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miRNA-671上调抑制胃癌细胞增殖与迁移
唐佳佳, 叶林     
400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院重症医学科
[摘要] 目的 探索miR-671在胃癌组织和细胞中的表达,并研究其对胃癌细胞增殖和迁移的影响。方法 通过qRT-PCR实验检测miR-671在胃癌组织和细胞中的表达,通过CCK-8实验检测miR-671表达上调对MKN45胃癌细胞增殖,通过划痕和Transwell小室实验检测miR-671表达上调对MKN45胃癌细胞侵袭和迁移的影响。结果 与癌旁正常组织相比,胃癌组织中的miR-671表达明显下调(P < 0.01);与正常人胃黏膜上皮细胞相比,胃癌细胞中的miR-671表达也明显下调(P < 0.01);miR-671表达上调明显抑制MKN45胃癌细胞增殖、迁移和侵袭(P < 0.01)。结论 miR-671可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,在胃癌中发挥抑癌基因功能。
[关键词] miR-671     胃癌     增殖     迁移    
Up-regulation of miRNA-671 inhibits proliferation and invasion of gastric cancer cells
TANG Jiajia , YE Lin     
Department of Critical Care Medicine, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
Corresponding author: YE Lin, E-mail:329464286@qq.com
[Abstract] Objective To investigate the expression of miR-671 in gastric cancer tissues and cell lines, and determine its effects on the proliferation and invasion of gastric cancer cells. Methods The expression of miR-671 was detected in gastric cancer tissues and para-carcerous tissues from 8 patients and cell lines SGC7901, MKN28 and MKN45, and human gastric mucosal epithelial cell line GES-1 by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). CCK-8 assay was used to measure the cell proliferation after miR-671 up-regulation. The effect of miR-671 on cell migration and invasion was detected by wound healing assay and Transwell chamber assay. Results The expression level of miR-671 was significantly decreased in gastric cancer tissues than the adjacent normal tissues (P < 0.01). The expression levels of miR-671 were significantly decreased in the gastric cancer cell lines compared with GES-1 cells (P < 0.01). Up-regulation of miR-671 significantly inhibited the proliferation, migration and invasion in gastric cancer cells (P < 0.01). Conclusion miR-671 inhibits proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells, and may serve as a tumor suppressor.
[Key words] miR-671     gastric cancer     proliferation     migration    

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,其死亡率在恶性肿瘤中高居第3位[1-2]。虽然近年来胃癌的诊断和治疗水平有了较大进步,但由于胃癌的发生和发展机制远未明晰,造成胃癌的诊断和治疗仍面临诸多挑战。因此,进一步探索胃癌的发病机制和治疗手段显得尤为紧迫。

目前,普遍认为胃癌的发生和发展是一个多因素和多阶段的过程,涉及癌基因和抑癌基因的表达失调[3]。微小RNA (microRNA,miRNA)是一类内生的、非编码RNAs (长度19~25 nt),可以通过结合到靶基因的3′UTR来调节靶基因的功能,并在肿瘤的病理过程中参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡等进程[4-5]。最近的研究表明,miRNA与胃癌的发生和发展关系密切。例如miR-107的表达在胃癌中明显上调,下调其表达可以明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭[6];而miR-26b在胃癌组织中的表达明显下调,且与不良预后相关,上调其表达可以明显抑制胃癌细胞的迁移[7]。OH等[8]通过miRNA基因芯片发现miR-671在胃癌组织中明显低表达,但是miR-671在胃癌发生与发展中的作用还不清楚。本研究拟进一步研究miR-671在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达,同时研究miR-671对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法 1.1 胃癌组织标本和细胞系

胃癌组织标本来自本院2015年6月至2016年3月手术切除的8例胃癌患者(8例胃癌组织及其与对应病例匹配的癌旁正常组织)。患者均未接受过放化疗,并且均签署了知情同意书。本研究经过本院伦理委员会审批通过(2016)。GES-1、SGC7901、MKN28和MKN45细胞均由本实验室保存。

1.2 主要试剂

RPMI1640培养基(美国Life Technologies公司),胎牛血清(美国Invitrogen公司),TRIzol(美国Invitrogen公司),反转录试剂盒(美国Promega公司),RT-PCR试剂盒(大连TaKaRa公司),Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司),CCK-8(上海Beyotime公司),Transwell小室(美国BD Bioscience公司)。

1.3 实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)

胃癌组织中总RNA提取:将组织在有液氮的条件下研磨成粉末,然后加入1 mL TRIzol,作用15 min后按照说明书依次加入氯仿、异丙醇、75%乙醇提取总RNA;细胞中RNA提取:将细胞中培养基去掉并用PBS洗涤后,加入1 mL TRIzol,作用15 min后按照说明书依次加入氯仿、异丙醇、75%乙醇提取总RNA。

总RNA提取完成后,测定RNA浓度[D(260)/D(280)]。然后,通过反转录引物利用反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA。最后,miR-671上、下游引物用SYBR Premix Ex Taq kit试剂盒测定miR-671的相对表达量,并以U6基因作为内参。miR-671反转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCAC-TGGATACGACCTCCAGCC-3′;miR-671上游引物:5′-AGGAAGCCCTGGAGGGG-3′;U6反转录引物:5′-GTC-GTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGA-CAAAATATGGAAC-3′;U6上游引物:5′-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3′;共用下游引物:5′-CAGTGCAGGGTCC-GAGGT-3′。

反应条件如下:95 ℃条件下30 s,预变性,然后95 ℃,3 s,60 ℃条件下30 s,共进行40个循环。利用2-△△Ct法进行数据处理。

1.4 细胞转染

取对数生长期的MKN45细胞,经消化后,在1 000 r/min条件下离心5 min,然后将细胞按50%的汇合度接种到6孔板中,12 h后按100 nmol/L的浓度进行miR-671 mimic NC和miR-671 mimic的转染。

1.5 CCK-8实验

通过CCK-8实验检测miR-671对MKN45细胞增殖的影响。将MKN45细胞接种于96孔板中,将实验分成空白对照组(未处理组)、miR-671 mimic NC(miR-671表达对照组)和miR-671 mimic(miR-671表达组),分别于1、2、3、4 d进行CCK-8检测。每孔中加入10 μL CCK-8,孵育3.5 h后在450 nm处检测光密度值[D(450)]。

1.6 划痕实验

取对数生长期的MKN45细胞,经消化后,在1 000 r/min条件下离心5 min,然后将细胞按50%的汇合度接种到6孔板中,待细胞汇合度达到100%时,用1 mL枪头比着直尺垂直画线,将细胞中原有培养液吸去,并用PBS冲洗细胞3次,去掉细胞碎片,加入新鲜培养基继续培养72 h。

1.7 Transwell小室实验

取对数生长期的MKN45细胞,经消化后,在1 000 r/min条件下离心5 min,用新鲜培养基重悬后进行细胞计数,按每孔1×105个细胞接种于小室的上室中,下室内加入含有10%胎牛血清的培养基,继续培养48 h,然后用1%的结晶紫染色15 min,用PBS清洗,最后进行细胞计数。

1.8 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,实验结果以x±s表示,两组之间的差异比较行t检验。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 胃癌组织和胃癌细胞细胞系中miR-671的表达

qRT-PCR检测结果显示:miR-671在癌旁组织中的相对表达量为(1.81±0.05),而在胃癌组织中的表达量为(0.44±0.35),因此,与癌旁组织相比,miR-671在胃癌组织中的表达明显下调(P < 0.01)。胃癌细胞系qRT-PCR检测结果显示:与正常胃黏膜上皮细胞(GES-1) 相比,3株肿瘤细胞系(SGC7901、MKN28和MKN45) 中miR-671的相对表达均明显下调(P < 0.01,图 1)。

1: GES-1细胞;2:SGC7901细胞;3:MKN28细胞;4:MKN45细胞   a: P < 0.01, 与GES-1细胞比较 图 1 qRT-PCR检测miR-671在胃癌细胞系中的相对表达

2.2 miR-671 mimic转染MKN45细胞后表达验证

将细胞分为空白对照组、miR-671 mimic NC组和miR-671 mimic组。qRT-PCR检测结果显示:与miR-671 mimic NC组相比,miR-671 mimic组miR-671表达明显升高(P < 0.01,图 2)。

1:空白对照组;2:miR-671 mimic NC组;3:miR-671 mimic组  a: P < 0.01, 与miR-671 mimic NC组比较 图 2 qRT-PCR检测MKN45转染后miR-671的相对表达

2.3 miR-671上调后对MKN45细胞增殖能力的影响

CCK-8实验结果表明:与空白对照组MKN45细胞相比,miR-671 mimic NC组细胞在1、2、3、4 d的增殖能力差异没有统计学意义(P>0.05);与miR-671 mimic NC组细胞相比,miR-671 mimic组细胞在2、3、4 d的增殖能力均明显降低(P < 0.01,图 3)。

a: P < 0.01, 与miR-671 mimic NC组比 图 3 miR-671上调后对MKN45细胞增殖能力的影响

2.4 miR-671上调后对MKN45细胞迁移能力的影响

划痕实验结果表明:与空白对照组MKN45细胞相比,miR-671 mimic NC组细胞的迁移能力差异没有统计学意义(P>0.05);与miR-671 mimic NC组细胞相比,miR-671 mimic组细胞的迁移能力明显降低(P < 0.01,图 4)。

图 4 miR-671上调后对MKN45细胞迁移能力的影响(LM)

2.5 miR-671上调后对MKN45细胞侵袭能力的影响

Transwell小室实验结果表明:空白对照组、miR-671 mimic NC组和miR-671 mimic组的细胞侵袭数分别为(154±11)、(160±13) 和(74±13),与miR-671 mimic NC组相比,miR-671 mimic组细胞的侵袭能力明显降低(P < 0.01,图 5)。

A:空白对照组;B:miR-671 mimic NC组;C:miR-671 mimic组 图 5 miR-671上调后对MKN45细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色×400)

3 讨论

miRNAs在多种肿瘤中扮演重要角色[9]。在胃癌中,前期miRNAs微阵列已经筛选出了在肿瘤和正常组织中差异表达的miRNAs,并阐明了部分miRNAs在胃癌发生、发展中的作用,如miR-375通过抑制PDK1和14-3-3 zeta来调节胃癌细胞的存活[10]。但是,许多在胃癌中异常表达的miRNAs的功能还不清楚。本研究发现miR-671在8例胃癌组织中的表达较8例癌旁正常组织明显下调,并且在胃癌细胞系中的表达明显低于正常胃黏膜上皮细胞。这与OH等[8]通过miRNA基因芯片发现miR-671在胃癌组织中明显低表达的结果一致。我们推测miR-671在胃癌中很有可能发挥抑癌基因的作用。

为了验证推断,我们通过miR-671 mimic来实现miR-671在MKN45细胞中的高表达,然后探讨miR-671上调对MKN45细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。我们发现miR-671上调能明显抑制MKN45细胞的增殖能力,同时抑制其迁移和侵袭能力。这表明miR-671在胃癌中具有抑癌基因。上述结果与miR-671在其他肿瘤中的作用类似。RUTNAM等[11]在乳腺癌研究中发现miR-671上调后可以通过结合到FN1和CD44 3′UTR来抑制它们的蛋白表达,进而抑制乳腺癌细胞的转移和粘附。CD44已被证明与胃癌的起始和发展关系密切[12]。HU等[13]的研究表明抑制CD44的表达可以抑制CD44阳性胃癌细胞的侵袭。而YASUI等[14]的研究表明CD44的表达与胃腺癌中增殖相关指标Ki-67呈正相关。上述研究进一步佐证了我们在胃癌中发现的miR-671的重要作用。miRNAs作用的发挥往往是通过直接作用于下游靶基因的3′UTR并抑制其表达来实现的。虽然在乳腺癌中miR-671可以直接抑制CD44和FN1的表达,但是在胃癌中miR-671是否也能直接抑制CD44和FN1的表达还需要进一步研究。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612169
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

唐佳佳, 叶林.
TANG Jiajia, YE Lin.
miRNA-671上调抑制胃癌细胞增殖与迁移
Up-regulation of miRNA-671 inhibits proliferation and invasion of gastric cancer cells
第三军医大学学报, 2017, 39(16): 1643-1647
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(16): 1643-1647
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612169

文章历史

收稿: 2016-12-24
修回: 2017-03-15

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