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下调STYK1基因表达可抑制结直肠癌细胞生长与侵袭
唐佳佳, 叶林     
400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院重症医学科
[摘要] 目的 探讨STYK1基因下调对结直肠癌细胞HCT-15增殖、凋亡和迁移以及MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路的影响。方法 采用基因干扰技术抑制结直肠癌细胞HCT-15中STYK1的表达,Western blot检测抑制效果,CCK-8检测STYK1表达下调对HC-T15细胞增殖的影响,流式细胞仪检测STYK1表达下调对HC-T15细胞凋亡的影响,Transwell小室实验检测STYK1表达下调对HCT-15细胞侵袭的影响,通过Western blot检测STYK1表达下调对HCT-15细胞MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性的影响。结果 与干扰对照组相比,STYK1表达下调明显抑制HCT-15细胞增殖活性(P < 0.01) 和侵袭能力(P < 0.01),并诱导细胞凋亡(P < 0.01);同时,STYK1表达下调明显抑制HCT-15细胞ERK1/2和AKT蛋白的磷酸水平。结论 STYK1基因干扰可以抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭,并诱导凋亡,其机制可能与抑制MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性有关。
[关键词] miR-671     直肠癌     增殖     迁移    
STYK1 down-regulation suppresses colorectal cancer cell growth and invasion in vitro
TANG Jiajia , YE Lin     
Department of Critical Care Medicine, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
Corresponding author: YE Lin, E-mail: 329464286@qq.com
[Abstract] Objective To determine the effects of down-regulating serine/threonine/tyrosine kinase 1 (STYK1) on the proliferation, apoptosis and invasion and on MEK/ERK and PI3K/AKT signaling pathways in human colorectal cancer cell line HCT-15. Methods The expression of STYK1 protein was down-regulated by RNA interference technique in HCT-15 cells. Then, the STYK1 protein expression was detected by Western blotting. CCK-8 assay was used to measure the effect of STYK1 down-regulation on the proliferation of the cells, flow cytometry was employed to detect the cell apoptosis, and Transwell chamber assay was adopted for cell invasion ability. The expression levels of p-ERK1/2 and p-AKT were detected by Western blotting. Results Compared with the siRNA NC group, STYK1 down-regulation significantly inhibited the proliferation (P < 0.01) and invasion (P < 0.01), induced cell apoptosis (P < 0.01), and suppressed the expression levels of p-ERK1/2 and p-AKT in the HCT cells transfected with STYK1 siRNA (P < 0.01). Conclusion STYK1 down-regulation inhibits the proliferation and invasion and induces the apoptosis in colorectal cancer cells, which may be related to its inhibition on the MEK/ERK and PI3K/AKT signaling pathways.
[Key words] serine/threonine/tyrosine kinase 1     colorectal cancer     proliferation     invasion    

目前,结直肠癌是世界上第三大常见的恶性肿瘤[1-2]。在美国,其死亡率在癌症患者中高居第2位,仅次于肺癌[3]。当结直肠癌被早期诊断发现且未转移时,通过手术可以治愈。但是,仅有39.6%的结肠癌患者会在早期被发现[4]。当结直肠癌被诊断为晚期时,化疗药物的疗效变得非常有限。因此,迫切需要新的治疗手段和治疗靶点。

STYK1也称为NOK,是一种潜在人类受体蛋白激酶,属于受体酪氨酸激酶家族,由一个跨膜结构域和一个胞内结构域组成[5-6]。近些年来,研究表明STYK1在多种肿瘤组织中表达上调,其中包括乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌和卵巢癌等[7-11]。在肝癌中,下调STYK1的蛋白表达可以抑制肝癌细胞的增殖和侵袭与迁移[10]。因此,STYK1的异常表达与肿瘤发生和发展关系密切。ORANG等[12]发现STYK1在结直肠癌肿瘤组织中高表达。而HU等[13]发现STYK1在结直肠癌肿瘤组织中明显高表达,并且与肿瘤分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移和不良预后均密切相关。但是STYK1在结直肠癌发生与发展中的作用还少见报道。本研究拟探讨STYK1在结直肠癌细胞系中的功能,以期为结直肠癌的治疗提供潜在的作用靶点。

1 材料与方法 1.1 材料

人结直肠癌细胞株HCT-15购自;RPMI1640培养基购自美国Life Technologies公司;胎牛血清、TRIzol和Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;RIPA蛋白抽提裂解液购自武汉博士德公司;CCK-8购自上海Beyotime公司;Annexin V/PI凋亡检测试剂盒和Transwell小室购自美国BD Bioscience公司;兔抗人STYK1多克隆抗体购自Abcam;兔抗人ERK1/2、ERK1/2、AKT和p-AKT单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司;兔抗人GAPDH多克隆抗体购自武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HCT-15细胞用RPMI1640(含10%优质胎牛血清)培养基培养,并置于37 ℃、95%空气和5% CO2的培养箱环境中,每2~3天传代1次。

1.2.2 STYK1干扰靶点设计与细胞转染

由上海生博生物医药科技有限公司设计并合成STYK1的3条siRNA和对照序列,信息如下:STYK1 siRNA1: 5′-CAAGTATATCACATCGGAAAG-3′;STYK1 siRNA2: 5′-GCCCATCTTTCGAGCCAATAT-3′;STYK1 siRNA3: 5′-CGGGATGTGATGACTATGGAT-3′;siRNA NC: 5′-TTC-TCCGAACGTGTCACGT-3′。

取对数生长期的HCT-15细胞,经过胰蛋白酶消化后,在1 000 r/min的条件下离心5 min,将HCT-15细胞用新鲜培养基重悬,然后按50%的汇合度接种到6孔板中,接种12 h后按50 nmol/L的浓度将siRNA NC和STYK1 siRNA转染到HCT-15细胞中。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达

将转染72 h后的细胞收集,并用RIPA蛋白抽提裂解液提取各组细胞的总蛋白,然后用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。然后,加入5×Buffer SDS上样缓冲液于沸水中将蛋白变性,再根据目的蛋白分子量配置SDS-PAGE凝胶,按照每孔50 μg总蛋白量进行上样,然后电泳并转膜,转膜完成后用5%的脱脂奶粉在室温条件下封闭2 h,加入一抗,4 ℃条件过夜,次日用TBST洗膜,然后添加辣根过氧化酶标记的二抗,37 ℃条件下孵育1 h,孵育完毕后TBST洗膜,用ECL化学发光发进行显影,最后用Quantity one软件进行目的条带的灰度分析。

1.2.4 CCK-8实验

取对数生长期的HCT-15细胞,将其接种到96孔板中,将实验分成空白对照组、干扰对照组和STYK1 siRNA组,分别于1、2、3、4 d连续进行CCK-8检测。检测前每孔中加入CCK-8试剂10 μL,然后在37 ℃条件下孵育3.5 h,然后用酶标仪检测波长450 nm处的光密度值D(450)。

1.2.5 流式测凋亡实验

收集转染72 h后的HCT-15细胞,在1 000 r/min条件下低速离心后用预冷的PBS冲洗2次,然后加入2 μL AnnexinV-FITC(20 μg/mL),轻轻混匀,在避光条件下于冰上静置20 min,然后加入PBS洗涤,最后加入1 μL PI(50 μg/mL),作用约2 min后通过流式检测各样品的凋亡情况。

1.2.6 Transwell小室实验

Transwell小室实验根据本课题组前期实验方法[14]。收集转染24 h后的HCT-15细胞,在1 000 r/min低速条件下离心6 min,并用血球计数板进行细胞计数,按每孔5×104个细胞接种于Transwell小室的上室,下室添加RPMI1640(含10%优质胎牛血清)700 μL,置于37 ℃条件培养箱中继续培养48 h,迁移完成后底膜用冰甲醇固定10 min,用1%的结晶紫染色15 min,利用PBS清洗2遍,然后用树脂封片,最后进行细胞计数。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据统计分析,计量资料以x±s表示,两组之间的差异比较均采用t检验,检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 Western blot实验验证STYK1干扰靶点效果

Western blot检测结果显示,3个干扰靶点转染HCT-15细胞后STYK1蛋白分别为(0.19±0.06)、(0.27±0.04)、(0.33±0.03),与干扰对照组相比(1.00±0.16),本研究设计的3个干扰靶点均能有效抑制STYK1蛋白的表达(P < 0.01,图 1);其中,STYK1 siRNA1靶点的抑制效果最明显(图 1),后续实验将采用此靶点进行STYK1蛋白抑制。

A: Western blot检测结果;B:半定量分析结果;1:空白对照组,2:干扰对照组,3:STYK1 siRNA 1组,4:STYK1 siRNA 2组,5:STYK1 siRNA 3组a: P < 0.01, 与干扰对照组比较 图 1 Western blot实验验证STYK1干扰靶点效果

2.2 STYK1下调后对HCT-15细胞增殖的影响

CCK-8实验检测结果表明:与空白对照组HCT-15细胞相比,干扰对照组细胞在1、2、3、4 d的增殖活力没有明显的变化趋势(P > 0.05);与干扰对照组HCT-15细胞相比,STYK1下调后在第3天和第4天的增殖能力明显降低(P < 0.01,图 2)。

a: P < 0.01, 与干扰对照组比较 图 2 CCK-8实验检测STYK1干扰后对HCT-15细胞增殖的影响

2.3 STYK1干扰后对HCT-15细胞凋亡的影响

流式细胞术检测STYK1下调是否会诱导HCT-15细胞的凋亡。结果表明:空白对照组、干扰对照组和STYK1 siRNA组细胞凋亡率分别为(7.29±0.77)%、(7.80±0.81)%、(13.65±1.10)%;与空白对照组HCT-15细胞的凋亡率相比,干扰对照组HCT-15细胞凋亡百分率差异没有统计学意义(P > 0.05);与干扰对照组HCT-15细胞相比,STYK1下调后能够明显诱导HCT-15细胞凋亡(P < 0.01,图 3)。

A:空白对照组;B:干扰对照组;C:STYK1 siRNA组 图 3 流式细胞术检测STYK1干扰后对HCT-15细胞凋亡的影响

2.4 STYK1干扰后对HCT-15细胞侵袭能力的影响

Transwell检测结果表明空白对照组、干扰对照组和STYK1 siRNA组细胞侵袭数分别为(75±6)、(72±8) 和(42±4);与空白对照组HCT-15细胞相比,干扰对照组HCT-15细胞侵袭数差异无统计学意义(P > 0.05);与干扰对照组HCT-15细胞相比,STYK1下调后可明显抑制HCT-15细胞侵袭(P < 0.01,图 4)。

A:空白对照组;B:干扰对照组;C:STYK1 siRNA组 图 4 Transwell实验检测STYK1干扰后对HCT-15细胞侵袭的影响(结晶紫×400)

2.5 STYK1干扰后对HCT-15细胞MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性的影响

Western blot检测结果表明,空白对照组、干扰对照组和STYK1 siRNA组细胞p-ERK1/2蛋白相对表达量分别为(0.37±0.05)、(0.38±0.05) 和(0.19±0.03),而p-AKT蛋白相对表达量分别为(1.06±0.09)、(1.12±0.11) 和(0.53±0.09);与空白对照组HCT-15细胞相比,干扰对照组HCT-15细胞p-ERK1/2和p-AKT蛋白相对表达量差异无统计学意义(P > 0.05);与干扰对照组HCT-15细胞相比,STYK1下调后能够明显抑制HCT-15细胞p-ERK1/2和p-AKT蛋白相对表达量(P < 0.01,图 5)。

1:空白对照组,2:干扰对照组, 3: STYK1 siRNA组 图 5 Western blot检测STYK1干扰后对HCT-15细胞MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性的影响

3 讨论

越来越多的证据表明在结直肠癌中特异性上调或者下调的基因可以作为早期诊断标记、预后指标或治疗靶点[15-16]。STYK1就是这样一个基因,它在多种肿瘤中表达上调[6-10, 17]。同时,HU等[13]的研究发现,STYK1在结直肠癌肿瘤组织中明显高表达,并且与肿瘤分化程度、肿瘤分期、淋巴结转移和不良预后均密切相关。这预示STYK1可能与结直肠癌细胞的增殖和迁移密切相关。因此,本研究利用基因干扰技术抑制结直肠癌细胞中STYK1的表达,我们发现STYK1表达下调明显抑制HCT-15细胞增殖活性和侵袭能力,并诱导细胞凋亡。本研究结果与STYK1在其他肿瘤中的功能是一致的。例如,在BaF3细胞中,STYK1可以促进其增殖和迁移[6]。而CHUNG等[17]在前列腺癌的研究中发现,STYK1干扰后能抑制前列腺癌细胞的增殖活力。同时,WANG等[10]在肝癌的研究中也发现,STYK1干扰后抑制肝癌细胞的增殖和迁移,而STYK1过表达促进肝癌细胞的增殖和迁移。综上所述,STYK1在多种肿瘤中发挥癌基因的作用。

虽然上述研究中我们探讨了STYK1在结直肠癌中发挥癌基因的作用,但是其调控机制还不清楚。在肝癌中,STYK1可以通过激活MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性来促进肝癌细胞的增殖和迁移能力[10]。同时,大量研究表明:MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路激活可以促进细胞的增殖,提高细胞的迁移能力,并诱导EMT[18-20]。在结直肠癌中,MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性与肿瘤细胞的侵袭和凋亡等密切相关[21-22]。因此,我们推测STYK1干扰可能会影响结直肠癌细胞中MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路的活性。因此,我们通过Western blot检测STYK1干扰对结直肠癌细胞MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性的影响,结果表明STYK1表达抑制后明显降低两个通路的活性,与WANG等[10]在肝癌中的研究结果相符。

综上所述,本研究通过基因干扰技术成功抑制了STYK1蛋白的表达,并证明STYK1干扰可以抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭,诱导凋亡,并且抑制结直肠癌细胞MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性,为结直肠癌的治疗提供了一定的理论依据。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612168
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唐佳佳, 叶林.
TANG Jiajia, YE Lin.
下调STYK1基因表达可抑制结直肠癌细胞生长与侵袭
STYK1 down-regulation suppresses colorectal cancer cell growth and invasion in vitro
第三军医大学学报, 2017, 39(17): 1734-1738
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(17): 1734-1738
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612168

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收稿: 2016-12-24
修回: 2017-03-03

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