胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其死亡率在恶性肿瘤中高居第3位[1-2]。虽然近年来胃癌的诊断和治疗水平有了较大进步，但由于胃癌的发生和发展机制远未明晰，造成胃癌的诊断和治疗仍面临诸多挑战。因此，进一步探索胃癌的发病机制和治疗手段显得尤为紧迫。
目前，普遍认为胃癌的发生和发展是一个多因素和多阶段的过程，涉及癌基因和抑癌基因的表达失调[3]。微小RNA (microRNA，miRNA)是一类内生的、非编码RNAs (长度19~25 nt)，可以通过结合到靶基因的3′UTR来调节靶基因的功能，并在肿瘤的病理过程中参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移和凋亡等进程[4-5]。最近的研究表明，miRNA与胃癌的发生和发展关系密切。例如miR-107的表达在胃癌中明显上调，下调其表达可以明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭[6]；而miR-26b在胃癌组织中的表达明显下调，且与不良预后相关，上调其表达可以明显抑制胃癌细胞的迁移[7]。OH等[8]通过miRNA基因芯片发现miR-671在胃癌组织中明显低表达，但是miR-671在胃癌发生与发展中的作用还不清楚。本研究拟进一步研究miR-671在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达，同时研究miR-671对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
1 材料与方法 1.1 胃癌组织标本和细胞系胃癌组织标本来自本院2015年6月至2016年3月手术切除的8例胃癌患者(8例胃癌组织及其与对应病例匹配的癌旁正常组织)。患者均未接受过放化疗，并且均签署了知情同意书。本研究经过本院伦理委员会审批通过(2016)。GES-1、SGC7901、MKN28和MKN45细胞均由本实验室保存。
1.2 主要试剂RPMI1640培养基(美国Life Technologies公司)，胎牛血清(美国Invitrogen公司)，TRIzol(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒(美国Promega公司)，RT-PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)，Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，CCK-8(上海Beyotime公司)，Transwell小室(美国BD Bioscience公司)。
1.3 实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)胃癌组织中总RNA提取：将组织在有液氮的条件下研磨成粉末，然后加入1 mL TRIzol，作用15 min后按照说明书依次加入氯仿、异丙醇、75%乙醇提取总RNA；细胞中RNA提取：将细胞中培养基去掉并用PBS洗涤后，加入1 mL TRIzol，作用15 min后按照说明书依次加入氯仿、异丙醇、75%乙醇提取总RNA。
总RNA提取完成后，测定RNA浓度[D(260)/D(280)]。然后，通过反转录引物利用反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA。最后，miR-671上、下游引物用SYBR Premix Ex Taq kit试剂盒测定miR-671的相对表达量，并以U6基因作为内参。miR-671反转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCAC-TGGATACGACCTCCAGCC-3′；miR-671上游引物：5′-AGGAAGCCCTGGAGGGG-3′；U6反转录引物：5′-GTC-GTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGA-CAAAATATGGAAC-3′；U6上游引物：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3′；共用下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCC-GAGGT-3′。
反应条件如下：95 ℃条件下30 s，预变性，然后95 ℃，3 s，60 ℃条件下30 s，共进行40个循环。利用2-△△Ct法进行数据处理。
1.4 细胞转染取对数生长期的MKN45细胞，经消化后，在1 000 r/min条件下离心5 min，然后将细胞按50%的汇合度接种到6孔板中，12 h后按100 nmol/L的浓度进行miR-671 mimic NC和miR-671 mimic的转染。
1.5 CCK-8实验通过CCK-8实验检测miR-671对MKN45细胞增殖的影响。将MKN45细胞接种于96孔板中，将实验分成空白对照组(未处理组)、miR-671 mimic NC(miR-671表达对照组)和miR-671 mimic(miR-671表达组)，分别于1、2、3、4 d进行CCK-8检测。每孔中加入10 μL CCK-8，孵育3.5 h后在450 nm处检测光密度值[D(450)]。
1.6 划痕实验取对数生长期的MKN45细胞，经消化后，在1 000 r/min条件下离心5 min，然后将细胞按50%的汇合度接种到6孔板中，待细胞汇合度达到100%时，用1 mL枪头比着直尺垂直画线，将细胞中原有培养液吸去，并用PBS冲洗细胞3次，去掉细胞碎片，加入新鲜培养基继续培养72 h。
1.7 Transwell小室实验取对数生长期的MKN45细胞，经消化后，在1 000 r/min条件下离心5 min，用新鲜培养基重悬后进行细胞计数，按每孔1×105个细胞接种于小室的上室中，下室内加入含有10%胎牛血清的培养基，继续培养48 h，然后用1%的结晶紫染色15 min，用PBS清洗，最后进行细胞计数。
1.8 统计学处理采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，实验结果以x±s表示，两组之间的差异比较行t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 胃癌组织和胃癌细胞细胞系中miR-671的表达qRT-PCR检测结果显示：miR-671在癌旁组织中的相对表达量为(1.81±0.05)，而在胃癌组织中的表达量为(0.44±0.35)，因此，与癌旁组织相比，miR-671在胃癌组织中的表达明显下调(P < 0.01)。胃癌细胞系qRT-PCR检测结果显示：与正常胃黏膜上皮细胞(GES-1) 相比，3株肿瘤细胞系(SGC7901、MKN28和MKN45) 中miR-671的相对表达均明显下调(P < 0.01，图 1)。
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| 1: GES-1细胞；2：SGC7901细胞；3：MKN28细胞；4：MKN45细胞 a: P < 0.01, 与GES-1细胞比较 图 1 qRT-PCR检测miR-671在胃癌细胞系中的相对表达 |
2.2 miR-671 mimic转染MKN45细胞后表达验证
将细胞分为空白对照组、miR-671 mimic NC组和miR-671 mimic组。qRT-PCR检测结果显示：与miR-671 mimic NC组相比，miR-671 mimic组miR-671表达明显升高(P < 0.01，图 2)。
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| 1：空白对照组；2：miR-671 mimic NC组；3：miR-671 mimic组 a: P < 0.01, 与miR-671 mimic NC组比较 图 2 qRT-PCR检测MKN45转染后miR-671的相对表达 |
2.3 miR-671上调后对MKN45细胞增殖能力的影响
CCK-8实验结果表明：与空白对照组MKN45细胞相比，miR-671 mimic NC组细胞在1、2、3、4 d的增殖能力差异没有统计学意义(P>0.05)；与miR-671 mimic NC组细胞相比，miR-671 mimic组细胞在2、3、4 d的增殖能力均明显降低(P < 0.01，图 3)。
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| a: P < 0.01, 与miR-671 mimic NC组比 图 3 miR-671上调后对MKN45细胞增殖能力的影响 |
2.4 miR-671上调后对MKN45细胞迁移能力的影响
划痕实验结果表明：与空白对照组MKN45细胞相比，miR-671 mimic NC组细胞的迁移能力差异没有统计学意义(P>0.05)；与miR-671 mimic NC组细胞相比，miR-671 mimic组细胞的迁移能力明显降低(P < 0.01，图 4)。
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| 图 4 miR-671上调后对MKN45细胞迁移能力的影响(LM) |
2.5 miR-671上调后对MKN45细胞侵袭能力的影响
Transwell小室实验结果表明：空白对照组、miR-671 mimic NC组和miR-671 mimic组的细胞侵袭数分别为(154±11)、(160±13) 和(74±13)，与miR-671 mimic NC组相比，miR-671 mimic组细胞的侵袭能力明显降低(P < 0.01，图 5)。
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| A：空白对照组；B：miR-671 mimic NC组；C：miR-671 mimic组 图 5 miR-671上调后对MKN45细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色×400) |
3 讨论
miRNAs在多种肿瘤中扮演重要角色[9]。在胃癌中，前期miRNAs微阵列已经筛选出了在肿瘤和正常组织中差异表达的miRNAs，并阐明了部分miRNAs在胃癌发生、发展中的作用，如miR-375通过抑制PDK1和14-3-3 zeta来调节胃癌细胞的存活[10]。但是，许多在胃癌中异常表达的miRNAs的功能还不清楚。本研究发现miR-671在8例胃癌组织中的表达较8例癌旁正常组织明显下调，并且在胃癌细胞系中的表达明显低于正常胃黏膜上皮细胞。这与OH等[8]通过miRNA基因芯片发现miR-671在胃癌组织中明显低表达的结果一致。我们推测miR-671在胃癌中很有可能发挥抑癌基因的作用。
为了验证推断，我们通过miR-671 mimic来实现miR-671在MKN45细胞中的高表达，然后探讨miR-671上调对MKN45细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。我们发现miR-671上调能明显抑制MKN45细胞的增殖能力，同时抑制其迁移和侵袭能力。这表明miR-671在胃癌中具有抑癌基因。上述结果与miR-671在其他肿瘤中的作用类似。RUTNAM等[11]在乳腺癌研究中发现miR-671上调后可以通过结合到FN1和CD44 3′UTR来抑制它们的蛋白表达，进而抑制乳腺癌细胞的转移和粘附。CD44已被证明与胃癌的起始和发展关系密切[12]。HU等[13]的研究表明抑制CD44的表达可以抑制CD44阳性胃癌细胞的侵袭。而YASUI等[14]的研究表明CD44的表达与胃腺癌中增殖相关指标Ki-67呈正相关。上述研究进一步佐证了我们在胃癌中发现的miR-671的重要作用。miRNAs作用的发挥往往是通过直接作用于下游靶基因的3′UTR并抑制其表达来实现的。虽然在乳腺癌中miR-671可以直接抑制CD44和FN1的表达，但是在胃癌中miR-671是否也能直接抑制CD44和FN1的表达还需要进一步研究。
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