视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是一种遗传性进行性退行性视网膜病变，目前认为RP的发生是由于RPE吞噬感光细胞脱落的外节膜盘的功能下降，致使膜盘在视网膜外层堆积，最终至感光细胞变性死亡[1]。RP目前尚无有效的治疗方法。研究显示间充质干细胞可以通过形成细胞间隧道纳米管(tunneling nanotubes, TNT)向心肌细胞转运线粒体而改善心肌细胞、血管平滑肌细胞、气管上皮细胞等细胞功能[2-5]。目前已有研究证实线粒体功能异常是年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等视网膜退行性疾病的重要致病因素[6-7]，这类眼病的干细胞治疗已进入临床试验阶段[8]。目前尚不清楚干细胞是否通过线粒体转运对视网膜变性RPE细胞发挥治疗作用。本研究主要观察NSCs与视网膜色素变性遗传模型RCS大鼠RPE细胞能否形成TNT结构和线粒体转运方式，以及线粒体转运之后对RPE细胞功能有何影响，为视网膜变性疾病的干细胞治疗提供思路。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级视网膜色素变性遗传模型皇家外科学院(Royal College of Surgeons, RCS)大鼠，鼠龄14 d，4批，每批8~10只，由第三军医大学实验动物中心提供。本研究实验动物的使用和喂养遵循中华人民共和国卫生部令第55号发布的《医学实验动物管理实施细则》和国家科学技术委员会第2号令发布的《实验动物管理条例》。
1.1.2 主要试剂及仪器胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM/F12细胞培养基(美国Gibco公司)；PBS、Hank平衡盐缓冲液(HyClone中国公司)；0.25%胰蛋白酶-EDTA、Ⅰ/Ⅳ型胶原酶、Mitotracker-red、Mitotracker-green(美国Lifetechnology公司)；RPE65、Bestrophin抗体(美国Abcam公司)；细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；2′, 7′-二氯二氢荧光素二乙酯(2′, 7′-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA，美国Sigma公司)；Hoechst 33342(美国Lifetechnology公司)；细胞周期检测试剂盒(中国跃亚公司)；三气细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)；BD FACS Calibur流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)。
1.2 方法 1.2.1 原代大鼠RPE细胞的分离及培养大鼠RPE细胞原代培养参照改良的Edwards大鼠RPE细胞培养方法[9-10]。大鼠以断颈法处死，无菌条件下摘取眼球，PBS清洗后，Hank液于4 ℃浸泡避光过夜，用混合消化液于37 ℃下消化45 min，消化液含0.1 mmol/L EDTA、0.1%胰蛋白酶和质量分数1%的Ⅰ型胶原酶、1%Ⅳ型胶原酶。去前节后分离神经视网膜，于培养基中用200 μL移液枪轻轻吹打分离RPE细胞。用0.1%胰蛋白酶消化5 min，终止消化，离心弃上清后，加入含体积分数10%FBS的DMEM/F12细胞培养液，接种于细胞培养皿中。在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养，每隔3天换1次液，根据细胞密度7 d后传代，传至第3代用于后续实验。
1.2.2 免疫荧光细胞化学法检测RPE细胞RPE65、Bestrophin蛋白表达将第3代RPE细胞爬片用质量分数为4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤3次，用质量分数0.1%Triton X-100室温下破膜10 min，加入封闭液(体积分数10%山羊血清、质量分数1%牛血清蛋白)室温封闭1 h，分别用兔抗大鼠Bestrophin抗体(1：500)、小鼠抗大鼠RPE65抗体(1：500)4 ℃孵育过夜，再分别用FITC标记的羊抗兔IgG二抗(1：500)、Cy3标记的羊抗鼠IgG二抗(1：500) 室温避光孵育1 h，PBS洗涤3次后，再加Hoechst 33342细胞核染色，PBS洗涤后晾干封片，于共聚焦显微镜下观察并拍照。各组均设未加一抗的阴性对照(PBS代替一抗)。信噪比大于1：5判定为阳性细胞。
1.2.3 细胞线粒体的标记分别用含100 nmol/L线粒体特异性标记物Mitotracker-red及Mitotracker-green的培养液标记RPE细胞与NSCs，37 ℃避光孵育45 min，弃标志液，用Hank平衡盐溶液漂洗5 min，重复5次，将标志液彻底洗净。
1.2.4 细胞间线粒体的交换分别用Mitotracker-green、Mitotracker-red标记RPE细胞和NSCs等量共培养，细胞密度为1×104/cm2，24 h后细胞核用Hoechst标记，于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍摄结果。
1.2.5 流式细胞分选收集共培养48 h的RPE细胞和NSCs，进行流式细胞分选，共培养的细胞按照是否有GFP标记分为阳性和阴性2群，收集GFP阴性的细胞群，将其用于后续实验。
1.2.6 细胞内活性氧水平检测分别收集第3代单独培养的RCS大鼠的RPE细胞和共培养后分选的RPE细胞，用荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。向待测细胞的培养皿中加入1 mL浓度为10 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃条件下孵育30 min，用PBS洗3次，消化细胞后离心弃上清，1 mL培养基重悬细胞，计数后调整细胞量为5×105/mL，离心后弃上清，用500 μL PBS重悬，上机检测。
1.2.7 细胞凋亡检测分别收集第3代RCS大鼠的RPE细胞和共培养分选后的RPE细胞，采用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)双染方法检测细胞凋亡率。将细胞消化成单个细胞，加入1×Binding Buffer将细胞密度调整至1×106/mL，取100 μL加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，室温避光孵育抗体15 min，同时设置空白对照和单阳对照，加入400 μL 1×Binding Buffer，上机检测。
1.2.8 细胞周期检测收集第3代RPE细胞和共培养分选后的RPE细胞，用PBS以5×105的密度重悬，取100 μL加入细胞周期检测试剂盒A液(胰蛋白酶等)100 μL室温孵育15 min，加入B液(RNA酶、胰酶抑制剂等)室温孵育15 min，加入细胞周期试剂盒C液(碘化丙啶等)室温下避光孵育20 min，上机检测，每个样本至少收集10 000个细胞，记录激发波长为488 nm处的红色荧光。
1.3 统计学分析采用SPSS 14.0 Statistics统计软件。本研究测量指标的数据资料经Kolmogorov-Smirnov检验呈正态分布，以x±s表示，组间均数经Levene检验方差齐。采用平行分组单因素干预两水平实验设计，均采用独立样本t检验。采用双尾检测法，检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 RCS大鼠RPE细胞的鉴定原代分离的RCS大鼠RPE细胞接种后7 d，部分细胞伸展，呈不规则形多边形，色素分布于核周(图 1A)。随着传代数量的增加，细胞质中色素逐渐减少。第3代RPE细胞色素较明显(图 1B)，细胞纯度较高，Bestrophin染色阳性率为(92.38±0.05)%(图 1C)，RPE65染色阳性率为(92.24±0.03)%(图 1D)。
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| A:原代RPE细胞培养7 d后，细胞呈多边形，胞内可见色素；B:第3代RPE细胞色素减少，细胞呈不规则多边形；C:第3代RPE细胞对Bestrophin抗体呈现阳性反应，细胞质对FITC呈现绿色荧光，细胞核对Hoechst呈现蓝色荧光；D:第3代RPE细胞对RPE65抗体呈现阳性反应，细胞质对Cy3呈现红色荧光，细胞核对Hoechst呈现蓝色荧光 图 1 原代RPE的培养及鉴定 |
2.2 RPE细胞、NSCs的线粒体标记以及TNT形成和线粒体交换
线粒体特异性染料Mitotracker-green标记NSCs细胞后，线粒体标记阳性细胞超过95%(图 2A)，Mitotracker-red标记RPE细胞后，线粒体标记阳性细胞超过95%(图 2B)；证实线粒体特异性标志Mitotracker-red和Mitotracker-green在该实验条件下标记细胞线粒体满足实验要求。标记Mitotracker-green的NSCs与标记Mitotracker-red的RPE细胞共培养后24 h，明场下可见RPE细胞与NSCs间形成细长的膜性结构(图 2C)，即TNT。随着时间的推移，NSCs中呈绿色荧光的线粒体通过TNT进入呈红色荧光的RPE细胞中(图 2D、E)。NSCs与RPE细胞间线粒体呈直线单向转运，符合TNT的特点。
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| A: mNSC细胞标记线粒体特异性标记物Mitotracker-green后，阳性细胞的线粒体呈绿色；B:RPE细胞标记线粒体特异性标记物Mitotracker-red后, 阳性细胞的线粒体呈红色；C:共培养24 h后，明场下可见RPE细胞与NSCs间形成TNT(↑示)；D:NSCs Mitotracker-green标记阳性，RPE细胞Mitotracker-red标记阳性，RPE细胞与NSCs间形成TNT(↑示)中可见绿色标记的NSCs线粒体(△示)从NSCs中向REP细胞转运；E:将图D白色线框区域放大，可见绿色标记的NSCs线粒体(△示)通过TNT从NSCs中向REP细胞转运；红色:线粒体特异性染色剂Mitotracker-red；绿色:线粒体特异性标记液Mitotracker-green；蓝色：Hoechst 33342 图 2 线粒体特异性标记以及TNT形成和线粒体转运 |
2.3 与NSCs共培养前后RPE细胞ROS的变化
共培养组的ROS荧光强度(73.56±3.49) 明显低于单独培养组(106.00±2.65)，差异具有统计学意义(P＜0.01，图 3)。提示与NSCs共培养后通过线粒体转运，RPE细胞的抗氧化水平得到改善。
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| 中文注解 图 3 流式细胞仪检测RCS-RPE单独培养组(A)和RCS-RPE/NSCs共培养组(B) ROS水平(n=3) |
2.4 与NSCs共培养后对RPE细胞周期的影响
单独培养组RPE细胞与共培养后RPE处于G1期细胞分别为(75.11±0.44)%和(73.36±0.83)%(P=0.010)，S期分别为(9.20±0.41)%和(10.28±0.34)%(P=0.007)，G2/M期分别为(15.69±0.61)%和(16.34±0.57)%(P=0.169)，增殖指数(prolifera-tion index, PI)分别为(24.89±0.38)%和(26.62±0.72)%(P=0.011)。结果显示：与单独培养组相比，共培养组RPE细胞处于S期比例及增殖指数均升高(图 4)。提示与NSCs共培养后通过线粒体转运，RPE细胞的增殖能力增加。
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| 图 4 流式细胞仪检测RCS-RPE单独培养组(A)及RCS-RPE/NSCs共培养组(B)细胞周期(n=4) |
2.5 与NSCs共培养后对RPE细胞凋亡水平的改变
共培养后早期凋亡细胞比例为(0.82±0.08)%，单独培养组早期凋亡细胞比例为(1.13±0.15)%(P=0.011，图 5)。提示NSCs共培养后通过线粒体转运，RPE细胞的凋亡水平降低。
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| 图 5 流式细胞仪检测RCS-RPE单独培养组(A)和RCS-RPE/NSCs共培养组(B)细胞凋亡(n=4) |
3 讨论
干细胞治疗视网膜变性疾病逐渐成为眼科领域的研究热点之一，其治疗机制有细胞替代、营养支持和移植区微环境的免疫调控作用[11]。已有研究表明间充质干细胞可以通过线粒体转运机制改善心肌细胞、血管平滑肌细胞、气管上皮细胞等细胞功能[2-5]。由此提出假设：干细胞可将自身线粒体转运至视网膜色素变性RPE细胞，并改善其细胞特性。
TNT是Rustom等[12]首次在PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化细胞株)之间观察到的一种细胞间的连接结构，是一种新发现的动物细胞间连接形式。本研究通过共聚焦显微镜观察小鼠NSCs与RPE细胞之间TNT的形成，观察到NSCs与RPE细胞之间可形成TNT，为细长的管状结构，连接两相邻但不直接接触的细胞。关于TNT如何形成及形成特点目前尚不清楚。
目前已发现多种细胞间均可形成类似该结构[13-15]，并且发现通过TNT不仅可以转运小分子物质、质膜成分，还可以转运线粒体等细胞器[16]。本研究将小鼠NSCs和原代分离的视网膜色素变性模型大鼠RPE细胞体外共培养24 h，发现线粒体从小鼠NSCs细胞内通过TNT转运到原代分离的RPE内，提示小鼠NSCs可将自身线粒体转运到视网膜色素变性模型大鼠的RPE细胞中，证实了NSCs可向RPE细胞进行线粒体转运。关于为何线粒体转运方向是从NSCs到RPE细胞的问题仍有待探讨。
RCS大鼠是经典的视网膜色素变性模型，其主要是因为MERTK基因突变，导致RPE吞噬感光细胞脱落的外节膜盘的功能下降，致使其在视网膜外层堆积，结构紊乱，继发性感光细胞变性死亡[17-18]。本研究结果已证实NSCs可通过TNT向RPE细胞转运线粒体，并且发现体外NSCs与RPE细胞直接共培养体系下，共培养组相比单独培养组RPE细胞的ROS水平有所降低，细胞增殖能力提高并且凋亡水平降低。提示NSCs可能通过将线粒体转运的机制，降低变性视网膜RPE细胞的ROS水平，并且改善其细胞增殖能力和凋亡水平，其具体通过何种机制实现改善RPE细胞的增殖和凋亡仍有待进一步研究。
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