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黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌的比较蛋白组学分析
罗文英1, 刘建军2, 丁瑜1, 杨拉维3, 任晓虎2     
1.524001 广东 湛江,广东医科大学附属医院检验科;
2.528055 深圳,深圳市疾病预防控制中心毒理实验室;
3.524001 广东 湛江,广东医科大学附属医院临床研究中心
[摘要] 目的 探讨黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P.a)的差异蛋白谱,以发现黏液型P.a潜在的生物标志物。方法 采用来自于临床囊性纤维化患者分离的3株黏液型P.a菌株,脉冲场凝胶电泳以确定它们的同源性;采用同位素相对和绝对定量标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合二维液相色谱串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)技术分析3株黏液型与对照组1株非黏液型P.a的差异蛋白谱,并采用RT-qPCR方法对5个共同差异蛋白进行验证。结果 3株黏液型P.a菌株不具有同源性,iTRAQ结果没有明显差异。3组共有219个上调和101个下调差异蛋白。pa2815、pa2018、dnak、pa5046和acef基因转录水平与iTRAQ结果一致。结论 不同黏液表型P.a的iTRAQ结果没有明显差异,219个上调和101个下调差异蛋白可以作为研究黏液型与非黏液型P.a致病机制的候选生物标志物。
[关键词] 黏液型     铜绿假单胞菌     生物标志物     蛋白质组学    
Comparative proteomics analysis between mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa strains
LUO Wenying1, LIU Jianjun2, DING Yu1, YANG Lawei3, REN Xiaohu2     
1. Department of Clinical Laboratory,Affiliated Hospiital of Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong Province 524001;
2. Laboratory of Toxicology, Shenzhen Center of Disease Control and Prevention, Shenzhen, Guangdong Province, 518055, China;
3. Center for Clinical Research, Affiliated Hospiital of Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong Province 524001
Supported by the National Natural Science Foundation for Young Scholars of China (81301478), the Non-funded Scientific Research Project of Zhanjiang City, Guangdong Province (2015B01042), and the Foundation for Guangdong Medical Science and Technology Research (B2017055)
Corresponding author: REN Xiaohu, E-mail:slim54@126.com
[Abstract] Objective To investigate the differences in protein profiling between mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa (P.a), in order to find the potential biological markers of mucoid P.a. Methods Three strains of mucoid P.a were isolated from the sputum of cystic fibrosis patients, and then pulsed field gel electrophoresis was used to determine their homology. Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) labeling strategy combined with two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry (2D LC-MS/MS) was used to investigate the differential protein abundances between the 3 mucous and 1 non-mucoid P.a strains. Differential expression of 5 common differential genes was verified by using RT-qPCR. Results There was no homology in the 3 mucoid P.a strains. No significant differences were found in the iTRAQ results of them. There were 219 up-regulated and 101 down-regulated proteins identified among the 3 strains. The transcriptional levels of pa2815, pa2018, dnak, pa5046 and acef genes were consistent with the results of iTRAQ. Conclusion There are no significant differences in the iTRAQ results of different mucous P.a strains. The obtained 219 up-regulated and 101 down-regulated differentially expressed proteins can be used as candidate biomarkers for the study of the pathogenesis of mucoid and non-mucoid P.a.
[Key words] mucoid     Pseudomonas aeruginosa     biomarkers     iTRAQ    

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P.a)是革兰阴性条件致病菌,它是医院感染的主要致病菌,可以造成囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)和危重患者的持续感染而危及生命[1-2]。根据美国NIH的调查公告,80%以上的细菌性感染与生物膜(biofilm,BF)有关,而P.a是极为常见的细菌BF相关感染病原菌。根据菌落形态及是否产生大量藻酸盐,可将P.a分为黏液型与非黏液型[3-5]。黏液表型比非黏液表型更能抵抗宿主的炎症防御机制和抗生素治疗,导致治疗效果不佳而引起慢性感染[6]。研究表明,囊性纤维化患者的慢性P.a肺部感染主要是由于BF形成的黏液型P.a菌株引起。因此,明确黏液型P.a形成机制对于发现清除或破坏黏液型P.a生物膜形成的药物靶标及防治黏液型囊性纤维性肺部感染至关重要。然而,黏液型P.a的形成机制仍然不明确。我们推测在不同黏液型P.a可能存在不同的生物标志物。

P.a整个基因组序列明确之后,就可以采用蛋白质组学方法进行P.a基因表达的功能分析[7-8]。因此,在本研究中,我们采用同位素相对和绝对定量标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)和二维液相色谱串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)技术[9]检测了来自于囊性纤维化患者的黏液型P.a64、766、14435和非黏液型P.a质控菌株27853差异蛋白谱,我们也对3组黏液型P.a的9个共同差异蛋白进行了转录水平验证分析,以发现黏液型与非黏液型P.a致病机制的一些候选生物标志物。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 供试菌株野生黏液型

64、766、14435 P.a来自于CF患者临床分离菌株,P.a质控菌株27853从卫生部临床检验中心购买。

1.1.2 主要仪器和试剂

超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司,中国),分光光度计(上海光谱仪器有限公司,中国),Ultimate3000液相色谱(Dionex,德国),Ultimate 3000 RSLCnano液相色谱及Q Exactive台式四极杆质谱仪(Thermo科技,美国),PMSF(上海生工,中国),丙酮、乙腈均购自美国Fisher公司,BCA定量试剂盒、甲酸铵、氢氧化钠均购自美国Sigma公司,甲酸(Fluka,美国)。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

64、766、14435与27853菌株接种哥伦比亚血平板,37 ℃、5% CO2过夜生长,挑取一部分单菌落进行脉冲场凝胶电泳分析(采用279812作为标准菌株);另外挑取单菌落接种于L-Broth培养液中,37 ℃×200 r/min振荡培养过夜。统一调D(600)= 0.8停止摇菌。细菌悬液4 ℃、5 min×5 000 r/min离心得细菌团块,细菌团块再用0.01 moL/L PBS (pH 7.4) 5 mL洗涤同前离心,重复两次得到细菌沉淀冻存在-80 ℃进行iTRAQ和2D LC-MS/MS技术分析。为保证实验结论可靠性,同一菌株4个平行摇菌处理再合并成1份。

1.2.2 iTRAQ和2D LC-MS/MS分析 1.2.2.1 蛋白提取、定量和iTRAQ标记

样本用液氮研磨成粉状,之后往样本中加入200 μL RIPA裂解液,反复吹打裂解组织。裂解后的组织超声处理1 min(2%,间隔时间1 s)破碎核酸,4 ℃、12 000 r/min× 20 min离心,收集上清液,蛋白浓度采用BSA定量试剂盒定量。蛋白定量后取200 μg蛋白溶液经还原、烷基化、胰蛋白酶酶切。对照菌株27853和黏液型菌株64、766、14435分别用4标iTRAQ试剂121、113、114和119标记。标记后的样品经真空冷冻离心干燥并冷冻保存待用。

1.2.2.2 液相色谱对肽段进行分离并进行质谱鉴定 1.2.2.2.1 第一维高PH-RP液相分离

用第一维高PH-RP的流动相A重溶标记后的多肽,混匀上样,从线性梯度开始收集组分,收集到24个EP管中,每1 min接1管,轮流收集,梯度为90 min;根据峰型和时间共收取24个组分,用50% TFA酸化,真空干燥后,进行第二维LC-MS分析。色谱柱信息: Phenomenex columns,Gemini-NX 3u C18 110A,150 mm×2.00 mm。A相:20 mmol/L HCOONH4,pH 10;B相:20 mmol/L HCOONH4,80% CAN,pH 10。紫外检测波长:214 nm/280 nm,流速:200 μL/min。

1.2.2.2.2 第二维反相液质联用

肽段用样品溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解,充分振荡涡旋,13 500 r/min,4 ℃离心20 min,上清转移到上样管中,进行质谱鉴定。色谱柱信息:内径75 μm×150 mm, 用Acclaim Pep Map RSLC C18填塞, 2 μm, 100Ǻ, nanoVipe。流动相A:0.1%甲酸;流动相B:0.1%甲酸,80% CAN,流速:300 nL/min,每个组分分析时间:65 min,有效梯度:B相从4%上升至50%。

1.2.2.2.3 分离肽段进行质谱鉴定

Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测,一级质谱参数:Resolution:70 000,AGC target:3e6,Maximum IT:40 ms,Scan range:350到1 800 m/z。二级质谱参数:Resolution:17 500,AGC target:1e5,Maximum IT:60 ms,TopN:20,NCE /stepped NCE:30。

1.2.3 蛋白质检索

利用ProteinPilotTM Software 4.5(AB Sciex)检索质谱分析所得数据,差异蛋白筛选标准设定为:肽段≥3;实验组黏液型P.a 64、766、14435和对照组非黏液型P.a质控菌株27853蛋白分子丰度比≥2或≤0.5;P < 0.05。运用Uniport软件分析各蛋白生物学过程及分子功能,运用Go软件从生物过程、细胞组成、分子功能注释对蛋白进行分类,选择KEGG数据库对蛋白所涉及的通路进行分类。

1.2.4 实时荧光定量PCR

64、766、14435和27853如前摇菌,离心得菌落团块。按照RNAprep pure cell/Bacteria试剂盒(Tiangen)说明提取总RNA。通过Nano Drop紫外分光光度计(Thermo科技,美国)测定RNA的含量及纯度[D(260)/D(280)]。总RNA采取逆转录试剂(TaKaRa)进行逆转录得到cDNAs。配置20 μL反应体系:10 μL SYBR Green Supermix,2 μL cDNA和1 μL 0.5 μmol/L引物。采用SybrGreen Quantitect试剂盒(Bio-Rad)及LightCycler® 480 Real-time PCR System (Roche, Sweden)进行扩增。95 ℃变性30 s,再按95 ℃×10 s →50 ℃×5 s扩增40个循环,核糖体rpsL基因作为内参基因。每个样本做3个平行实验。结果采用目标基因与内参基因(rpsL)的相对比表示[10]。扩增引物见表 1。引物采用Primer Premier 5.0设计。

表 1 研究采用的引物序列长度
名称 序列(5′-3′) 产物片段长度(bp)
PA2018-上游 GTTCGGCTCGGACTACATCGG 137
PA2018-下游 CCATCTCGCCCTGCTCGTT
PA2815-上游 TCCGCTGTTCGCCTGGTT 165
PA2815-下游 TGCTCTTCTTCGGTGAGTTGC
dnaK-上游 CACCGTGACGTCTATGACCTG 184
dnaK-下游 GCCGCTTTCCTTCTTGAACT
aceF-上游 CAGGTCTTCGTCAAGGAGCAAC 127
aceF-下游 TCGCCACTTCTTCCACTTCG
PA5046-上游 GAGCCCGCAGGCTTTCAT 152
PA5046-下游 CGTGCTGGTCATCGTGGAA

2 结果 2.1 3株黏液型P.a菌株的脉冲场凝胶电泳聚类分析

3株黏液型P.a菌株经脉冲场凝胶电泳电泳获得琼脂糖图谱后,采用279812P.a标准菌株作为对照,采用Bionumerics软件进行聚类分析,得出3株黏液型P.a菌株没有同源性(图 1AB)。

1~4:分别为279812P.a标准菌株、黏液型64 P.a菌株、黏液型766菌株、黏液型14435P.a菌株
A:脉冲场凝胶电泳结果,左侧标识为标准菌株相应碱基对大小;B:聚类分析结果
图 1 3株黏液型铜绿假单胞菌的脉冲场凝胶电泳的聚类分析

2.2 黏液型与非黏液型P.a菌株的差异蛋白鉴定

本实验基于iTRAQ标记结合2D LC-MS/MS技术对64、766、14435黏液型P.a相对于27853非黏液型P.a进行了蛋白差异分析,总共鉴定到3 702种蛋白质。以报告离子为121的27853非黏液型P.a为对照,64、766、14435黏液型P.a组分别标记为113、114、119,设定蛋白丰度差异达到>2倍(上调)或<0.5倍(下调),且经统计检验其P < 0.05的为差异蛋白。113相对于121有556个蛋白上调,543个蛋白下调;114相对于121有499个蛋白上调,391个蛋白下调;119相对于121有533个蛋白上调,481个蛋白下调。3组间差异蛋白经非参数分析没有明显不同(P > 0.05)。

2.3 差异蛋白的功能分类

3组差异蛋白(113/121、114/121、119/121) 根据Go注释进行了功能分类,选取3组丰度最高的差异蛋白进行直方图比较分析,见图 2ABC图 2A代表 3组差异蛋白的分子功能分布图。蛋白丰度最高的为离子绑定蛋白,主要由藻酸盐生物合成转录调控蛋白(Alginate biosynthesis transcriptional regulatory protein)、耐结节细胞分裂多药外排性转运蛋白[resistance-nodulation-cell division (RND) multidrug efflux transporter protein]、外膜孔蛋白(outer membrane porin protein)等构成。在黏液型菌株中这些蛋白丰度增加。经非参数方差分析3株黏液型菌株有着相似的蛋白表达水平(P > 0.05)。图 2B代表 3组差异蛋白的生物进程分布图。主要以细胞氮化合物代谢过程和生物合成过程蛋白为主。图 2C代表 3组差异蛋白的细胞组分分布图。主要以细胞内、细胞质、细胞溶质、核糖体蛋白为主。在3组黏液型P.a中有着相似的蛋白功能分类。

A:分子功能,1:离子绑定; 2:氧化还原酶活性; 3:脱氧核糖核酸绑定; 4:核酸结合转录因子活性; 5:跨膜转运蛋白活性; 6:连接酶活性; 7:核糖核酸绑定; 8:裂解酶活性; 9:核算绑定转录因子活性; 10:三磷酸腺苷酶活性。B:生物进程,1:生物活成过程; 2:细胞氧复合代谢过程; 3:小分子代谢进程; 4:运输; 5:细胞氨基酸代谢进程; 6:跨膜运输; 7:分解代谢过程; 8:碳水化合物代谢过程; 9:信号转导; 10:翻译。C:细胞组分,1:细胞质; 2:细胞内; 3:质膜; 4:蛋白复合物; 5:细胞; 6:核糖体; 7:外部封装结构; 8:细胞质; 9:胞外区; 10:细胞器;蓝、绿和黄色条状直方图分别代表 3组的蛋白数 图 2 3组差异蛋白的Go注释(113/121, 114/121, 119/121)

2.4 3组共同差异蛋白分析

3组间差异蛋白采用Venny 2.1工具进行分析见图 3(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html.)。3组共有219个上调蛋白和101个下调蛋白。3组共同蛋白的go功能分析见图 4ABC。320个共同差异蛋白主要分布在离子绑定(81个)、氧化还原酶活性(48个)、脱氧核糖核酸绑定(29个)、核糖核酸绑定(27个)、跨膜转运活性(20个)、核糖体的结构组成(20个)、核酸结合转录因子活性(16个)、裂解酶活性(14个)和连接酶活性(13个)。320共同差异蛋白主要与表型、抗生素耐药或毒力因子有关。219个共同上调蛋白中,有5个(2.28%)为耐药节结化细胞分化[resistance-nodulation-division (RND)]超家族,如耐药节结化细胞分化多药外排转运子[(PA2018)]、可能的耐药结节化细胞分化外流转运蛋白OS[(PA3676)]和耐药节结化细胞分化多药外排膜融合蛋白(PA2019)。

A:上调差异蛋白;B:下调差异蛋白 图 3 采用韦恩2.1工具分析3组差异蛋白(113/121、114/121、119/121) 结果

3组共同差异蛋白的Go注释(113/121、114/121、119/121) 图 4 A:生物进程;B:细胞组分;C:分子功能

2.5 蛋白-蛋白相互作用网络

我们运用STRING 9.1检索101个下调蛋白和219上调蛋白相互作用,见图 5

图 5 采用STRING v9.1绘制的3组共同差异蛋白的相互作用网路图

2.6 RT-qPCR结果

根据(95%)多肽和% Cov(95) 百分数和上调和下调差异程度,我们选取了5个差异蛋白进一步验证。因为没有这5个蛋白的相关抗体,所以我们采用RT-qPCR对这5个蛋白在基因水平进行了验证。不管这RT-qPCR和蛋白质组差异倍数改变差异,只要两者表达趋势一致,就意味着RT-qPCR与蛋白组学结果一致。RT-qPCR倍数变化低于1或超出1就表示下调或上调。正如图 6所示,pa2815、pa2018、dnak、pa5046和acef基因转录水平与iTRAQ结果一致。

图 6 差异蛋白的逆转录定量PCR验证

3 讨论

iTRAQ同位素标记技术是一种功能强大的可同时对4种样品进行绝对和相对定量研究的方法[11],结合LC/MS技术已被广泛地应用于细菌、酵母、人体组织、细胞和体液等多种样本的蛋白质鉴定和定量,具有高通量、重复性好、敏感性高等特点[12]。为此,我们采用了iTRAQ与2D LC-MS/MS分析对64、766、14435黏液型P.a相对于27853非黏液型P.a进行了蛋白差异分析,以发现新的差异蛋白。总共有11个RND-type efflux系统存在P.a PAO1基因组(http://www.pseudomonas.com/index.jsp.)。RND-type efflux pump被认为对抗P.a微生物药物都具有重要的耐药性[13]。在本研究中,耐药节结化细胞分化多药外排膜融合蛋白在3个组均下调,这提示耐药节结化细胞分化外排系统在耐黏液型P.a表型抗生素方面起着一个重要的角色。本研究共同差异蛋白含有86个无特征蛋白,其功能有待于进一步探讨。一些藻酸盐相关蛋白在64/27853和14435/27853组明显高表达,然而,在766/27853组没有差异,这提示在一些黏液型P.a中藻酸盐不一定总是增加。3株黏液型P.a菌株经脉冲场凝胶电泳分析不具有同源性,但3组间差异蛋白经非参数分析没有明显不同(P > 0.05),且3组间差异蛋白的Go功能分类也具有相似的趋势,这提示在不同黏液型P.a可能存在相似的蛋白表达谱及功能分类。

5个差异蛋白的转录水平采用RT-qPCR分析进一步验证。pa2815、pa2018、dnak、pa5046和acef基因转录水平与iTRAQ结果一致,证实了iTRAQ结果的可靠性,这5个差异蛋白亦可以作为研究黏液型P.a的生物标志物。

Pa2815基因(acyl-CoA dehydrogenase,ACAD)及Pa2018基因无论在蛋白水平还是在转录水平在黏液型P.a中都明显高表达。Pa2815基因是线粒体黄素酶,在脂肪和氨基酸分解代谢过程中催化acyl-CoA酯类的α, β-脱氢作用[14]。尽管11个ACADs在人类基因组测序中已经被认识,在细菌、真菌、植物和线虫中的几个同系物已经被认识[15-17],然而,这些酶在生命代谢中的分布还是未知的,在细菌特别是P.a中acyl-CoA脱氢酶的作用还是缺乏认识。根据本研究结果可以推测ACAD可能在黏液型P.a中的代谢或生长起着关键作用。Pa2018基因在革兰阴性杆菌和P.a的多重耐药中起着关键作用[18-21]。本研究结果也进一步证实在黏液型P.a中Pa2018表达明显增加,而可能导致抗生素的耐药。acef基因功能尚不明确。

总之,我们的发现为鉴定黏液型与非黏液型P.a的生物学特性提供了依据。

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罗文英, 刘建军, 丁瑜, 杨拉维, 任晓虎.
LUO Wenying, LIU Jianjun, DING Yu, YANG Lawei, REN Xiaohu.
黏液型与非黏液型铜绿假单胞菌的比较蛋白组学分析
Comparative proteomics analysis between mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa strains
第三军医大学学报, 2017, 39(13): 1345-1351
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(13): 1345-1351
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201701023

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收稿: 2017-01-05
修回: 2017-03-08

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