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白藜芦醇对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及其与Sirt1-p53通路的关系
苟毅1, 余天雾1, 黄中荣1, 张雷达2     
1.402160 重庆 永川,重庆医科大学附属永川医院肝胆外科;
2.400038 重庆,第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所
[摘要] 目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)的保护作用及其具体分子机制。方法 雄性6周龄SD大鼠20只随机数字法分为4组(n=5):假手术组、缺血再灌注组、RES预处理组、RES预处理+抑制剂组。建立大鼠肝脏70%热缺血再灌注模型(缺血1 h,再灌注6 h),并提前1 h给予RES及Sirt1抑制剂(EX527)。建模后检测血清标本中ALT活力及肝组织SOD活性,HE染色观察肝组织病理损伤,TUNEL法检测肝细胞凋亡,实时荧光定量PCR和Western blot检测肝组织Sirt1、乙酰化p53、Bax表达水平。结果 RES能够显著降低由HIRI引起的ALT活力升高(P<0.01) 并增加SOD活性(P<0.01),显著缓解由HIRI引起的肝脏病理学改变(P<0.01) 和减少肝细胞凋亡(P<0.01),显著提高Sirt1和Bax mRNA表达水平(P<0.01,P<0.01),提高Sirt1和Bax蛋白表达水平(P<0.01,P<0.01) 并降低乙酰化p53蛋白表达水平(P<0.01)。结论 RES能减轻缺血再灌注诱导的肝脏损伤,该保护作用部分是通过激动Sirt1-p53通路实现。
[关键词] 白藜芦醇     肝缺血再灌注损伤     sirt1-p53通路    
Protective effect of resveratrol against hepatic ischemia reperfusion injury in rats and its relationship with Sirt1-p53 signaling pathway
GOU Yi1, YU Tianwu1, HUANG Zhongrong1, ZHANG Leida2     
1. Department of Hepatobiliary Surgery, Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 402160;
2. Institute of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
Supported by the Project of Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University (YJQN201432)
Corresponding author: ZHANG Leida, E-mail:2518569931@qq.com
[Abstract] Objective To investigate the effect of resveratrol (RES) on hepatic ischemia reperfusion injury (HIRI) in rats and explore the underlying molecular mechanism. Methods Twenty male SD rats (aged 6 weeks, weighting 200±20 g) were randomly divided into 4 groups (n=5): sham operation group, HIRI group, RES pretreatment group, and RES pretreatment + inhibitor group. The rat model of 70% hot liver ischemia-reperfusion was established through ischemia for 1 h followed by reperfusion for 6 h. RES and Sirt1 inhibitors, EX527 were gave in the rats from the pretreatment group 1 h before the model infliction. Serum ALT activity and SOD activity in liver tissue were detected. The pathological changes of liver tissues were observed by HE staining. The apoptosis of hepatocytes were detected by TUNEL. The expression levels of Sirt1, acetylation p53 and Bax were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting. Results RES significantly reduced the increased ALT activity caused by HIRI (P < 0.01) and enhanced the activity of SOD (P < 0.01), alleviated the pathological changes of the liver tissues induced by HIRI (P < 0.01), and decreased the apoptosis of liver cells (P < 0.01). Moreover, RES obviously increased of the transcriptional levels of Sirt1 and Bax (P < 0.01), improved their protein levels (P < 0.01), but down-regulated the expression of acetylation p53 at protein level (P < 0.01). Conclusion RES attenuates the liver injury induced by ischemia reperfusion, which may be partially through activation of Sirt1-p53 signaling pathway.
[Key words] resveratrol     hepatic ischemia reperfusion injury     Sirt1-p53 signaling pathway    

肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusioninjury,HIRI)是一种复杂的病理生理过程,常出现在肝移植术和大范围肝切除等手术中以及休克或急性大量失血等不可控临床条件下[1-2]。HIRI是导致术后肝功能障碍或肝脏完全无功能的重要原因,严重影响患者的预后,甚至可能导致患者死亡[3]。发生HIRI的具体分子机制现在正处于积极的探究阶段,可能与氧化应激反应、细胞凋亡、炎症、钙通道超载等因素有关[4-5]。沉默信息调节蛋白1(silent information regulator protein 1,Sirt1) 是一种尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖的蛋白去乙酰化酶[6],可以使蛋白去乙酰化从而改变其活性,发挥多种生物学功能,如抗细胞衰老、抗细胞凋亡、抗氧化应激反应及细胞能量代谢等[7]。现有研究表明,Sirt1所具有的生物学特性可能与促凋亡蛋白p53去乙酰化有关[8]。白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种存在于虎杖、葡萄等植物中的天然多酚类化合物[9],也是迄今已发现的Sirt1最强激动剂[10],具有抗炎、抗癌和抗氧化损伤等生物学功效[11]。本研究拟通过建立大鼠肝脏70%热缺血再灌注模型,探讨RES对大鼠HIRI是否发挥保护作用,以及这种保护作用与Sirt1-p53信号通路之间的关系。

1 材料和方法 1.1 主要材料

1.1.1 实验试剂

RES(纯度>98%)、二甲亚砜(DMSO)试剂和Sirt1抑制剂(EX527) 购于美国Sigma公司;谷丙转氨酶(ALT)试剂盒及超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物公司;TUNEL试剂盒购自瑞士罗氏公司;Trizol试剂、PrimeScript RT Reagent Kit逆转录试剂盒及SYBPPremix Ex Taq试剂购于TAKARA-宝生物工程有限公司;RIPA裂解液、ECL发光液购于碧云天公司;小鼠抗大鼠sirt1抗体及兔抗大鼠乙酰化p53抗体购自美国abcam公司;兔抗大鼠Bax抗体购自北京中杉金桥公司;小鼠抗大鼠β-actin购自钟鼎生物公司;山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG购自无锡药明康德公司。

1.1.2 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠20只,体质量(200±20) g,购自重庆医科大学实验动物中心[许可证编号:SYXK(渝) 2012-0001;质量合格证编号:0002765]。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及建立动物模型

大鼠随机数字法分为4组(n=5):假手术组(SHAM)、缺血再灌注组(I/R)、RES预处理组(I/R+RES)、RES预处理+抑制剂组(I/R+RES+EX527)。根据ZHANG等[12]的研究建立大鼠70%肝脏缺血再灌注模:腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥麻醉大鼠,在上腹正中作长约4 cm切口进入腹腔,暴露肝脏并游离肝周韧带,使用无创血管夹夹闭肝左叶和肝中叶的肝动脉、胆管和门静脉分支。夹闭后肝叶颜色逐渐转变为暗红,提示缺血成功。血流阻断1 h后移去血管夹,恢复肝脏血供。肝脏恢复供血后6 h经下腔静脉收集血液标本及留取肝组织标本。SHAM组:进腹后仅暴露肝脏血管,不作结扎;I/R组:接受完整建模处理,建模前1 h经尾静脉注射等体积安慰剂(生理盐水);I/R+RES组:建模前1 h经尾静脉给予RES(20 mg/kg);I/R+RES+EX527组:RES给药同前,同时经尾静脉给药EX527 (20 μg/kg)。

1.2.2 检测ALT活力

将血液标本离心分离出血清(3 000 r/min),按照试剂盒说明书操作,检测血清中ALT活力。

1.2.3 检测SOD活性

将肝组织标本匀浆后离心,取上清液检测肝组织中SOD活性。按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 HE染色

10%多聚甲醛固定肝脏组织,常规脱水、浸蜡、石蜡包埋、5 μm切片,脱蜡透明后进行HE染色。每张组织切片随机选取3个视野,按照ANDERSON等[13]方法计算损伤比例:包含出血、核固缩、细胞边界消失、中性粒细胞浸润等其中任意一项则评定为肝组织损伤。

1.2.5 实时荧光定量PCR(qPCR)检测Sirt1、Bax mRNA表达

采用Trizol法提取各组肝脏组织总RNA,并用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。取合成的cDNA进行qPCR反应,以GAPDH为内参检测Sirt1和Bax mRNA的表达水平。Sirt1引物序列:上游5′-CACCGAGGAACTACCTGAT-3′,下游5′-CATCCCAGCCTCCGTTAT-3′;Bax引物序列:上游5′-AAGC-TGAGCGAGTGTCTCAAG-3′,下游5′-CAAAGTAGAAA-AGGGCGACAAC-3′;GAPDH引物序列:上游5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′,下游5′-ACAGCAACAG-GGTGGTGGAC-3′。引物均由上海生工生物公司合成。

1.2.6 Western blot检测Sirt1、乙酰化p53及Bax蛋白表达

提取肝组织总蛋白并检测蛋白浓度。每孔上样量为50 μg,经SDS-PAGE电泳(浓缩胶90 V、分离胶120 V)后转膜(PVDF膜,恒流250 mA),再经5%脱脂奶粉封闭1 h后,分别加入小鼠抗大鼠sirt1抗体(1 :1 000)、兔抗大鼠p53抗体(1 :500)、兔抗大鼠Bax抗体(1 :1 000),小鼠抗大鼠β-actin(1 :2 000),4 ℃孵育过夜。次日用TBST溶液充分洗膜后,加入羊抗小鼠IgG(1 :10 000)、山羊抗兔IgG(1 :10 000),并在室温条件下孵育1 h,然后加入ECL显色剂曝光显影,行灰度值扫描分析。

1.2.7 TUNEL法检测肝细胞凋亡

按照调往试剂盒说明书进行操作,光镜下观察凋亡细胞呈棕黄色。每张切片在400倍镜下随机选择3个视野进行观察,计数凋亡指数(AI),AI=凋亡细胞个数/细胞总数×100%。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析,数据用x±s表示,多样本均数比较采用单因素方差分析,其两两比较采用LSD-t法,检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 ALT活力检测

与SHAM组相比,I/R组ALT活力明显升高(P<0.01);与I/R组相比,I/R+RES组ALT活力显著下降(P<0.01)。加入阻断剂后,与I/R+RES组相比,I/R+ RES+EX527组ALT活力升高(P<0.01),见表 1

表 1 各组大鼠ALT和SOD活性比较(n=5,x±s)
组别 ALT(U/L) SOD(U/mg)
SHAM 51.34±14.38 125.14±16.16
I/R 1130.00±149.16a 56.40±5.36a
I/R+RES 789.52±74.53b 78.46±13.27b
I/R+RES+EX527 1221.39±163.86c 52.02±4.85c
  a:P<0.01,与SHAM比较;b:P<0.01,与I/R组比较;c:P<0.01,与I/R+RES比较

2.2 SOD活性检测

与SHAM组相比,I/R组SOD活性明显降低(P<0.01);与I/R组相比,I/R+RES组SOD活性显著上升(P<0.01)。加入阻断剂后,与I/R+RES组相比,I/R+ RES+EX527组SOD活性降低(P<0.01),见表 1

2.3 HE染色观察大鼠肝脏病理学改变

图 1A所示,SHAM组肝组织形态正常;与SHAM组(4.83±1.27)%相比,I/R组(56.95±5.94)%肝组织损伤严重(P<0.01),倒置相差镜下可见明显的核固缩、肝小叶结构破坏和大量炎症细胞浸润等(图 1B);与I/R组相比,I/R+RES组(36.23±3.49)%肝组织损伤明显减轻(P<0.01),核固缩、肝小叶结构破坏和严重细胞浸润等情况明显缓解(图 1C);加入抑制剂后,I/R+RES+EX527组(56.71±4.35)%肝组织损伤又较I/R+RES组严重(P<0.01) 肝小叶结构紊乱,部分组织可见肝细胞片状坏死(图 1D)。

A:SHAM组;B:I/R组;C:I/R+RES组;D:I/R+RES+EX527组 图 1 各组大鼠肝脏病理组织学改变(HE ×200)

2.4 实时荧光定量PCR检测结

Sirt1 mRNA表达:与SHAM组相比,I/R组肝组织sirt1 mRNA表达明显下降(P<0.01);与I/R组相比,I/R+RES组肝组织sirt1 mRNA表达显著提高(P<0.01);加入抑制剂后,I/R+RES+EX527组肝组织sirt1 mRNA表达较I/R+RES组下降(P<0.01)。Bax mRNA表达:与SHAM组相比,I/R组肝组织Bax mRNA表达明显上升(P<0.01);与I/R组相比,I/R+RES组肝组织Bax mRNA表达显著下降(P<0.01);加入抑制剂后,I/R+RES+EX527组肝组织Bax mRNA表达较I/R+RES组上升(P<0.01),见图 2

a:P<0.01,与SHAM比较;b:P<0. 01,与I/R组比较;c:P<0.01,与I/R+RES组比较 图 2 实时荧光定量PCR检测Sirt1和Bax mRNA表达(n=5,x±s)

2.5 Western blot检测

Sirt1蛋白表达:与SHAM组相比,I/R组肝组织sirt1蛋白表达明显下降(P<0.01);与I/R组相比,I/R+ RES组肝组织Sirt1蛋白表达显著提高(P<0.01);加入抑制剂后,I/R+RES+EX527组肝组织Sirt1蛋白表达较I/R+RES组下降(P<0.01)。乙酰化p53蛋白表达:与SHAM组相比,I/R组肝组织乙酰化p53蛋白表达明显上升(P<0.01);与I/R组相比,I/R+RES组肝组织乙酰化p53蛋白表达显著下降(P<0.01);加入抑制剂后,I/R+RES+EX527组肝组织乙酰化p53蛋白表达较I/R+RES组上升(P<0.01);Bax蛋白表达:与SHAM组相比,I/R组肝组织Bax蛋白表达明显下降(P<0.01);与I/R组相比,I/R+ RES组肝组织Bax蛋白表达显著提高(P<0.01);加入抑制剂后,I/R+RES+EX527组肝组织Bax蛋白表达较I/R+RES组下降(P<0.01),见图 3

A:Western blot检测结果1:SHAM组,2:I/R组,3:I/R+RES组,4:I/R+RES+EX527组 B:半定量分析(n=5,x±s) a:P<0.01,与SHAM组比较;b:P<0.01,与I/R组比较;c:P<0.01,与I/R+RES组比较 图 3 Western blot检测Sirt1、乙酰化p53及Bax蛋白表达

2.6 TUNEL检测

图 4所示,与SHAM组(5.05±1.08)%相比,I/R组肝细胞AI(35.92±4.31)%明显升高(P<0.01);与I/R组相比,I/R+RES组肝细胞AI(19.59± 3.05)%显著下降(P<0.01);加入抑制剂后,I/R+RES+EX527组肝细胞AI又较I/R+RES组(37.12±6.54)%明显升高(P<0.01)。

A:SHAM组;B:I/R组;C:I/R+RES组;D:I/R+RES+EX527组 图 4 各组大鼠肝组织细胞凋亡形态学观察(TUNEL ×400)

3 讨论

HIRI是肝胆外科手术中经常遇到的病理生理过程,严重影响手术疗效和患者预后。由于HIRI在肝脏相关复杂手术中几乎是不可避免的,所以探究其具体机制以及运用合适的方法来防治HIRI是肝胆外科医师亟待解决的问题。本研究发现:① RES能降低由I/R导致的大鼠ALT活力上升并提高SOD活性;② RES能缓解I/R造成的大鼠肝脏组织病理学改变;③ RES能增加肝组织Sirt1表达量,并减少乙酰化p53和Bax的表达;④ RES能减少肝组织细胞凋亡;⑤ 加入Sirt1抑制剂EX527后,RES对HIRI的保护作用显著下降。

ALT活力可以作为肝细胞损伤的指标,本研究发现,经过I/R处理的大鼠ALT活力明显提高,说明大鼠肝细胞损伤严重。但是RES能显著降低由I/R导致的大鼠ALT活力上升,说明RES对大鼠肝细胞产生保护作用。HE染色的结果也对这一推论提供直观的证据。SOD活性能反应氧化应激损伤程度。经过I/R处理的大鼠SOD活性明显降低,说明大鼠肝脏受到氧化应激损伤严重。但是RES能显著提高由I/R导致的大鼠SOD活性下降,说明RES能缓解I/R诱导的大鼠肝脏氧化应激损伤。

Sirt1能使控制能量代谢、细胞凋亡、细胞沉默的转录因子去乙酰化从而调节其活性。在Sirt1与p53蛋白的结合过程中,Sirt1使p53蛋白的第382位赖氨酸残基去乙酰化,降低p53的转录活性,进而减少促凋亡蛋白Bax的表达,从而抑制细胞凋亡[14]。RES是目前已发现的最强的Sirt1激动剂,已有多项研究表明,其生物学作用与激动Sirt1密切相关。本研究发现,I/R组肝组织Sirt1表达量较SHAM组显著减少。而经RES预处理后,I/R+RES组肝组织Sirt1表达量明显增多,同时乙酰化p53表达量减少,由p53启动转录的Bax表达量也减少。在加入Sirt1抑制剂EX527之后,RES对Sirt1、p53及Bax分子表达的影响被逆转。TUNEL实验结果也证实RES能减少由HIRI引起肝组织细胞凋亡,而加入EX527后,此保护作用被逆转。本研究多项实验结果都表明RES在I/R过程中对肝脏发挥的保护作用至少部分是通过激动Sirt1,进而使p53去乙酰化,从而减少肝细胞的凋亡实现的。

综上所述,RES至少部分通过激动Sirt1-p53通路,减少肝细胞凋亡从而保护肝脏。在后续的实验中,我们将继续探究这条通路的具体信号传导及其确切的作用机制。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612157
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

苟毅, 余天雾, 黄中荣, 张雷达.
GOU Yi, YU Tianwu, HUANG Zhongrong, ZHANG Leida.
白藜芦醇对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及其与Sirt1-p53通路的关系
Protective effect of resveratrol against hepatic ischemia reperfusion injury in rats and its relationship with Sirt1-p53 signaling pathway
第三军医大学学报, 2017, 39(13): 1366-1370
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(13): 1366-1370
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612157

文章历史

收稿: 2016-12-22
修回: 2017-03-22

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