的肿瘤细胞[1-2]。大量研究表明肺癌细胞中存在一小群细胞,分离培养后发现其除了具有自我更新、分化能力以外,其增殖能力较普通的肺癌细胞更强,并具有对化疗药物天然的耐受性[3-5],该群细胞被称为肺癌干细胞(lung cancer stem cells,LCSCs)。鉴于利用目前一线化疗药物很难杀伤LCSCs,使LCSCs成为肺癌化疗后复发、耐药、转移的种子[6]。因此,探索新的逆转LCSCs耐药的策略是目前研究热点。
依他尼酸(ethacrynic acid, EA)是一种利尿剂和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的抑制剂[7]。研究表明,高浓度的EA可以抑制直肠癌、神经肿瘤细胞等的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡[8-10]。文献[11-12]报道EA可促进肿瘤细胞内的氧化应激水平,进而诱导细胞的死亡。此外,研究还发现EA可以增强顺铂(cisplatin,DDP)等化疗药物的细胞毒性[8, 13]。但是EA在肿瘤干细胞中发挥何种作用仍不清楚。本研究通过获得富含肺癌干细胞的A549细胞球,研究EA对LCSCs的耐药能力的影响和对A549细胞球的杀伤效应及机制。
1 材料与方法 1.1 试剂F12K培养基、DMEM/F12培养基、B27(50×)均购自Gibco公司;重组人上皮生长因子购自Protech公司;EA、胰岛素和碱性成纤维生长因子购自Sigma公司;胎牛血清购自Pan公司;抗CD133、EpCAM、Sox2、ABCG2、β-catenin抗体购自Abcam公司;总蛋白裂解试剂、β-actin抗体以及HRP标记二抗购自上海梦至生物科技公司;ECL发光底物购自Milipore公司。活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测盒以及CCK-8试剂盒购自碧云天生物科技公司;GST活性检测试剂盒购自Biovision公司;凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技公司;逆转录试剂盒购自赛默飞世尔公司;实时定量PCR试剂盒购自罗氏公司;β-catenin过表达腺病毒和对照均购自汉恒(上海)生物技术公司。
1.2 A549细胞的培养A549细胞使用F12K+10%胎牛血清进行培养,取对数生长期细胞进行下一步实验。
1.3 A549细胞球的培养将A549细胞以200个/孔接种到6孔板中,待其长成克隆(10~14 d)后,将紧密型克隆使用克隆环将其消化,置于含有无血清培养基(serum-free medium,SFM)的超低粘附培养板中进行培养,每隔3 d在6孔板每孔中加入适量培养基,至2周后观察到细胞形成多细胞球体悬浮于培养基中,收集多细胞球体于胰蛋白酶中消化,将细胞球体吹散成为单细胞,离心洗涤后,接种于SFM中继续培养,扩增至第2代多细胞球体形成并进行相关实验。
1.4 DDP处理A549细胞及A549细胞球将A549细胞和A549细胞球消化并接种到培养瓶或培养板中24 h后,使用DDP注射液(江苏豪森制药公司)以0(对照组)、1、2、5、10、20 mg/mL的浓度分别处理A549细胞及细胞球48 h。
1.5 EA干预A549细胞球将A549细胞球消化后并接种到培养瓶中,培养24 h后,换成新鲜的SFM培养基,加入各种剂量的EA处理48 h,对照组为加入等量的PBS。
1.6 GST活性的测定用细胞刮子将处理好的细胞刮下并收集。细胞用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤1遍,加入200 μL GST分析缓冲液后用超声破碎仪破碎细胞,4 ℃ 12 000r/min离心10 min,收集上清进行检测。分别取50 μL的样本、阳性对照和阴性对照,加入5 μL的谷胱甘肽后重新混匀,再加入1 μL GST反应底物,室温反应5 min中后,340 nm处进行测定光密度值[D(340)]。
1.7 流式细胞术检测ROS表达收集2×107个细胞后用1 mL无血清培养液稀释(1:1 000) 的DCFH-DA工作液重悬,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3~5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。细胞用200 μL上机专用Buffer稀释后,流式细胞仪用488 nm激发波长检测。
1.8 相差显微镜观察雷帕霉素对A549细胞球成球能力将A549细胞球消化成细胞悬液,计数后将细胞浓度调整到1×105/孔,接种于6孔板后加入SFM培养液培养24 h后,加入分别含有PBS和200 μmol/L EA的SFM,连续培养14 d,镜下观察细胞成球情况。
1.9 流式细胞术检测细胞凋亡收集107个细胞后用含有2%胎牛血清的PBS重悬,300×g离心10 min后弃去上清,加入80 μL缓冲液后,再加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后室温避光孵育15 min,上机前加入5 μL的PI染色,室温避光孵育10 min,使用流式细胞仪检测。
1.10 β-catenin腺病毒(adv β-catenin)感染A549细胞球A549细胞球消化成细胞悬液后,接种于培养甁中。培养24 h后,换成新鲜无抗生素的SFM培养基,分别加入β-catenin腺病毒(Adv β-catenin) (MOI=200) 和空载体(Adv vector)继续培养12 h后,换液进行培养和进行下一步实验。
1.11 CCK-8检测不同处理后A549细胞以及细胞球存活率取生长良好的A549细胞以及细胞球消化成细胞悬液,计数并将细胞浓度调整到3×103/孔,接种于96孔板后分别加入F12K和SFM培养液,进行处理后,分别于12、24、36、48 h在每孔中加入10 μL的CCK-8溶液,孵育4 h后。用酶标仪在570 nm处检测各孔光密度值[D(570)],空白孔凋零。
1.12 Real-time PCR检测β-catenin、Sox2和ABCG2的表达收集A549细胞球后,用TRIzol提取总RNA。应用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。cDNA采用Bio-Rad CFX Manager系统进行实时荧光定量PCR检测β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA的表达,以β-actin作为内参(引物见表 1)。每个待测基因设3个复孔,按照公式RQ=2-△△Ct计算各组间的倍数关系。
基因 | 引物序列(5′→3′) | 产物长度(bp) | 扩增温度(℃) |
Sox2 | 上游: ATCACCCACAGCAAATGACA 下游: CAAAGCTCCTACCGTACCACTA |
245 | 60 |
β-catenin | 上游: GCGCCATTTTAAGCCTCTCG 下游: AAATACCCTCAGGGGAACAGG |
183 | 60 |
ABCG2 | 上游: GAACCCAAGGAGATAGGAGA 下游: CTAGACAGACTTCAACCAGG |
225 | 60 |
β-actin | 上游: CCTGTACGCCAACACAGTGC 下游: ATACTCCTGCTTGCTGATCC |
211 | 60 |
1.13 Western blot检测CD133、EpCAM、Sox2、ABCG2和β-catenin蛋白的表达
悬浮的细胞球直接离心后,加入300 μL蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂混合液,冰上裂解10 min;贴壁细胞需用胰酶消化后离心,收集细胞并裂解。经4 ℃、12 000 r/min离心20 min,吸取上清液。总蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳。湿膜后,将PVDF膜室温封闭1 h,分别加入CD133、EpCAM、Sox2、ABCG2和β-catenin(BSA稀释,比例均为1:500) 抗体及兔抗β-actin抗体(稀释比例1:10 000) 的抗体稀释液中4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后,二抗室温孵育1 h。用ECL化学发光法检测各种蛋白的表达水平。所得蛋白条带图片,使用Image-Pro Plus 10.0对图像进行分析,以同一标本β-actin作为内参校正各自目的蛋白。
1.14 统计学处理各实验至少重复3次,使用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析,组间进行t检验,组内进行单因素方差分析。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 A549细胞球的培养、干细胞标志物及耐药能力检测将A549细胞培养7 d后,可见紧密型克隆和疏松型克隆(图 1)。利用克隆环挑起紧密型克隆,用SFM培养14 d后,可观察到50~100个细胞聚集形成,折光性强,悬浮在培养基中的细胞球(图 1)。A549细胞球中CD133、EpCAM、SOX2以及ABCG2的表达水平较A549细胞显著升高(图 2)。用不同浓度的DDP分别处理A549细胞球和A549细胞,随着浓度的增加,与A549细胞的细胞活力0 h比较,显著下调(P < 0.05),而A549细胞球的细胞活力无显著变化(P > 0.05,图 3)。此外,基于我们的前期研究[4-5],后续实验我们将使用5 mg/mL的DDP处理A549细胞球。
2.2 EA对A549细胞球中GST活性和ROS水平的影响
随着EA浓度从10 μmol/L到200 μmol/L逐渐升高,A549细胞球中GST的活性逐渐降低(图 4, P < 0.05)。由于200 μmol/L EA处理使GST活性降至最低,因此后续实验EA均使用200 μmol/L的浓度对A549细胞球进行处理。我们用200 μmol/L EA处理A549细胞球48 h后用流式细胞仪检测ROS水平(图 5),EA处理组(240.0±3.6),对照组(142.7±2.4)。EA处理组较对照组的ROS水平显著升高(P < 0.01)。上述结果说明EA可以特异性抑制GST的活性,并上调ROS水平。
2.3 EA抑制A549细胞球的生长和促进细胞凋亡
CCK-8检测结果显示,5 mg/mL DDP组、200 μmol/L EA组和5 mg/mL DDP+200 μmol/L EA组在24、36 h和48 h的细胞抑制率均显著高于对照组(P < 0.05,图 6)。此外,5 mg/mL DDP+200 μmol/L EA组在24、36 h和48 h时的细胞抑制率均高于5 mg/mL DDP组和200 μmol/L EA组(P < 0.05)。流式细胞术检测凋亡结果显示,5 mg/mL DDP+200 μmol/L EA组、5 mg/mL DDP组和200 μmol/L EA较对照组凋亡率显著升高(图 7)。细胞成球实验中(图 8),我们发现200 μmol/L EA处理A549细胞球第14天后细胞球的体积较对照组明显减少,细胞球中细胞连接较为疏松,细胞折光性减弱(图 8),并且EA处理组每5 000个细胞的成球数量(7.33±0.88) 也比对照组(17.33±0.88) 明显减少。上述结果说明EA可有效抑制A549细胞球的增殖、促进其凋亡和细胞的成球能力。
2.4 EA干预A549细胞球对Sox2、ABCG2和β-catenin表达以及β-catenin启动子活性的影响
我们应用200 μmol/L EA干预A549细胞球48 h后,Western blot和Real-time PCR检测发现β-catenin、Sox2和ABCG2的蛋白和mRNA水平显著下降(P < 0.05,图 9、10)。上述研究提示EA通过抑制了β-catenin及其下游Sox2和ABCG2的表达。
2.5 过表达β-catenin减弱EA对A549细胞球抑制增殖的作用
Western blot和Real-time PCR检测结果显示,使用腺病毒过表达β-catenin后,β-catenin、Sox2和ABCG2的蛋白和mRNA水平显著上升(P < 0.05)。再用200 μmol/L EA处理过表达β-catenin的A549细胞球后,显著抑制了β-catenin、Sox2和ABCG2的蛋白和mRNA的表达(P < 0.05,图 11、12)。用CCK-8检测上述处理后细胞抑制率的变化,结果显示过表达β-catenin可显著削弱5 mg/mL DDP和200 μmol/L EA联合作用对A549细胞球增殖的抑制作用(图 13)。
3 讨论
本研究成功诱导出富含LCSCs的A549细胞球,其可耐受DDP的杀伤作用。应用EA可显著降低A549细胞球中GST的活性,上调ROS水平,进而抑制β-catenin和Sox2的表达,导致A549细胞球的增殖和成球能力受到抑制,促进了细胞凋亡。此外,由于EA抑制了耐药相关蛋白ABCG2的表达,因此EA联合DDP较EA单独处理更有效地杀伤A549细胞球细胞,而上调β-catenin的表达,可部分逆转EA联合DDP对A549细胞球的抑制作用。上述研究说明EA可有效杀伤富含LCSCs的A549细胞球,其可能是通过上调ROS、下调β-catenin、Sox2和ABCG2发挥杀伤作用的。
CSCs在肿瘤的发生、进展中发挥着多种作用。前期的研究表明按照一定的干细胞标志物,通过磁珠分选或者流式细胞术可从多种肺癌细胞系及肺癌中分选出CSCs[14-16]。这些CSCs均可在SFM培养基中生成细胞球。由于肿瘤中的亲代CSCs只会将干细胞特性遗传给子代CSCs,所以肿瘤细胞在体外可形成不同形态的克隆。紧密克隆是由于CSCs组成,而疏松性克隆不具有CSCs的特征[17-18]。因此,我们前期研究及本研究均采用挑选紧密性克隆进行无血清培养,从而获得A549细胞球[5]。我们发现A549细胞球较A549细胞的干细胞标志物CD133、SOX2以及EpCAM的蛋白表达水平显著升高,并且A549细胞球上调耐药相关基因ABCG2的表达,并可耐受DDP的杀伤作用。上述研究表明,我们成功分离和培养出富含肿瘤干细胞的A549细胞球,为进一步的研究奠定了基础。
研究表明,EA不仅可直接杀伤肿瘤细胞[7],而且可以增强酪氨酸激酶抑制、DDP对表皮生长因子受体突变的乳腺癌细胞[10]以及白血病细胞[8]的杀伤作用。本研究也发现,EA不仅可有效杀伤A549细胞球的作用,而且逆转了A549细胞球对DDP的天然耐药,使DDP能有效杀伤A549细胞球。此外,EA还能显著抑制A549细胞球的形成。上述研究表明EA是一种可有效抑制肿瘤干细胞的药物。研究表明,抑制GST是EA发挥作用的重要途径之一[19]。GST通常在肿瘤细胞中呈高表达,其通过减少谷胱甘肽的形成和绑定亲电子成分,进而发挥细胞解毒和抵抗药物杀伤作用。本研究发现EA可显著抑制A549细胞球中GST的活性,其可能削弱了A549细胞球对DDP的耐受能力,并增强了DDP的细胞毒性。此外,本研究发现EA上调了细胞中ROS的水平,其可能是由于EA抑制了GST的活性导致的[20]。而上调的ROS水平可导致肿瘤干细胞中细胞线粒体以及DNA的损伤[21],并激活相关凋亡信号通路,进而促进细胞的凋亡[22-23]。
抑制Wnt信号通路也是EA发挥作用的重要机制[24]。大量研究表明Wnt信号通路在多种肿瘤中异常激活,其参与了肿瘤的发生、进展和转移等[10, 25-26]。而在肿瘤干细胞中,Wnt信号通路也同样发挥着关键作用:激活Wnt/β-catenin信号通路可促进卵巢癌细胞以及食管癌细胞的肿瘤干细胞特征[27-28],其可能是通过上调肿瘤干细胞标志物Nanog、Oct-4和Sox2发挥作用的[29-30]。研究指出,EA对可直接通过抑制Wnt5a,或者通过降低β-catenin蛋白稳定性加速其降解,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路[24, 31]。本研究发现,EA不仅可以抑制β-catenin的表达,而且显著抑制β-catenin启动子的活性以及A549细胞球的干性(下调Sox2和抑制成球能力)。而通过腺病毒过表达β-catenin,可明显降低EA对A549细胞球增殖的抑制作用以及对β-catenin下游Sox2和ABCG2的下调影响。这些结果说明β-catenin是A549细胞球是A549细胞球维持肿瘤干细胞特性的关键分子,也是EA的关键作用靶点。EA可能通过下调蛋白稳定性和抑制启动子活性两种方式抑制β-catenin。
抑制Wnt信号通路也是EA发挥作用的重要机制[24]。大量研究表明Wnt信号通路在多种肿瘤中异常激活,其参与了肿瘤的发生、进展和转移等[10, 25-26]。而在肿瘤干细胞中,Wnt信号通路也同样发挥着关键作用:激活Wnt/β-catenin信号通路可促进卵巢癌细胞以及食管癌细胞的肿瘤干细胞特征[27-28],其可能是通过上调肿瘤干细胞标志物Nanog、Oct-4和Sox2发挥作用的[29-30]。研究指出,EA对可直接通过抑制Wnt5a,或者通过降低β-catenin蛋白稳定性加速其降解,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路[24, 31]。本研究发现,EA不仅可以抑制β-catenin的表达,而且显著抑制β-catenin启动子的活性以及A549细胞球的干性(下调Sox2和抑制成球能力)。而通过腺病毒过表达β-catenin,可明显降低EA对A549细胞球增殖的抑制作用以及对β-catenin下游Sox2和ABCG2的下调影响。这些结果说明β-catenin是A549细胞球是A549细胞球维持肿瘤干细胞特性的关键分子,也是EA的关键作用靶点。EA可能通过下调蛋白稳定性和抑制启动子活性两种方式抑制β-catenin。
本研究证实了EA可有效抑制富含LCSCs的A549细胞球的增殖和干性,诱导其凋亡。同时EA可逆转A549细胞球对DDP的耐药性,DDP和EA的联合应用更有效地杀伤A549细胞球。EA发挥上述作用主要通过抑制GST,促进ROS生成和抑制β-catenin及其下游SOX2、ABCG2发挥作用。上述研究结果说明EA是一种有效的抗肺癌及肺癌干细胞的药物,可望应用于临床。
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