溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种原因尚不明确的慢性、复发性炎症性疾病,主要累及结肠和直肠[1]。近10年来该病发病率明显增高,已成为消化系统常见病[2]。尽管该病病因尚未明确,研究表明异常宿主免疫反应、肠黏膜屏障功能紊乱和菌群失调与本病密切相关[3]。以氨基水杨酸制剂、免疫抑制剂、激素和生物制剂为核心的治疗,虽然能诱导疾病缓解,但都存在容易复发和患者治疗不耐受的问题,新的治疗手段亟待发现。在粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)治疗复发性艰难梭菌感染(clostridium difficile infection,CDI)取得显著成效时,人们尝试将FMT用于UC的治疗,已有研究表明FMT可能诱导UC缓解,但作用机制尚不明确[4]。最近Li等[5]发现FMT能够恢复抗生素引起的小鼠肠道菌群紊乱和黏膜屏障功能损害,为了研究FMT是否也可以通过恢复肠黏膜屏障功能来促进UC的缓解,本研究采用硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC小鼠模型,观察FMT对UC的治疗作用以及对肠黏膜机械屏障的影响,以期能为FMT治疗UC及其机制研究提供更多的理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物及动物模型构建7周龄C57BL/6雌性小鼠92只,体质量17.0~21.0 g, 由大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供并饲养。92只C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为对照组、模型组、FMT预防组和FMT治疗组,每组23只。所有小鼠喂养普通饲料1周后,参照Wirtz等[6]的方法处理:对照组小鼠自由饮用纯净水;模型组用2% DSS溶液供小鼠自由饮用7 d后,建成UC小鼠模型,随后饮纯净水恢复7 d;FMT预防组在饮用7d2% DSS的同时给予FMT灌胃处理,随后饮纯净水恢复7d;FMT治疗组在模型建成后给予FMT灌胃处理7 d。
1.2 FMT菌液的制备及灌胃每日收集对照组小鼠适量新鲜粪便,溶于一定体积的生理盐水中,制成400 mg/mL浓度的FMT混悬液,每次FMT后留500 μL FMT菌液-80 ℃存放并进行下一步菌群分析。参照人体FMT标准[7],每只小鼠每次移植的粪菌相当于小鼠自身体质量1/500的粪便量,实际给予每只小鼠的FMT混悬液体积为80~120 μL。按照每只小鼠包含1/500体质量新鲜粪便的FMT悬浊液(体积为80~120 μL),常规灌胃注入,每日1次,共7次。
1.3 主要试剂与仪器DSS相对分子质量为36 000~50 000,购自美国MP Biomedicals公司。大便隐血试剂盒购自南京建成生物工程研究所。免疫组化试剂盒购自中杉金桥公司。Occludin抗体和ZO-1抗体均购自美国Origene公司。D-Lactate检测试剂盒购自美国Cayman公司。TNF-α试剂盒购自北京四正柏生物技术有限公司。多功能酶标仪。JEOL-1400PLUS透射电镜。
1.4 小鼠疾病活动程度(disease activity index, DAI)评分疾病活动程度的评价参考人体炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)疾病活动度评估方法[8],根据小鼠每日血便情况和大便性状进行评分:大便性状正常计0分,软但成形计1分,未成形便计2分,稀便计3分。血便情况潜血阴性计0分,潜血阳性计1分,便中带血计2分,血便计3分。两项评分相加得分评估疾病活动程度。
1.5 透射电镜观察取结肠近肛门端0.5 cm结肠组织,电镜固定体固定后,常规电镜样品制备程序脱水、渗透,环氧树脂定向包埋。作1 μm厚半薄切片,1%甲苯胺蓝染色。光镜下确定部位后制作超薄电镜切片(片厚80 nm),醋酸双氧铀和柠檬酸铝染色后用JEOL-1400PLUS透射电镜观察结肠上皮的微绒毛、紧密连接等超微结构。
1.6 血清D-乳酸和TNF-α的检测分别在实验第7、14天时,摘除小鼠一侧眼球采集动静脉混合血。使用D-乳酸检测试剂盒通过多功能酶标仪检测荧光值分析血清中D-乳酸含量。血清TNF-α含量按照试剂盒说明书,用酶标仪测量各孔的光密度值[D(450)], 检测血清中TNF-α表达水平。
1.7 结肠组织病理变化在实验第7、14天时处死小鼠,取出结肠组织,用刻度尺测量长度后,将结肠近肛门端约2 cm长的结肠组织用10%的福尔马林固定后,依次经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、组织切片、二甲苯脱蜡后HE染色,光镜下观察结肠组织的病理变化。
1.8 免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用SABC法。组织标本经10%多聚甲醛固定后石蜡包埋切片,采用二甲苯脱蜡并梯度酒精水化,3% H2O2室温封闭,枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0) 高压修复,滴加山羊血清封闭后,加ZO-1抗体(1 :50) 和Occludin抗体(1 :50)4 ℃孵育过夜,PBS洗涤后按照说明书操作加入二抗孵育、DAB显色并设立阴性对照。免疫组化切片拍照后图片通过Image J开源软件进行平均灰度值测量和计算。
1.9 小鼠肠道菌群及FMT菌液分析每日通过刺激小鼠肛门的方法连续收集小鼠粪便后-80 ℃冻存,实验结束后与冻存的FMT菌液一并送至深圳谱元公司采用美国Illumina公司生产的Illumina miseq platform测序平台对标本进行16S rRNA基因测序,通过PCA分析和聚类分析等方法对样本属水平上菌群的结构与数量进行分析。
1.10 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件,数据以x±s表示,组间对应指标差异性检验采用单因素方差分析, P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 FMT能够缓解DSS引起的小鼠体质量下降经过DSS诱导完成后第7天,与对照组比较,其他组小鼠均出现明显的体质量下降,FMT预防组和模型组在第10天体质量降至最低,FMT治疗组在第7天体质量降至最低,随后缓慢恢复。在第14天时,模型组较对照组体质量明显下降(P < 0.01),FMT预防组体质量与模型组比较差异无统计学意义(P > 0.05),而FMT治疗组体质量明显较模型组增加(P < 0.05,图 1)。
2.2 FMT减轻DSS引起的疾病活动
经DSS诱导后,与对照组比较,模型组、FMT预防组和FMT治疗组小鼠疾病活动程度逐渐增加,并在第8天达到顶峰;随后模型组、预防组和治疗组疾病活动均开始下降;第14天时,FMT治疗组疾病活动程度明显低于模型组和FMT预防组(P < 0.01,图 2)。
2.3 FMT促进小鼠结肠长度的恢复
经DSS诱导后模型组小鼠结肠长度较对照组明显缩短(P < 0.01),且停用DSS 7 d后结肠长度未见明显恢复(P > 0.05)。FMT预防组小鼠停用DSS 7 d后结肠长度较模型组长,但不明显(P > 0.05),FMT治疗组小鼠经过治疗后结肠长度恢复至对照组水平(P > 0.05),较模型组和预防组明显增长,差异具有统计学意义(P < 0.05,图 3、4)。
2.4 FMT能够促进DSS引起的小鼠组织学损伤的修复
饮水7 d后,对照组小鼠结肠上皮完整,隐窝结构规则,见少量炎症细胞浸润。模型组小鼠饮用DSS溶液7 d后结肠隐窝数量减少、扭曲、融合,上皮可见明显的溃疡形成和部分上皮细胞脱落,黏膜下层见大量炎症细胞浸润。FMT预防组小鼠结肠隐窝破坏较模型组轻,炎症浸润也较少,未见明显溃疡形成。经过7 d自然恢复后,模型组小鼠结肠炎症较前减轻但隐窝结构未恢复、黏膜溃疡也未愈合。FMT预防组结肠上皮较前恢复不明显。FMT治疗组经过7dFMT灌胃处理后结肠炎症明显缓解,隐窝数量增加,上皮较为完整,黏膜呈愈合趋势(图 5)。
2.5 FMT能够改善DSS诱导结肠炎小鼠结肠上皮的超微结构
经过DSS诱导后,模型组小鼠肠道黏膜上皮细胞出现线粒体肿胀,部分细胞发生自噬,肠上皮微绒毛数量减少、长度变短,细胞间紧密连接开放。经FMT预防处理后,肠上皮微绒毛数量明显增加,但长度未见明显改变。细胞间紧密连接较模型组更完整和紧密。FMT治疗后,小鼠结肠上皮细胞微绒毛较模型组数量明显增加,更加密集,长度也更长,但仍未恢复至正常长度。细胞间紧密连接较模型组和FMT预防组都更加紧密及完整,线粒体形态较为规则,线粒体嵴清晰可见(图 6)。
2.6 FMT增加DSS诱导结肠炎结肠上皮细胞ZO-1、Occludin的表达
免疫组化染色检测发现:对照组结肠上皮组织ZO-1、Occludin在实验第7、14天时均有表达;DSS结肠炎小鼠模型组第7天时,结肠上皮组织ZO-1和Occludin表达与对照组相比均显著下降(P < 0.01),在第14天时两者表达恢复至对照组水平;FMT预防组小鼠结肠上皮组织ZO-1和Occludin在第7天时与模型组比较,表达显著增加(P < 0.01),第14天时,ZO-1和Occludin的表达与模型组比较差异无统计学意义;FMT治疗组小鼠结肠上皮组织ZO-1和Occludin在第7天时与模型组比较无差异,而在第14天时,两者表达均显著高于模型组(P < 0.05,表 1、图 7)。
组别 | ZO-1 | Occludin | |||
7 d | 14 d | 7 d | 14 d | ||
对照组 | 0.124±0.028 | 0.138±0.031 | 0.185±0.008 | 0.189±0.005 | |
模型组 | 0.083±0.019a | 0.118±0.010 | 0.151±0.010a | 0.186±0.027 | |
FMT预防组 | 0.137±0.021b | 0.148±0.028 | 0.198±0.109b | 0.187±0.019 | |
FMT治疗组 | 0.086±0.004 | 0.149±0.019c | 0.148±0.006 | 0.217±0.020c | |
a: P < 0.01,与对照组比较;b:P < 0.01,c:P < 0.05,与模型组比较 |
2.7 FMT能够缓解小鼠全身炎症水平改善肠道通透性
DSS结肠炎模型组小鼠在第7天和第14天时血清D-乳酸水平均显著高于对照组(P < 0.01),提示肠黏膜屏障功能受损。FMT治疗组第14天时,血清D-乳酸水平虽高于对照组(P < 0.05),但较模型组显著下降(P < 0.01),结肠黏膜屏障功能明显恢复。模型组小鼠在第7天和第14天时血清TNF-α水平均高于对照组(P < 0.01),FMT治疗组小鼠灌胃7 d后(实验第14天)血清TNF-α水平虽高于对照组(P < 0.05),但较模型组已明显降低(P < 0.01,表 2),炎症程度减轻。
组别 | D-乳酸(μmol/L) | TNF-α(pg/mL) | |||
7 d | 14 d | 7 d | 14 d | ||
对照组 | 56.99±2.03 | 60.04±1.94 | 31.14±1.77 | 35.16±2.20 | |
模型组 | 177.52±3.74a | 165.88±7.69a | 135.26±8.36a | 115.98±12.02a | |
FMT预防组 | 168.90±5.06a | 160.00±4.79a | 126.28±4.13a | 111.48±2.52a | |
FMT治疗组 | 175.41±4.79a | 76.22±1.32bc | 132.11±1.76a | 55.47±2.39bc | |
a:P < 0.01,b:P < 0.05,与对照组比较;c:P < 0.01,与模型组比较 |
2.8 FMT能够改善DSS引起的小鼠肠道菌群紊乱 2.8.1 移植用FMT菌液的菌群结构基本稳定
进行细菌16S rRNA基因测序分析发现:第1、4、7次所用FMT菌液的菌群在属水平上所含菌群数量与结构基本一致,即移植所用FMT菌液的菌群组成结构稳定(图 8)。
2.8.2 各组小鼠在实验第1、7和14天时肠道菌群结构的16S rRNA分析
与诱导前比较,模型组小鼠诱导1周后,乳杆菌属明显下降而拟杆菌属和颤螺菌属增加;停用DSS自然恢复1周后,乳杆菌属所占比例未明显恢复,但增高的拟杆菌属水平有所下降,而颤螺菌属持续增加。FMT预防组肠菌移植1周后,小鼠肠道菌群变化趋势与模型组类似,但在停用DSS自然恢复1周后,乳杆菌属及Allobaculum菌属较模型组所占比例明显增加,而拟杆菌属和颤螺菌属减少。FMT治疗组小鼠FMT后,粪便菌群结构与模型组比较,出现更明显的乳杆菌属增加而拟杆菌属和颤螺菌属减少(图 9)。
3 讨论
UC的发病机制至今仍不清楚。近些年来,大量研究证实肠黏膜屏障结构及功能受损与UC的发生、发展有密切关系[9]。肠黏膜屏障由机械屏障、生物屏障、化学屏障和免疫屏障构成,其中机械屏障最为重要,是肠道功能保持正常的最基本结构。肠上皮细胞的完整性及细胞间紧密连接结构对肠黏膜机械屏障功能的维持和上皮通透性的稳定十分重要,肠黏膜屏障功能受损是IBD发病机制的重要环节[10]。已有研究表明FMT能够恢复抗生素诱导菌群紊乱所致的肠黏膜机械屏障受损[5]。因此,本研究建立DSS诱导的急性结肠炎模型,观察FMT对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响。
本研究发现FMT治疗DSS结肠炎模型小鼠后结肠黏膜无溃疡形成,仅有少许糜烂及轻微的炎症细胞浸润,隐窝结构完整。透射电镜下也观察到结肠上皮细胞微绒毛的数量及长度较模型组显著增加,细胞内线粒体形态规整,腔内嵴清晰可见,同时反映炎症程度的血清TNF-α水平较模型组显著下降(P < 0.01), 这些结果提示DSS结肠炎小鼠经过FMT治疗后结肠炎症及组织损害都明显减轻,FMT治疗效果显著。通过肠道菌群基因测序分析发现:FMT治疗组小鼠肠道菌群中乳杆菌属和拟杆菌属发生明显改变,这可能与FMT治疗小鼠DSS结肠炎取得良好效果密切相关。研究表明乳杆菌可通过竞争性抑制作用来防止致病菌过度繁殖并维持肠道微生态平衡[11],还可调节胆汁酸盐活性影响小鼠脂代谢,增加小鼠体质量[12]。Braat等[13]发现鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)能够通过促进CD4+T细胞分泌IL-2和IFN-γ发挥抗炎作用。另外,乳杆菌除了对肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)具有确切的疗效外[14], 我们在临床工作中也发现给予UC患者乳杆菌制剂可缓解患者部分症状。UC患者结肠黏膜中拟杆菌属增加提示其参与了结肠炎症过程[15], 而消化道拟杆菌中所占比例最大的脆弱拟杆菌可通过释放脆弱拟杆菌肠毒素(bacteroides fragilis enterotoxin,BFT)直接杀伤结肠上皮细胞[16]。另外,FMT治疗后小鼠隐窝结构明显得到恢复,这可能与FMT通过修复肠黏膜屏障功能,减少了结肠黏膜下免疫细胞与肠腔内抗原物质的接触,缓解了结肠组织炎症,促进了隐窝修复有关。隐窝功能恢复后结肠上皮增生修复能力增强,结肠长度也有不同程度的恢复。因此,我们认为FMT可能通过增加小鼠肠道中乳杆菌属,减少拟杆菌属来维持肠道菌群的平衡,从而减轻小鼠结肠炎症及损伤,发挥一定的治疗作用。
本研究通过透射电镜观察到FMT治疗后DSS诱导的结肠炎小鼠结肠上皮细胞间紧密连接增强,上皮的完整性更好。免疫组化染色还发现与细胞间紧密连接密切相关的分子ZO-1和Occludin在经过FMT治疗后表达明显增加。同时,反映肠道通透性的血清学指标D-乳酸水平在FMT治疗后较模型组明显下降。这些都提示FMT治疗能促进DSS诱导的结肠炎小鼠肠黏膜屏障结构和功能的恢复。其机制可能与FMT治疗后增加了的乳杆菌发挥减轻氧化应激和炎症反应,从而保护黏膜有关[17-18]。另外,本研究还发现FMT治疗后产短链脂肪酸Allobaculum菌明显增多,而短链脂肪酸对于维持结肠正常功能和结肠上皮细胞的形态及功能具有重要作用[19-20]。本研究结果显示:FMT治疗后,小鼠粪便中颤螺菌属(Oscillospira)所占比例明显减少,有研究表明人体肠道菌群中颤螺菌属的水平高低与体质量呈负相关[21],这可能与本研究中观察到FMT治疗后小鼠体质量的增加有关。因此,我们认为FMT可能通过调节DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群结构,减轻结肠炎症损害,促进肠上皮细胞间紧密连接的修复,恢复肠黏膜屏障功能,达到治疗DSS诱导的小鼠结肠炎的效果,从而表现出FMT治疗组小鼠血便明显减少、疾病活动程度减低、结肠长度增加和体质量的逐渐恢复。
综上所述,本研究发现FMT可能通过改变肠道菌群和肠道微环境,减轻DSS诱导的小鼠结肠炎症、增强紧密连接相关蛋白ZO-1和Occludin的表达,促进结肠黏膜上皮的修复和结肠黏膜屏障结构及功能恢复,发挥治疗小鼠DSS结肠炎的作用,但具体机制需要进一步深入研究。
[1] | Bouma G, Strober W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease[J]. Nat Rev Immunol, 2003, 3(7): 521–533. DOI:10.1038/nri1132 | ||
[2] | Chi K R. Epidemiology: Rising in the East[J]. Nature, 2016, 540(7634): S100–S102. DOI:10.1038/540S100a | ||
[3] | Lepage P, Hasler R, Spehlmann M E, et al. Twin study indicates loss of interaction between microbiota and mucosa of patients with ulcerative colitis[J]. Gastroenterology, 2011, 141(1): 227–236. DOI:10.1053/j.gastro.2011.04.011 | ||
[4] | Moayyedi P, Surette M G, Kim P T, et al. Fecal microbiota transplantation induces remission in patients with active ulcerative colitis in a randomized controlled trial[J]. Gastroenterology, 2015, 149(1): 102–109.e6. DOI:10.1053/j.gastro.2015.04.001 | ||
[5] | Li M, Liang P, Li Z, et al. Fecal microbiota transplantation and bacterial consortium transplantation have comparable effects on the re-establishment of mucosal barrier function in mice with intestinal dysbiosis[J]. Front Microbiol, 2015, 6: 692. DOI:10.3389/fmicb.2015.00692 | ||
[6] | Wirtz S, Neufert C, Weigmann B, et al. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation[J]. Nat Protoc, 2007, 2(3): 541–546. DOI:10.1038/nprot.2007.41 | ||
[7] |
Ma[8] |
Siegel C A, Whitman C B, Spiegel B M, et al. Development of an index to define overall disease severity in IBD[J].
Gut, 2016.
DOI:10.1136/gutjnl-2016-312648 |
|
[9] | Turner J R. Molecular basis of epithelial barrier regulation: from basic mechanisms to clinical application[J]. Am J Pathol, 2006, 169(6): 1901–1909. DOI:10.2353/ajpath.2006.060681 | ||
[10] | Turner J R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease[J]. Nat Rev Immunol, 2009, 9(11): 799–809. DOI:10.1038/nri2653 | ||
[11] | Curro D, Ianiro G, Pecere S, et al. Probiotics, fibre and herbal medicinal products for functional and inflammatory bowel disorders[J]. Br J Pharmacol, 2016. DOI:10.1111/bph.13632 | ||
[12] | Joyce S A, Macsharry J, Casey P G, et al. Regulation of host weight gain and lipid metabolism by bacterial bile acid modification in the gut[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(20): 7421–7426. DOI:10.1073/pnas.1323599111 | ||
[13] | Braat H, van den Brande J, van Tol E, et al. Lactobacillus rhamnosus induces peripheral hyporesponsiveness in stimulated CD4+ T cells via modulation of dendritic cell function[J]. Am J Clin Nutr, 2004, 80(6): 1618–1625. | ||
[14] | Tiequn B, Guanqun C, Shuo Z. Therapeutic effects of Lactobacillus in treating irritable bowel syndrome: a meta-analysis[J]. Intern Med, 2015, 54(3): 243–249. DOI:10.2169/internalmedicine.54.2710 | ||
[15] | Lucke K, Miehlke S, Jacobs E, et al. Prevalence of Bacteroides and Prevotella spp. in ulcerative colitis[J]. J Med Microbiol, 2006, 55(Pt 5): 617–624. DOI:10.1099/jmm.0.46198-0 | ||
[16] | Wexler H M. Bacteroides: the good, the bad, and the nitty-gritty[J]. Clin Microbiol Rev, 2007, 20(4): 593–621. DOI:10.1128/CMR.00008-07 | ||
[17] | Yu L, Zhai Q, Tian F, et al. Potential of lactobacillus plantarum CCFM639 in protecting against aluminum toxicity mediated by intestinal barrier function and oxidative stress[J]. Nutrients, 2016, 8(12). DOI:10.3390/nu8120783 | ||
[18] | Llopis M, Antolin M, Guarner F, et al. Mucosal colonisation with Lactobacillus casei mitigates barrier injury induced by exposure to trinitronbenzene sulphonic acid[J]. Gut, 2005, 54(7): 955–959. DOI:10.1136/gut.2004.056101 | ||
[19] | Zhang X, Zhao Y, Xu J, et al. Modulation of gut microbiota by berberine and metformin during the treatment of high-fat diet-induced obesity in rats[J]. Sci Rep, 2015, 5: 14405. DOI:10.1038/srep14405 | ||
[20] | Kelly C J, Zheng L, Campbell E L, et al. Crosstalk between microbiota-derived short-chain fatty acids and intestinal epithelial HIF augments tissue barrier function[J]. Cell Host Microbe, 2015, 17(5): 662–671. DOI:10.1016/j.chom.2015.03.005 | ||
[21] | Konikoff T, Gophna U. Oscillospira: a central, Enigmatic component of the human gut microbiota[J]. Trends Microbiol, 2016, 24(7): 523–524. DOI:10.1016/j.tim.2016.02.015 | ||