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神经干细胞与大鼠RPE细胞间的线粒体转运及对RPE细胞凋亡的影响
陈冲林, 邹婷, 黎其友, 徐海伟, 阴正勤     
400038 重庆,第三军医大学西南医院全军眼科中心,视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室
[摘要] 目的 研究小鼠神经干细胞(neural stem cells, NSCs)C17.2细胞系与从RCS大鼠变性视网膜中原代分离视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial, RPE)的线粒体交换方式及其对RPE细胞特性的影响。 方法 分离RCS大鼠RPE细胞并进行培养和鉴定。分别用线粒体特异性标记物Mitotracker-red和Mitotracker-green标记RPE细胞和小鼠NSCs细胞的线粒体,将两种细胞共培养,激光共聚焦显微镜下观察两种细胞之间隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)的形成及线粒体转运方式。采用流式细胞仪检测与NSCs共培养后RPE细胞的反应性活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平、细胞周期和细胞凋亡水平的变化。 结果 来源于RCS大鼠视网膜的第3代RPE细胞生长状态良好,RPE65及Bestrophin蛋白阳性率细胞均大于95%。与NSCs共培养24 h后,可见RPE细胞与NSCs间TNT的形成,NSCs中的线粒体向RPE细胞方向单向运动,接受NSCs转运的线粒体后, RPE细胞的ROS水平降低(P<0.01);RPE细胞的增殖能力增加,处于S期的细胞比例明显增加(P<0.01),细胞增殖指数(PI)显著增加(P<0.05);RPE细胞早期凋亡细胞比例显著降低(P<0.05)。 结论 NSCs可通过与相邻的变性RPE细胞之间形成TNT并向其转运线粒体而改善变性RPE细胞的存活。
[关键词] 干细胞     视网膜色素变性     视网膜色素上皮     线粒体     隧道纳米管    
Mitochondrial transfer from neural stem cells rescues apoptosis of retinal pigment epithelial cells isolated from RCS rats
Chen Chonglin , Zou Ting , Li Qiyou , Xu Haiwei , Yin Zhengqin     
Center of Ophthalmology, Chongqing Key Laboratory of Visual Damage and Regeneration & Restoration, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
the National Basic Research Program (973 Program, 2013CB967002)
Corresponding author: Yin Zhengqin, E-mail:qinzy@aliyun.com
[Abstract] Objective To investigate the pattern of mitochondrial transfer in neural stem cells (NSCs)and primary cultured retinal pigment epithelial (RPE) cells isolated from Royal College of Surgeons (RCS) rats and analyze the effect mitochondrial transfer on the biological behaviors of RPE cells. Methods The RPE cells were isolated from the RCS rats, cultured primarily and identified. Mitotracker-red and mitotracker-green staining were used to label the mitochondria of the cultured RPE cells and those of mouse neural stem cell line C17.2, respectively.In a co-culture system of the 2 kinds of cells, the formation of tunneling nanotubes (TNT) between them and mitochondrial transfer in the TNT were observed by laser scanning confocal microscopy. Flow cytometry was used to measure the level of reactive oxygen species (ROS) production and analyze the cell cycle distribution and early apoptosis of RPE cells cultured alone or in the co-culture system. Results The RPE cells in the third generation showed a good growth condition with the positive rates for RPE65 and Bestrophin both exceeding 95%. At 24 h after the co-culture, the formation of TNT structure was observed between RPE cells and NSCs, and one-way mitochondrial transfer from NSCs to RPE cells were captured. Mitochondrial transfer from the NSCs to the RPE cells resulted in significantly decreased ROS level in the latter cells (P < 0.05). The RPE cells receiving the mitochondria also showed enhanced cell proliferation, increased cell proportion in S phase (P < 0.01), elevated proliferation index (P < 0.05), and decreased early apoptosis cells(P < 0.05). Conclusion In the co-culture system, NSCs transfer mitochondria into adjacent RPE cells via the TNT structure to rescues the RPE cells from apoptosis.
[Key words] stem cells     retinitis pigmentosa     retinal pigment epithelium     mitochondria     tunneling nanotubes    

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是一种遗传性进行性退行性视网膜病变,目前认为RP的发生是由于RPE吞噬感光细胞脱落的外节膜盘的功能下降,致使膜盘在视网膜外层堆积,最终至感光细胞变性死亡[1]。RP目前尚无有效的治疗方法。研究显示间充质干细胞可以通过形成细胞间隧道纳米管(tunneling nanotubes, TNT)向心肌细胞转运线粒体而改善心肌细胞、血管平滑肌细胞、气管上皮细胞等细胞功能[2-5]。目前已有研究证实线粒体功能异常是年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等视网膜退行性疾病的重要致病因素[6-7],这类眼病的干细胞治疗已进入临床试验阶段[8]。目前尚不清楚干细胞是否通过线粒体转运对视网膜变性RPE细胞发挥治疗作用。本研究主要观察NSCs与视网膜色素变性遗传模型RCS大鼠RPE细胞能否形成TNT结构和线粒体转运方式,以及线粒体转运之后对RPE细胞功能有何影响,为视网膜变性疾病的干细胞治疗提供思路。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级视网膜色素变性遗传模型皇家外科学院(Royal College of Surgeons, RCS)大鼠,鼠龄14 d,4批,每批8~10只,由第三军医大学实验动物中心提供。本研究实验动物的使用和喂养遵循中华人民共和国卫生部令第55号发布的《医学实验动物管理实施细则》和国家科学技术委员会第2号令发布的《实验动物管理条例》。

1.1.2 主要试剂及仪器

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM/F12细胞培养基(美国Gibco公司);PBS、Hank平衡盐缓冲液(HyClone中国公司);0.25%胰蛋白酶-EDTA、Ⅰ/Ⅳ型胶原酶、Mitotracker-red、Mitotracker-green(美国Lifetechnology公司);RPE65、Bestrophin抗体(美国Abcam公司);细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司);2′, 7′-二氯二氢荧光素二乙酯(2′, 7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA,美国Sigma公司);Hoechst 33342(美国Lifetechnology公司);细胞周期检测试剂盒(中国跃亚公司);三气细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司);BD FACS Calibur流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠RPE细胞的分离及培养

大鼠RPE细胞原代培养参照改良的Edwards大鼠RPE细胞培养方法[9-10]。大鼠以断颈法处死,无菌条件下摘取眼球,PBS清洗后,Hank液于4 ℃浸泡避光过夜,用混合消化液于37 ℃下消化45 min,消化液含0.1 mmol/L EDTA、0.1%胰蛋白酶和质量分数1%的Ⅰ型胶原酶、1%Ⅳ型胶原酶。去前节后分离神经视网膜,于培养基中用200 μL移液枪轻轻吹打分离RPE细胞。用0.1%胰蛋白酶消化5 min,终止消化,离心弃上清后,加入含体积分数10%FBS的DMEM/F12细胞培养液,接种于细胞培养皿中。在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养,每隔3天换1次液,根据细胞密度7 d后传代,传至第3代用于后续实验。

1.2.2 免疫荧光细胞化学法检测RPE细胞RPE65、Bestrophin蛋白表达

将第3代RPE细胞爬片用质量分数为4%多聚甲醛室温固定15 min,PBS洗涤3次,用质量分数0.1%Triton X-100室温下破膜10 min,加入封闭液(体积分数10%山羊血清、质量分数1%牛血清蛋白)室温封闭1 h,分别用兔抗大鼠Bestrophin抗体(1:500)、小鼠抗大鼠RPE65抗体(1:500)4 ℃孵育过夜,再分别用FITC标记的羊抗兔IgG二抗(1:500)、Cy3标记的羊抗鼠IgG二抗(1:500) 室温避光孵育1 h,PBS洗涤3次后,再加Hoechst 33342细胞核染色,PBS洗涤后晾干封片,于共聚焦显微镜下观察并拍照。各组均设未加一抗的阴性对照(PBS代替一抗)。信噪比大于1:5判定为阳性细胞。

1.2.3 细胞线粒体的标记

分别用含100 nmol/L线粒体特异性标记物Mitotracker-red及Mitotracker-green的培养液标记RPE细胞与NSCs,37 ℃避光孵育45 min,弃标志液,用Hank平衡盐溶液漂洗5 min,重复5次,将标志液彻底洗净。

1.2.4 细胞间线粒体的交换

分别用Mitotracker-green、Mitotracker-red标记RPE细胞和NSCs等量共培养,细胞密度为1×104/cm2,24 h后细胞核用Hoechst标记,于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍摄结果。

1.2.5 流式细胞分选

收集共培养48 h的RPE细胞和NSCs,进行流式细胞分选,共培养的细胞按照是否有GFP标记分为阳性和阴性2群,收集GFP阴性的细胞群,将其用于后续实验。

1.2.6 细胞内活性氧水平检测

分别收集第3代单独培养的RCS大鼠的RPE细胞和共培养后分选的RPE细胞,用荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。向待测细胞的培养皿中加入1 mL浓度为10 μmol/L的DCFH-DA,37 ℃条件下孵育30 min,用PBS洗3次,消化细胞后离心弃上清,1 mL培养基重悬细胞,计数后调整细胞量为5×105/mL,离心后弃上清,用500 μL PBS重悬,上机检测。

1.2.7 细胞凋亡检测

分别收集第3代RCS大鼠的RPE细胞和共培养分选后的RPE细胞,采用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)双染方法检测细胞凋亡率。将细胞消化成单个细胞,加入1×Binding Buffer将细胞密度调整至1×106/mL,取100 μL加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀,室温避光孵育抗体15 min,同时设置空白对照和单阳对照,加入400 μL 1×Binding Buffer,上机检测。

1.2.8 细胞周期检测

收集第3代RPE细胞和共培养分选后的RPE细胞,用PBS以5×105的密度重悬,取100 μL加入细胞周期检测试剂盒A液(胰蛋白酶等)100 μL室温孵育15 min,加入B液(RNA酶、胰酶抑制剂等)室温孵育15 min,加入细胞周期试剂盒C液(碘化丙啶等)室温下避光孵育20 min,上机检测,每个样本至少收集10 000个细胞,记录激发波长为488 nm处的红色荧光。

1.3 统计学分析

采用SPSS 14.0 Statistics统计软件。本研究测量指标的数据资料经Kolmogorov-Smirnov检验呈正态分布,以x±s表示,组间均数经Levene检验方差齐。采用平行分组单因素干预两水平实验设计,均采用独立样本t检验。采用双尾检测法,检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 RCS大鼠RPE细胞的鉴定

原代分离的RCS大鼠RPE细胞接种后7 d,部分细胞伸展,呈不规则形多边形,色素分布于核周(图 1A)。随着传代数量的增加,细胞质中色素逐渐减少。第3代RPE细胞色素较明显(图 1B),细胞纯度较高,Bestrophin染色阳性率为(92.38±0.05)%(图 1C),RPE65染色阳性率为(92.24±0.03)%(图 1D)。

A:原代RPE细胞培养7 d后,细胞呈多边形,胞内可见色素;B:第3代RPE细胞色素减少,细胞呈不规则多边形;C:第3代RPE细胞对Bestrophin抗体呈现阳性反应,细胞质对FITC呈现绿色荧光,细胞核对Hoechst呈现蓝色荧光;D:第3代RPE细胞对RPE65抗体呈现阳性反应,细胞质对Cy3呈现红色荧光,细胞核对Hoechst呈现蓝色荧光 图 1 原代RPE的培养及鉴定

2.2 RPE细胞、NSCs的线粒体标记以及TNT形成和线粒体交换

线粒体特异性染料Mitotracker-green标记NSCs细胞后,线粒体标记阳性细胞超过95%(图 2A),Mitotracker-red标记RPE细胞后,线粒体标记阳性细胞超过95%(图 2B);证实线粒体特异性标志Mitotracker-red和Mitotracker-green在该实验条件下标记细胞线粒体满足实验要求。标记Mitotracker-green的NSCs与标记Mitotracker-red的RPE细胞共培养后24 h,明场下可见RPE细胞与NSCs间形成细长的膜性结构(图 2C),即TNT。随着时间的推移,NSCs中呈绿色荧光的线粒体通过TNT进入呈红色荧光的RPE细胞中(图 2DE)。NSCs与RPE细胞间线粒体呈直线单向转运,符合TNT的特点。

A: mNSC细胞标记线粒体特异性标记物Mitotracker-green后,阳性细胞的线粒体呈绿色;B:RPE细胞标记线粒体特异性标记物Mitotracker-red后, 阳性细胞的线粒体呈红色;C:共培养24 h后,明场下可见RPE细胞与NSCs间形成TNT(↑示);D:NSCs Mitotracker-green标记阳性,RPE细胞Mitotracker-red标记阳性,RPE细胞与NSCs间形成TNT(↑示)中可见绿色标记的NSCs线粒体(△示)从NSCs中向REP细胞转运;E:将图D白色线框区域放大,可见绿色标记的NSCs线粒体(△示)通过TNT从NSCs中向REP细胞转运;红色:线粒体特异性染色剂Mitotracker-red;绿色:线粒体特异性标记液Mitotracker-green;蓝色:Hoechst 33342 图 2 线粒体特异性标记以及TNT形成和线粒体转运

2.3 与NSCs共培养前后RPE细胞ROS的变化

共培养组的ROS荧光强度(73.56±3.49) 明显低于单独培养组(106.00±2.65),差异具有统计学意义(P<0.01,图 3)。提示与NSCs共培养后通过线粒体转运,RPE细胞的抗氧化水平得到改善。

中文注解 图 3 流式细胞仪检测RCS-RPE单独培养组(A)和RCS-RPE/NSCs共培养组(B) ROS水平(n=3)

2.4 与NSCs共培养后对RPE细胞周期的影响

单独培养组RPE细胞与共培养后RPE处于G1期细胞分别为(75.11±0.44)%和(73.36±0.83)%(P=0.010),S期分别为(9.20±0.41)%和(10.28±0.34)%(P=0.007),G2/M期分别为(15.69±0.61)%和(16.34±0.57)%(P=0.169),增殖指数(prolifera-tion index, PI)分别为(24.89±0.38)%和(26.62±0.72)%(P=0.011)。结果显示:与单独培养组相比,共培养组RPE细胞处于S期比例及增殖指数均升高(图 4)。提示与NSCs共培养后通过线粒体转运,RPE细胞的增殖能力增加。

图 4 流式细胞仪检测RCS-RPE单独培养组(A)及RCS-RPE/NSCs共培养组(B)细胞周期(n=4)

2.5 与NSCs共培养后对RPE细胞凋亡水平的改变

共培养后早期凋亡细胞比例为(0.82±0.08)%,单独培养组早期凋亡细胞比例为(1.13±0.15)%(P=0.011,图 5)。提示NSCs共培养后通过线粒体转运,RPE细胞的凋亡水平降低。

图 5 流式细胞仪检测RCS-RPE单独培养组(A)和RCS-RPE/NSCs共培养组(B)细胞凋亡(n=4)

3 讨论

干细胞治疗视网膜变性疾病逐渐成为眼科领域的研究热点之一,其治疗机制有细胞替代、营养支持和移植区微环境的免疫调控作用[11]。已有研究表明间充质干细胞可以通过线粒体转运机制改善心肌细胞、血管平滑肌细胞、气管上皮细胞等细胞功能[2-5]。由此提出假设:干细胞可将自身线粒体转运至视网膜色素变性RPE细胞,并改善其细胞特性。

TNT是Rustom等[12]首次在PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化细胞株)之间观察到的一种细胞间的连接结构,是一种新发现的动物细胞间连接形式。本研究通过共聚焦显微镜观察小鼠NSCs与RPE细胞之间TNT的形成,观察到NSCs与RPE细胞之间可形成TNT,为细长的管状结构,连接两相邻但不直接接触的细胞。关于TNT如何形成及形成特点目前尚不清楚。

目前已发现多种细胞间均可形成类似该结构[13-15],并且发现通过TNT不仅可以转运小分子物质、质膜成分,还可以转运线粒体等细胞器[16]。本研究将小鼠NSCs和原代分离的视网膜色素变性模型大鼠RPE细胞体外共培养24 h,发现线粒体从小鼠NSCs细胞内通过TNT转运到原代分离的RPE内,提示小鼠NSCs可将自身线粒体转运到视网膜色素变性模型大鼠的RPE细胞中,证实了NSCs可向RPE细胞进行线粒体转运。关于为何线粒体转运方向是从NSCs到RPE细胞的问题仍有待探讨。

RCS大鼠是经典的视网膜色素变性模型,其主要是因为MERTK基因突变,导致RPE吞噬感光细胞脱落的外节膜盘的功能下降,致使其在视网膜外层堆积,结构紊乱,继发性感光细胞变性死亡[17-18]。本研究结果已证实NSCs可通过TNT向RPE细胞转运线粒体,并且发现体外NSCs与RPE细胞直接共培养体系下,共培养组相比单独培养组RPE细胞的ROS水平有所降低,细胞增殖能力提高并且凋亡水平降低。提示NSCs可能通过将线粒体转运的机制,降低变性视网膜RPE细胞的ROS水平,并且改善其细胞增殖能力和凋亡水平,其具体通过何种机制实现改善RPE细胞的增殖和凋亡仍有待进一步研究。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201701031
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陈冲林, 邹婷, 黎其友, 徐海伟, 阴正勤.
Chen Chonglin, Zou Ting, Li Qiyou, Xu Haiwei, Yin Zhengqin.
神经干细胞与大鼠RPE细胞间的线粒体转运及对RPE细胞凋亡的影响
Mitochondrial transfer from neural stem cells rescues apoptosis of retinal pigment epithelial cells isolated from RCS rats
第三军医大学学报, 2017, 39(11): 1112-1116
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(11): 1112-1116
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201701031

文章历史

收稿: 2017-01-06
修回: 2017-03-08

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