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依他尼酸联合顺铂化疗促肺癌A549细胞凋亡的作用及机制研究
黄玲萍1,2, 谢丽霞1, 邱钰超3, 胡萍1, 叶小群1     
1. 330006 南昌,南昌大学第二附属医院呼吸内科;
2. 343000 江西 吉安,江西省井冈山大学临床医学院内科教研室;
3. 338001 江西 新余,江西省新钢中心医院呼吸内科
[摘要] 目的 探讨依他尼酸(ethacrynic acid,EA)杀伤肺癌A549细胞球的作用及机制研究。方法 无血清培养基中培养A549细胞球,应用Western blot检测CD133、SOX2、EpCAM和ABCG2的蛋白表达水平。应用1、2、5、10、20 mg/mL的浓度顺铂(cisplatin,DDP)分别处理A549及细胞球48 h,用MTT检测48 h内细胞的存活率。应用比色法检测10、50、100、200 μmol/L EA对A549细胞球中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性的抑制作用。应用流式细胞术、Western blot、Real-time-PCR、相差显微镜观察检测200 μmol/L EA处理A549细胞球前后ROS水平、细胞成球能力、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白以及β-catenin启动子活性的变化情况。应用β-catenin腺病毒感染A549细胞球后,再用200 μmol/L EA的处理A549细胞球,利用Real-time PCR和Western blot检测β-catenin S、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的变化,并用MTT检测A549细胞球增殖的抑制作用。结果 成功培养出悬浮的A549细胞球,其高表达肿瘤干细胞标志物CD133、SOX2、EpCAM以及耐药相关蛋白ABCG2,并可耐受不同浓度DDP的杀伤作用。200 μmol/L EA处理A549细胞球后ROS水平明显升高,而GST活性、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的表达、β-catenin的启动子活性、A549细胞球的成球能力显著下降,并且200 μmol/L EA联合5 mg/mL DDP可增强对抑制A549细胞球增殖的作用和增加细胞凋亡的水平(P < 0.05)。过表达β-catenin后,200 μmol/L EA对β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的抑制作用较空载体组显著减弱。此外,过表达β-catenin可显著缓解200 μmol/L EA联合5 mg/mL DDP对A549细胞球的增殖抑制作用。结论 EA通过抑制GST活性和β-catenin水平,发挥抑制A549细胞球增殖和干性,促进其凋亡的作用。EA可望成为治疗肺癌及肺癌干细胞的药物。
[关键词] 肺癌干细胞     依他尼酸     GST     β-catenin    
Ethacrynic acid promotes apoptosis in lung cancer A549 cells when combined with cisplatin chemotherapy
HUANG Lingping1,2 , XIE Lixia1 , QIU Yuchao3 , HU Ping1 , YE Xiaoqun1     
1. Department of Respiratory Diseases, Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang, Jiangxi Province, 330006;
2. Department of Internal Medicine Teaching, College of Clinical Medicine, Jinggangshan University, Ji'an, Jiangxi Province, 343000;
3. Department of Respiratory Diseases, Xingang Central Hospital of Jiangxi Province, Xinyu, Jiangxi Province, 338001, China
Supported by the Tackling Project of Social Development of Jiangxi Provincial Department of Science and Technology (20141BBG70035) and the Major Science and Technology Project of Jiangxi Province (20143ACB20011)
Corresponding author: YE Xiaoqun, E-mail: 511201663@qq.com
[Abstract] Objective To investigate the killing effect of ethacrynic acid (EA) on lung cancer A549 cells derived spheres and explore the underlying mechanism. Methods A549 spheres were cultured in serum-free medium, and the protein expression of CD133, SOX2, EpCAM and ABCG2 was detected by Western blotting. MTT assay was used to evaluate the cell viability of A549 spheres and A549 cells after treated by 1, 2, 5, 10 and 20 mg/mL cisplatin (DDP) for 48 h. The activity of glutathione S-transferase (GST) was measured by colorimetric method after A549 spheres were treated with 10, 50, 100 and 200 μmol/L EA, respectively. Flow cytometry, Western blotting, real-time PCR and luciferase assay were used to analyze the levels of cellular reactive oxygen species (ROS), formation of A549 spheres, mRNA and protein expression levels of β-catenin, Sox2 and ABCG2, and promoter activity of β-catenin upon 200 μmol/L EA treated cells for 48 h. A549 sphere was infected with β-catenin adenovirus for 24 h, followed by 200 μmol/L EA treatment (in presence or absence of 5 mg/mL DDP) for 24 h. The expression of β-catenin, Sox2 and ABCG2 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blotting, and cell growth of A549 spheres was evaluated by MTT assay. Results The A549 spheres, with high expression of tumor stem cells markers CD133, SOX2, EpCAM and drug resistance related molecule ABCG2, and resistance to DDP at different doses, were successfully derived. After 200 μmol/L EA had treated A549 sphere for 48 h, the levels of ROS were significantly increased (P < 0.05), and the mRNA and protein levels of β-catenin, Sox2 and ABCG2, and promoter activity of β-catenin were notably decreased (P < 0.05). The treatment of 200 μmol/L EA enhanced the inhibitory effect on proliferation and the promoting effect on apoptosis in A549 spheres induced by 5 mg/mL DDP (P < 0.05). Up-regulation of β-catenin by adenoviral infection partly reversed the effects of 200 μmol/L EA on suppressing the expression levels of β-catenin, Sox2 and ABCG2, compared to the spheres infected with blank adenovirus. Additionally, β-catenin over-expression significantly remitted the inhibitory effect of 200 μmol/L EA and 5 mg/mL DDP on the proliferation in A549 spheres. Conclusion EA exerts inhibitory effect on the proliferation and stemness of A549 spheres through suppressing GST activity and β-catenin expression, and then promotes cell apoptosis. EA might beanovel drug in treatment of lung cancer and cancer stem cells.
[Key words] lung cancer stem cells     ethacrynic acid     glutathione S-transferase     β-catenin    

肿瘤干细胞(cancer stem cells)是一群可无限自我更新、多向分化能力和更强增殖能力的肿瘤细胞[1-2]。大量研究表明肺癌细胞中存在一小群细胞,分离培养后发现其除了具有自我更新、分化能力以外,其增殖能力较普通的肺癌细胞更强,并具有对化疗药物天然的耐受性[3-5],该群细胞被称为肺癌干细胞(lung cancer stem cells,LCSCs)。鉴于利用目前一线化疗药物很难杀伤LCSCs,使LCSCs成为肺癌化疗后复发、耐药、转移的种子[6]。因此,探索新的逆转LCSCs耐药的策略是目前研究热点。

依他尼酸(ethacrynic acid, EA)是一种利尿剂和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)的抑制剂[7]。研究表明,高浓度的EA可以抑制直肠癌、神经肿瘤细胞等的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡[8-10]。文献[11-12]报道EA可促进肿瘤细胞内的氧化应激水平,进而诱导细胞的死亡。此外,研究还发现EA可以增强顺铂(cisplatin,DDP)等化疗药物的细胞毒性[8, 13]。但是EA在肿瘤干细胞中发挥何种作用仍不清楚。本研究通过获得富含肺癌干细胞的A549细胞球,研究EA对LCSCs的耐药能力的影响和对A549细胞球的杀伤效应及机制。

1 材料与方法 1.1 试剂

F12K培养基、DMEM/F12培养基、B27(50×)均购自Gibco公司;重组人上皮生长因子购自Protech公司;EA、胰岛素和碱性成纤维生长因子购自Sigma公司;胎牛血清购自Pan公司;抗CD133、EpCAM、Sox2、ABCG2、β-catenin抗体购自Abcam公司;总蛋白裂解试剂、β-actin抗体以及HRP标记二抗购自上海梦至生物科技公司;ECL发光底物购自Milipore公司。活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测盒以及CCK-8试剂盒购自碧云天生物科技公司;GST活性检测试剂盒购自Biovision公司;凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技公司;逆转录试剂盒购自赛默飞世尔公司;实时定量PCR试剂盒购自罗氏公司;β-catenin过表达腺病毒和对照均购自汉恒(上海)生物技术公司。

1.2 A549细胞的培养

A549细胞使用F12K+10%胎牛血清进行培养,取对数生长期细胞进行下一步实验。

1.3 A549细胞球的培养

将A549细胞以200个/孔接种到6孔板中,待其长成克隆(10~14 d)后,将紧密型克隆使用克隆环将其消化,置于含有无血清培养基(serum-free medium,SFM)的超低粘附培养板中进行培养,每隔3 d在6孔板每孔中加入适量培养基,至2周后观察到细胞形成多细胞球体悬浮于培养基中,收集多细胞球体于胰蛋白酶中消化,将细胞球体吹散成为单细胞,离心洗涤后,接种于SFM中继续培养,扩增至第2代多细胞球体形成并进行相关实验。

1.4 DDP处理A549细胞及A549细胞球

将A549细胞和A549细胞球消化并接种到培养瓶或培养板中24 h后,使用DDP注射液(江苏豪森制药公司)以0(对照组)、1、2、5、10、20 mg/mL的浓度分别处理A549细胞及细胞球48 h。

1.5 EA干预A549细胞球

将A549细胞球消化后并接种到培养瓶中,培养24 h后,换成新鲜的SFM培养基,加入各种剂量的EA处理48 h,对照组为加入等量的PBS。

1.6 GST活性的测定

用细胞刮子将处理好的细胞刮下并收集。细胞用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤1遍,加入200 μL GST分析缓冲液后用超声破碎仪破碎细胞,4 ℃ 12 000r/min离心10 min,收集上清进行检测。分别取50 μL的样本、阳性对照和阴性对照,加入5 μL的谷胱甘肽后重新混匀,再加入1 μL GST反应底物,室温反应5 min中后,340 nm处进行测定光密度值[D(340)]。

1.7 流式细胞术检测ROS表达

收集2×107个细胞后用1 mL无血清培养液稀释(1:1 000) 的DCFH-DA工作液重悬,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3~5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。细胞用200 μL上机专用Buffer稀释后,流式细胞仪用488 nm激发波长检测。

1.8 相差显微镜观察雷帕霉素对A549细胞球成球能力

将A549细胞球消化成细胞悬液,计数后将细胞浓度调整到1×105/孔,接种于6孔板后加入SFM培养液培养24 h后,加入分别含有PBS和200 μmol/L EA的SFM,连续培养14 d,镜下观察细胞成球情况。

1.9 流式细胞术检测细胞凋亡

收集107个细胞后用含有2%胎牛血清的PBS重悬,300×g离心10 min后弃去上清,加入80 μL缓冲液后,再加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后室温避光孵育15 min,上机前加入5 μL的PI染色,室温避光孵育10 min,使用流式细胞仪检测。

1.10 β-catenin腺病毒(adv β-catenin)感染A549细胞球

A549细胞球消化成细胞悬液后,接种于培养甁中。培养24 h后,换成新鲜无抗生素的SFM培养基,分别加入β-catenin腺病毒(Adv β-catenin) (MOI=200) 和空载体(Adv vector)继续培养12 h后,换液进行培养和进行下一步实验。

1.11 CCK-8检测不同处理后A549细胞以及细胞球存活率

取生长良好的A549细胞以及细胞球消化成细胞悬液,计数并将细胞浓度调整到3×103/孔,接种于96孔板后分别加入F12K和SFM培养液,进行处理后,分别于12、24、36、48 h在每孔中加入10 μL的CCK-8溶液,孵育4 h后。用酶标仪在570 nm处检测各孔光密度值[D(570)],空白孔凋零。

1.12 Real-time PCR检测β-catenin、Sox2和ABCG2的表达

收集A549细胞球后,用TRIzol提取总RNA。应用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。cDNA采用Bio-Rad CFX Manager系统进行实时荧光定量PCR检测β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA的表达,以β-actin作为内参(引物见表 1)。每个待测基因设3个复孔,按照公式RQ=2-△△Ct计算各组间的倍数关系。

表 1 目的基因的引物、扩增条件及产物大小
基因 引物序列(5′→3′) 产物长度(bp) 扩增温度(℃)
Sox2 上游: ATCACCCACAGCAAATGACA
下游: CAAAGCTCCTACCGTACCACTA
245 60
β-catenin 上游: GCGCCATTTTAAGCCTCTCG
下游: AAATACCCTCAGGGGAACAGG
183 60
ABCG2 上游: GAACCCAAGGAGATAGGAGA
下游: CTAGACAGACTTCAACCAGG
225 60
β-actin 上游: CCTGTACGCCAACACAGTGC
下游: ATACTCCTGCTTGCTGATCC
211 60

1.13 Western blot检测CD133、EpCAM、Sox2、ABCG2和β-catenin蛋白的表达

悬浮的细胞球直接离心后,加入300 μL蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂混合液,冰上裂解10 min;贴壁细胞需用胰酶消化后离心,收集细胞并裂解。经4 ℃、12 000 r/min离心20 min,吸取上清液。总蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳。湿膜后,将PVDF膜室温封闭1 h,分别加入CD133、EpCAM、Sox2、ABCG2和β-catenin(BSA稀释,比例均为1:500) 抗体及兔抗β-actin抗体(稀释比例1:10 000) 的抗体稀释液中4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后,二抗室温孵育1 h。用ECL化学发光法检测各种蛋白的表达水平。所得蛋白条带图片,使用Image-Pro Plus 10.0对图像进行分析,以同一标本β-actin作为内参校正各自目的蛋白。

1.14 统计学处理

各实验至少重复3次,使用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析,组间进行t检验,组内进行单因素方差分析。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 A549细胞球的培养、干细胞标志物及耐药能力检测

将A549细胞培养7 d后,可见紧密型克隆和疏松型克隆(图 1)。利用克隆环挑起紧密型克隆,用SFM培养14 d后,可观察到50~100个细胞聚集形成,折光性强,悬浮在培养基中的细胞球(图 1)。A549细胞球中CD133、EpCAM、SOX2以及ABCG2的表达水平较A549细胞显著升高(图 2)。用不同浓度的DDP分别处理A549细胞球和A549细胞,随着浓度的增加,与A549细胞的细胞活力0 h比较,显著下调(P < 0.05),而A549细胞球的细胞活力无显著变化(P > 0.05,图 3)。此外,基于我们的前期研究[4-5],后续实验我们将使用5 mg/mL的DDP处理A549细胞球。

A:A549细胞形成的克隆蓝色箭头为紧密型克隆,绿色箭头为疏松型克隆;B:A549细胞球 图 1 相差显微镜观察A549细胞克隆及A549细胞球变化(×200)

1:A549细胞球;2:A549细胞 图 2 Western blot检测A549细胞球和A549细胞中干细胞标志物CD133、EpCAM、SOX2以及ABCG2的表达水平

a:P < 0.05,与DDP处理0 h比较 图 3 CCK-8检测不同浓度DDP分别处理A549细胞球和A549细胞48 h后细胞存活率变化

2.2 EA对A549细胞球中GST活性和ROS水平的影响

随着EA浓度从10 μmol/L到200 μmol/L逐渐升高,A549细胞球中GST的活性逐渐降低(图 4, P < 0.05)。由于200 μmol/L EA处理使GST活性降至最低,因此后续实验EA均使用200 μmol/L的浓度对A549细胞球进行处理。我们用200 μmol/L EA处理A549细胞球48 h后用流式细胞仪检测ROS水平(图 5),EA处理组(240.0±3.6),对照组(142.7±2.4)。EA处理组较对照组的ROS水平显著升高(P < 0.01)。上述结果说明EA可以特异性抑制GST的活性,并上调ROS水平。

1:对照组,2:10 μmol/L EA组,3:50 μmol/L EA组,4:100 μmol/L EA组,5:200 μmol/L EA组
a:P < 0.05,与对照组比较;b:P < 0.05,与10 μmol/L EA组比较;c:P < 0.05,与50 μmol/L EA组比较;d:P < 0.05,与100 μmol/L EA组比较
图 4 不同浓度EA处理A549细胞球48 h后GST活性的变化

图 5 流式细胞术检测200 μmol/L EA处理A549细胞球48 h后DCFH的荧光强度(胞内ROS水平)

2.3 EA抑制A549细胞球的生长和促进细胞凋亡

CCK-8检测结果显示,5 mg/mL DDP组、200 μmol/L EA组和5 mg/mL DDP+200 μmol/L EA组在24、36 h和48 h的细胞抑制率均显著高于对照组(P < 0.05,图 6)。此外,5 mg/mL DDP+200 μmol/L EA组在24、36 h和48 h时的细胞抑制率均高于5 mg/mL DDP组和200 μmol/L EA组(P < 0.05)。流式细胞术检测凋亡结果显示,5 mg/mL DDP+200 μmol/L EA组、5 mg/mL DDP组和200 μmol/L EA较对照组凋亡率显著升高(图 7)。细胞成球实验中(图 8),我们发现200 μmol/L EA处理A549细胞球第14天后细胞球的体积较对照组明显减少,细胞球中细胞连接较为疏松,细胞折光性减弱(图 8),并且EA处理组每5 000个细胞的成球数量(7.33±0.88) 也比对照组(17.33±0.88) 明显减少。上述结果说明EA可有效抑制A549细胞球的增殖、促进其凋亡和细胞的成球能力。

a: P < 0.05,与对照组比较; b:P < 0.05, 与5 mg/mL DDP组比较;c: P < 0.05,与200 μmol/L EA组比较 图 6 CCK-8检测各组细胞抑制率的变化

A:对照组;B:5 mg/mL DDP组;C:200 μmol/L EA组;D:5 mg/mL DDP+200 μmol/L EA组 图 7 流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化

A:对照组;B:200 μmol/L EA组 图 8 相差显微镜观察200 μmol/L EA处理A549细胞球14 d后对其细胞成球能力的影响(×200)

2.4 EA干预A549细胞球对Sox2、ABCG2和β-catenin表达以及β-catenin启动子活性的影响

我们应用200 μmol/L EA干预A549细胞球48 h后,Western blot和Real-time PCR检测发现β-catenin、Sox2和ABCG2的蛋白和mRNA水平显著下降(P < 0.05,图 910)。上述研究提示EA通过抑制了β-catenin及其下游Sox2和ABCG2的表达。

1:对照组,2:200 μmol/L EA组 图 9 Western blot检测200 μmol/L EA处理A549细胞球48 h后Sox2、ABCG2和β-catenin蛋白水平的变化

a: P < 0.05, 与对照组比较 图 10 Real-time PCR检测200 μmol/L EA处理A549细胞球48 h后Sox2、ABCG2和β-catenin mRNA水平的变化

2.5 过表达β-catenin减弱EA对A549细胞球抑制增殖的作用

Western blot和Real-time PCR检测结果显示,使用腺病毒过表达β-catenin后,β-catenin、Sox2和ABCG2的蛋白和mRNA水平显著上升(P < 0.05)。再用200 μmol/L EA处理过表达β-catenin的A549细胞球后,显著抑制了β-catenin、Sox2和ABCG2的蛋白和mRNA的表达(P < 0.05,图 1112)。用CCK-8检测上述处理后细胞抑制率的变化,结果显示过表达β-catenin可显著削弱5 mg/mL DDP和200 μmol/L EA联合作用对A549细胞球增殖的抑制作用(图 13)。

1:空载体组,2:β-catenin腺病毒组,3:200 μmol/L EA+空载体组,4:200 μmol/L EA+β-catenin腺病毒组 图 11 Western blot检测各组Sox2、ABCG2和β-catenin蛋白水平的变化

a: P < 0.05, 与空载体组比较; b:P < 0.05,与β-catenin腺病毒组比较; c: P < 0.05, 与200 μmol/L EA组比较 图 12 Real-time PCR检测各组Sox2、ABCG2和β-catenin mRNA水平的变化

a:P < 0.05,与空载体组比较; b:P < 0.05, 与β-catenin腺病毒组比较;c:P < 0.05, 与5 mg/mL DDP+ 200 μmol/L EA联合处理组比较 图 13 CCK-8检测不同处理后细胞抑制率的变化

3 讨论

本研究成功诱导出富含LCSCs的A549细胞球,其可耐受DDP的杀伤作用。应用EA可显著降低A549细胞球中GST的活性,上调ROS水平,进而抑制β-catenin和Sox2的表达,导致A549细胞球的增殖和成球能力受到抑制,促进了细胞凋亡。此外,由于EA抑制了耐药相关蛋白ABCG2的表达,因此EA联合DDP较EA单独处理更有效地杀伤A549细胞球细胞,而上调β-catenin的表达,可部分逆转EA联合DDP对A549细胞球的抑制作用。上述研究说明EA可有效杀伤富含LCSCs的A549细胞球,其可能是通过上调ROS、下调β-catenin、Sox2和ABCG2发挥杀伤作用的。

CSCs在肿瘤的发生、进展中发挥着多种作用。前期的研究表明按照一定的干细胞标志物,通过磁珠分选或者流式细胞术可从多种肺癌细胞系及肺癌中分选出CSCs[14-16]。这些CSCs均可在SFM培养基中生成细胞球。由于肿瘤中的亲代CSCs只会将干细胞特性遗传给子代CSCs,所以肿瘤细胞在体外可形成不同形态的克隆。紧密克隆是由于CSCs组成,而疏松性克隆不具有CSCs的特征[17-18]。因此,我们前期研究及本研究均采用挑选紧密性克隆进行无血清培养,从而获得A549细胞球[5]。我们发现A549细胞球较A549细胞的干细胞标志物CD133、SOX2以及EpCAM的蛋白表达水平显著升高,并且A549细胞球上调耐药相关基因ABCG2的表达,并可耐受DDP的杀伤作用。上述研究表明,我们成功分离和培养出富含肿瘤干细胞的A549细胞球,为进一步的研究奠定了基础。

研究表明,EA不仅可直接杀伤肿瘤细胞[7],而且可以增强酪氨酸激酶抑制、DDP对表皮生长因子受体突变的乳腺癌细胞[10]以及白血病细胞[8]的杀伤作用。本研究也发现,EA不仅可有效杀伤A549细胞球的作用,而且逆转了A549细胞球对DDP的天然耐药,使DDP能有效杀伤A549细胞球。此外,EA还能显著抑制A549细胞球的形成。上述研究表明EA是一种可有效抑制肿瘤干细胞的药物。研究表明,抑制GST是EA发挥作用的重要途径之一[19]。GST通常在肿瘤细胞中呈高表达,其通过减少谷胱甘肽的形成和绑定亲电子成分,进而发挥细胞解毒和抵抗药物杀伤作用。本研究发现EA可显著抑制A549细胞球中GST的活性,其可能削弱了A549细胞球对DDP的耐受能力,并增强了DDP的细胞毒性。此外,本研究发现EA上调了细胞中ROS的水平,其可能是由于EA抑制了GST的活性导致的[20]。而上调的ROS水平可导致肿瘤干细胞中细胞线粒体以及DNA的损伤[21],并激活相关凋亡信号通路,进而促进细胞的凋亡[22-23]

抑制Wnt信号通路也是EA发挥作用的重要机制[24]。大量研究表明Wnt信号通路在多种肿瘤中异常激活,其参与了肿瘤的发生、进展和转移等[10, 25-26]。而在肿瘤干细胞中,Wnt信号通路也同样发挥着关键作用:激活Wnt/β-catenin信号通路可促进卵巢癌细胞以及食管癌细胞的肿瘤干细胞特征[27-28],其可能是通过上调肿瘤干细胞标志物Nanog、Oct-4和Sox2发挥作用的[29-30]。研究指出,EA对可直接通过抑制Wnt5a,或者通过降低β-catenin蛋白稳定性加速其降解,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路[24, 31]。本研究发现,EA不仅可以抑制β-catenin的表达,而且显著抑制β-catenin启动子的活性以及A549细胞球的干性(下调Sox2和抑制成球能力)。而通过腺病毒过表达β-catenin,可明显降低EA对A549细胞球增殖的抑制作用以及对β-catenin下游Sox2和ABCG2的下调影响。这些结果说明β-catenin是A549细胞球是A549细胞球维持肿瘤干细胞特性的关键分子,也是EA的关键作用靶点。EA可能通过下调蛋白稳定性和抑制启动子活性两种方式抑制β-catenin。

抑制Wnt信号通路也是EA发挥作用的重要机制[24]。大量研究表明Wnt信号通路在多种肿瘤中异常激活,其参与了肿瘤的发生、进展和转移等[10, 25-26]。而在肿瘤干细胞中,Wnt信号通路也同样发挥着关键作用:激活Wnt/β-catenin信号通路可促进卵巢癌细胞以及食管癌细胞的肿瘤干细胞特征[27-28],其可能是通过上调肿瘤干细胞标志物Nanog、Oct-4和Sox2发挥作用的[29-30]。研究指出,EA对可直接通过抑制Wnt5a,或者通过降低β-catenin蛋白稳定性加速其降解,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路[24, 31]。本研究发现,EA不仅可以抑制β-catenin的表达,而且显著抑制β-catenin启动子的活性以及A549细胞球的干性(下调Sox2和抑制成球能力)。而通过腺病毒过表达β-catenin,可明显降低EA对A549细胞球增殖的抑制作用以及对β-catenin下游Sox2和ABCG2的下调影响。这些结果说明β-catenin是A549细胞球是A549细胞球维持肿瘤干细胞特性的关键分子,也是EA的关键作用靶点。EA可能通过下调蛋白稳定性和抑制启动子活性两种方式抑制β-catenin。

本研究证实了EA可有效抑制富含LCSCs的A549细胞球的增殖和干性,诱导其凋亡。同时EA可逆转A549细胞球对DDP的耐药性,DDP和EA的联合应用更有效地杀伤A549细胞球。EA发挥上述作用主要通过抑制GST,促进ROS生成和抑制β-catenin及其下游SOX2、ABCG2发挥作用。上述研究结果说明EA是一种有效的抗肺癌及肺癌干细胞的药物,可望应用于临床。

参考文献
[1] RAHMAN M, DELEYROLLE L, VEDAM-MAi V, et al. The cancer stem cell hypothesis: failures and pitfalls[J]. Neurosurgery, 2011, 68(2): 531–545. DOI:10.1227/NEU.0b013e3181ff9eb5
[2] TYSNES B B, BJERKVIG R. Cancer initiation and progression: involvement of stem cells and the microenvironment[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1775(2): 283–297. DOI:10.1016/j.bbcan.2007.01.001
[3] QI W, CHEN J, CHENG X, et al. Targeting the wnt-regulatory protein CTNNBIP1 by microRNA-214 enhances the stemness and self-renewal of cancer stem-like cells in lung adenocarcinomas[J]. Stem Cells, 2015, 33(12): 3423–3436. DOI:10.1002/stem.2188
[4] YE X Q, LI Q, WANG G H, et al. Mitochondrial and energy metabolism-related properties as novel indicators of lung cancer stem cells[J]. Int J Cancer, 2011, 129(4): 820–831. DOI:10.1002/ijc.25944
[5] SUN F F, HU Y H, XIONG L P, et al. Enhanced expression of stem cell markers and drug resistance in A549 sphere-forming non-small cell lung cancer cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(6): 6287–6300.
[6] LI F, TIEDE B, MASSAGU J, et al. Beyond tumorigenesis: cancer stem cells in metastasis[J]. Cell Res, 2007, 17(1): 3–14. DOI:10.1038/sj.cr.7310118
[7] WANG R, LI C, SONG D, et al. Ethacrynic acid butyl-ester induces apoptosis in leukemia cells through a hydrogen peroxide mediated pathway independent of glutathione S-transferase P1-1 inhibition[J]. Cancer Res, 2007, 67(16): 7856–7864. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-07-0151
[8] WANG R, LIU C, XIA L, et al. Ethacrynic acid and a derivative enhance apoptosis in arsenic trioxide-treated myeloid leukemia and lymphoma cells: the role of glutathione S-transferase p1-1[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(24): 6690–6701. DOI:10.1158/1078-0432.CCR-12-0770
[9] AIZAWA S, OOKAWA K, KUDO T, et al. Characterization of cell death induced by ethacrynic acid in a human colon cancer cell line DLD-1 and suppression by N-acetyl-L-cysteine[J]. Cancer Sci, 2003, 94(10): 886–893. DOI:10.1111/j.1349-7006.2003.tb01371.x
[10] LIU B, HUANG X, HU Y, et al. Ethacrynic acid improves the antitumor effects of irreversible epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in breast cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(36): 58038–58050. DOI:10.18632/oncotarget.10846
[11] DHANBHOORA C M, BABSON J R. Thiol depletion induces lethal cell injury in cultured cardiomyocytes[J]. Arch Biochem Biophys, 1992, 293(1): 130–139. DOI:10.1016/0003-9861(92)90375-7
[12] PARODY J P, ALVAREZ M L, QUIROGA A, et al. Hepatocytes isolated from preneoplastic rat livers are resistant to ethacrynic acid cytotoxicity[J]. Arch Toxicol, 2007, 81(8): 565–573. DOI:10.1007/s00204-007-0183-8
[13] BYUN S S, KIM S W, CHOI H, et al. Augmentation of cisplatin sensitivity in cisplatin-resistant human bladder cancer cells by modulating glutathione concentrations and glutathione-related enzyme activities[J]. BJU Int, 2005, 95(7): 1086–1090. DOI:10.1111/j.1464-410X.2005.05472.x
[14] HO M M, NG A V, LAM S, et al. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells[J]. Cancer Res, 2007, 67(10): 4827–4833. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-06-3557
[15] BERTOLINI G, ROZ L, PEREGO P, et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(38): 16281–16286. DOI:10.1073/pnas.0905653106
[16] SALCIDO C D, LAROCHELLE A, TAYLOR B J, et al. Molecular characterisation of side population cells with cancer stem cell-like characteristics in small-cell lung cancer[J]. Br J Cancer, 2010, 102(11): 1636–1644. DOI:10.1038/sj.bjc.6605668
[17] LI H, CHEN X, CALHOUN-DAVIS T, et al. PC3 human prostate carcinoma cell holoclones contain self-renewing tumor-initiating cells[J]. Cancer Res, 2008, 68(6): 1820–1825. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-07-5878
[18] ZHOU Z H, PING Y F, YU SC, et al. A novel approach to the identification and enrichment of cancer stem cells from a cultured human glioma cell line[J]. Cancer Lett, 2009, 281(1): 92–99. DOI:10.1016/j.canlet.2009.02.033
[19] YAN F, YANG W K, LI X Y, et al. A trifunctional enzyme with glutathione S-transferase, glutathione peroxidase and superoxide dismutase activity[J]. Biochim Biophys Acta, 2008, 1780(6): 869–872. DOI:10.1016/j.bbagen.2008.03.003
[20] ITO K, SUDA T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2014, 15(4): 243–256. DOI:10.1038/nrm3772
[21] LIM E J, HEO J, KIM Y H. Tunicamycin promotes apoptosis in leukemia cells through ROS generation and downregulation of survivin expression[J]. Apoptosis, 2015, 20(8): 1087–1098. DOI:10.1007/s10495-015-1135-z
[22] ZHANG Y, HAN L, QI W, et al. Eicosapentaenoic acid (EPA) induced apoptosis in HepG2 cells through ROS-Ca(2+)-JNK mitochondrial pathways[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 456(4): 926–932. DOI:10.1016/j.bbrc.2014.12.036
[23] LU D, LIU J X, ENDO T, et al. Ethacrynic acid exhibits selective toxicity to chronic lymphocytic leukemia cells by inhibition of the Wnt/beta-catenin pathway[J]. PLoS ONE, 2009, 4(12): e8294. DOI:10.1371/journal.pone.0008294
[24] XI Y, CHEN Y. Wnt signaling pathway: implications for therapy in lung cancer and bone metastasis[J]. Cancer Lett, 2014, 353(1): 8–16. DOI:10.1016/j.canlet.2014.07.010
[25] DUCHARTRE Y, KIM YM, KAHN M. The Wnt signaling pathway in cancer[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2016, 99: 141–149. DOI:10.1016/j.critrevonc.2015.12.005
[26] WU G, LIU A, ZHU J, et al. MiR-1207 overexpression promotes cancer stem cell-like traits in ovarian cancer by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Oncotarget, 2015, 6(30): 28882–28894. DOI:10.18632/oncotarget.4921
[27] GE C, WU S, WANG W, et al. miR-942 promotes cancer stem cell-like traits in esophageal squamous cell carcinoma through activation of Wnt/β-catenin signalling pathway[J]. Oncotarget, 2015, 6(13): 10964–10977. DOI:10.18632/oncotarget.3696
[28] YONG X, TANG B, XIAO Y F, et al. Helicobacter pylori upregulates nanog and oct4 via Wnt/β-catenin signaling pathway to promote cancer stem cell-like properties in human gastric cancer[J]. Cancer Lett, 2016, 374(2): 292–303. DOI:10.1016/j.canlet.2016.02.032
[29] YANG N, HUI L, WANG Y, et al. Overexpression of SOX2 promotes migration, invasion, and epithelial-mesenchymal transition through the Wnt/β-catenin pathway in laryngeal cancer Hep-2 cells[J]. Tumour Biol, 2014, 35(8): 7965–7973. DOI:10.1007/s13277-014-2045-3
[30] JIN G, LU D, YAO S, et al. Amide derivatives of ethacrynic acid: synthesis and evaluation as antagonists of Wnt/beta-catenin signaling and CLL cell survival[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2009, 19(3): 606–609. DOI:10.1016/j.bmcl.2008.12.067
[31] KIM Y, GAST S M, ENDO T, et al. In vivo efficacy of the diuretic agent ethacrynic acid against multiple myeloma[J]. Leuk Res, 2012, 36(5): 598–600. DOI:10.1016/j.leukres.2012.01.025
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201701068
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

黄玲萍, 谢丽霞, 邱钰超, 胡萍, 叶小群.
HUANG Lingping, XIE Lixia, QIU Yuchao, HU Ping, YE Xiaoqun.
依他尼酸联合顺铂化疗促肺癌A549细胞凋亡的作用及机制研究
Ethacrynic acid promotes apoptosis in lung cancer A549 cells when combined with cisplatin chemotherapy
第三军医大学学报, 2017, 39(17): 1720-1727
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(17): 1720-1727
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201701068

文章历史

收稿: 2017-01-11
修回: 2017-03-11

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