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睾丸间质细胞Prl3c1过表达转基因小鼠建立与生物学功能初步研究
先艺, 李冲, 黎刚     
400016 重庆,重庆医科大学生命科学研究院
[摘要] 目的 建立睾丸prolactin family 3,subfamily c,member 1 (Prl3c1)过表达转基因(TG)小鼠,并对其功能进行初步研究。方法 设计引物扩增insulin like 3(Insl3)、Prl3c1Insl3PA片段,通过融合PCR,形成Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA片段,构建pPrl3c1转基因载体,测序验证。通过受精卵原核注射,建立TG小鼠。免疫荧光、Western blot方法鉴定转基因表达情况。采用ELISA方法检测3月龄TG小鼠与野生型对照(WT)小鼠睾酮基础水平;并测定5 U/10 g人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)刺激后,TG与WT小鼠睾酮水平(n=6)。结果 免疫荧光与Western blot检测结果表明转基因片段表达于TG小鼠睾丸间质细胞。TG小鼠睾丸形态学未见明显异常。此外,TG小鼠基础睾酮水平与WT小鼠差异无统计学意义[(2.61±0.34) ng/mL vs (2.51±0.35) ng/mL,P > 0.05],但在HCG刺激后,TG小鼠睾酮水平低于WT小鼠[(5.35±0.83) ng/mL vs (7.56±1.17) ng/mL,P < 0.01]。Western blot检测结果表明Prl3c1过表达减弱HCG刺激的STAR表达(P < 0.01)。结论 成功建立了Prl3c1 TG小鼠,体内功能研究显示Prl3c1参与睾酮产生。
[关键词] Prl3c1     过表达     睾酮     间质细胞    
Establishment and biological functions ofa transgenic mouse with Prl3c1 over-expression in testicular Leydig cells
XIAN Yi , LI Chong , LI Gang     
Institute of Life Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (30901062)
Corresponding author: LI Gang, E-mail: lg168sn@sina.com
[Abstract] Objective To generate prolactin family 3, subfamily c, member 1 (Prl3c1) transgenic (TG) mice and investigate its function during male reproduction. Methods The transgenic construct (Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA) was generated by in-fusion PCR with designed primers to amplify the fragments of insulin like 3 (Insl3), Prl3c1 and Insl3PA, respectively. After being sequenced, the pPrl3c1 transgenic constructs were microinjected into the pronuclei of fertilized oocytes from mice. The founder (F0) TG mice were screened by PCR. Western blotting and immunofluorescence assay were performed to detect the expression of transgenic construct in the testis. Additionally, basic and 5 U/10 g human chorionic gonadotropin (HCG)-stimulated testosterone levels of the TG and wild type (WT) mice (6 animals in each group) were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Western blotting and immunofluorescence staining showed that the Prl3c1 transgenic construct was expressed in the Leydig cells. The testes of TG mice were morphologically normal in appearance. There was no difference in serum testosterone levels between TG mice and WT mice (2.61±0.34 vs 2.51±0.35 ng/mL, P > 0.05). However, HCG stimulation caused testosterone production lowered in TG mice compared with WT mice (5.35± 0.83 vs 7.56±1.17 ng/mL, P < 0.01). Further, Western blotting indicated that Prl3c1 over-expression caused a decrease in HCG-stimulated STAR expression in TG mice (P < 0.01). Conclusion Prl3c1 TG mice are successfully established. Additionally, Prl3c1 may be involved in testosterone production.
[Key words] Prl3c1     over-expression     testosterone     Leydig cells    

泌乳素(prolactin,Prl)家族成员众多,可调节众多生物学进程[1-2]。目前发现小鼠Prl基因家族至少包含23个已经明确的基因,包括Prl2a1Prl2b1Prl2c2Prl3c1Prl3d1Prl8a8等。这些基因主要表达于脑垂体、子宫和/或胎盘中。研究表明,Prl家族成员在胎盘中表达存在时空表达特异性,参与控制妊娠期母胎适应性,在妊娠中发挥着重要的作用[3]

Prl3c1是Prl家族成员之一。Prl3c1又名Plp-jPrlpjPrlpi,由TOFT等[4]于1999年研究发现。与Prl多数其他家族成员不一样的是,Prl3c1主要由胚胎植入位点的蜕膜细胞表达,而非滋养层细胞。小鼠Prl3c1 mRNA表达始于妊娠早期,第7天出现高表达,第9天表达开始下降,到第11天时表达不能检测出来。Prl3c1可促进子宫基质细胞生长,但对内皮细胞生长起抑制效应,可能调控蜕膜细胞和子宫内膜血管发育[5]。PRL family 8,subfamily a,member 2 (Prl8a2)可调节蜕膜Prl3c1表达:在Prl8a2基因敲除小鼠,Prl3c1表达水平明显下降。这些研究表明Prl3c1对妊娠维持发挥重要作用。

本课题组发现Prl3c1也表达于睾丸[6]。原位杂交、免疫组化及免疫荧光方法显示Prl3c1表达于小鼠睾丸间质细胞,亚细胞定位于细胞质。Prl3c1 mRNA和蛋白表达水平在18 d组最低,成年组最高,老年组次之。鉴于其表达水平与体内睾酮水平随年龄变化趋势一致,推测其体内功能可能与间质细胞功能有关。因此本研究拟制备Prl3c1过表达TG小鼠,并初步研究其功能。

1 材料与方法 1.1 材料

2月龄C57BL /6 WT小鼠(16只,雌雄各半)购于重庆医科大学实验动物中心(SYXK2012-0001),用于Prl3c1 TG小鼠制备、繁殖及作为对照小鼠。自由饮水和采食,所有操作均符合伦理学要求。抗PRL3C1多克隆抗体自己制备[6]。蛋白提取Kit,Beyo ECL Plus Western blot检测Kit购自碧云天公司。睾酮ELISA检测试剂盒购于USCN公司。

1.2 Prl3c1转基因载体构建

设计引物(表 1)扩增Insl3Prl3c1Insl3PA片段,通过融合引物,扩增融合片段Insl3-FlagFlag-Prl3c1Insl3PA (poly A序列),形成Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA片段。Insl3PA后面通过引物引入AflⅡ及MfeⅠ位点。以pcDNA3.1质粒为模板,设计引物扩增EGFP片段(含启动子CMV及poly A),EGFP前后两端引入AflⅡ及MfeⅠ位点。将Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA片段连接到pEASY-Blunt上,形成pEASY-Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA;将EGFP连接到18-T simple载体上,形成18-T-EGFP。MfeⅠ及AflⅡ双酶切pEASY-Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA和18-T-EGFP,回收目的片段,以pEASY-Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA形成骨架载体,形成最终转基因载体pPrl3c1(图 1)。

表 1 PCR扩增引物片段大小
扩增片段 引物名称 引物序列 片段大小
Insl3 Insl3-Flag-上游 5′-GTCGACTGGTTTGTGACTGGAGTTGGGGGTGTAGA-3′ 732 bp
Insl3-Flag-下游 5′-TGATAGCTGCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGCAGGAGGCA-3′
Prl3c1 Flag-Prl3c1-上游 5′-CATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGCAGCTATCATTGACTCAAGCAC-3′ 689 bp
Flag-Prl3c1-下游 5′-AGGACGCACCGCCTGAGCCCTGTGCCCCTTTAGCAAATGGTTTTGATTTT-3′
Insl3PA Prl3c1-Insl3PA-上游 5′-CCATTTGCTAAAGGGGCACAGGGCTCAGGCGGTGCGTCC-3′ 245 bp
Prl3c1-Insl3PA-下游 5′-CAATTGACCGGTCTTAAGTATGAAGTTGCTTTTTTATTTAGAC-3′
EGFP EGFP-上游 5′-CAATTGGTTGACATTGATTATTG-3′ 1681 bp
EGFP-下游 5′-CTTAAGCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAG-3′

图 1 构建的pPrl3c1转基因载体示意图谱

1.3 受精卵原核注射

线性化转基因载体浓度调整至5 ng/μL,显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中,将注射完毕的受精卵移植入代孕母鼠体内,在代孕周期结束后成功分娩获得F0代首建鼠。

1.4 PCR鉴定Prl3c1 TG小鼠

TG小鼠在出生14 d后剪尾端组织,提取基因组DNA,用PCR法对TG小鼠进行基因型鉴定。PCR上游引物为:5′-TGGTTTGTGACTGGAGTTGGGGGTGTAGAA-3′,下游引物为Prl3c1-Insl3PA-R。反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,共35个循环。随后以琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定,Prl3c1阳性小鼠引物产生片段大小为1.5×103 bp。阳性小鼠用于繁殖。

1.5 免疫荧光

睾丸组织切片(5 μm)经脱蜡、梯度酒精脱水后,进行抗原修复,用0.01 mol/L PBST漂洗3次,山羊血清室温封闭30 min。与兔抗FLAG抗体(1 :100) 和羊抗HSD3B(1 :100) 孵育后,用PBS洗涤,与TRITC标记抗兔IgG和FITC标记抗羊IgG孵育1 h,荧光显微镜下观察。

1.6 HE染色

将小鼠睾丸置于10%多聚甲醛液中固定,在梯度酒精脱水后石蜡包埋并切片(5 μm)用于HE染色,观察形态变化,并测量睾丸生精小管直径与周长。

1.7 睾酮测定

取饲养至3月龄TG小鼠与WT小鼠,测定血清基础睾酮水平;并测定腹腔注射5 U/10 g HCG刺激6 h后,TG小鼠(TG+HCG组)与WT小鼠(WT+HCG组)睾酮水平(n=6)。睾酮测定按照产品说明书。

1.8 Western blot

取0.1 g睾丸组织,用蛋白质提取试剂盒提取培养细胞的总蛋白,用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白含量。50 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移至PVDF膜,10%脱脂奶粉封闭后,依次与一抗(抗Prl3c1抗体、抗FLAG抗体、抗STAR或抗CYP11A1)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗于37 ℃孵育1 h,BeyoECL Plus化学发光试剂显色,检测。

1.9 统计学分析

数据采用x±s表示,不同组别数据比较采用单因素方差分析进行均值多重比较。

2 结果 2.1 Prl3c1转基因载体的构建及鉴定

Prl3c1编码序列插入睾丸特异表达的Insl3基因启动子的下游,成功构建Prl3c1转基因载体(图 2)。小鼠出生14 d后对F0代小鼠剪尾端鉴定基因型与测序证明,最终得到3只阳性F0小鼠(图 3),用于繁殖。后续实验表明基于3只阳性F0小鼠繁殖产生子代的Prl3c1转基因表达与生殖表型及功能差异无统计学意义。

M:200 bp标准,1~10:10个菌液单克隆 图 2 转基因片段Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA PCR鉴定

1~9:9只原代F0小鼠PCR结果;P:阳性质粒对照;N:阴性对照 图 3 TG小鼠PCR分型(A)与测序验证(B)

2.2 免疫荧光鉴定Prl3c1转基因构建体在睾丸间质细胞中的表达

为了验证外源转基因是否在睾丸中特异表达于间质细胞,通过抗FLAG标签抗体免疫荧光检测,我们发现FLAG标记蛋白(FLAG-PRL3C1) 与间质细胞特异基因HSD3B共定位于间质细胞,说明Prl3C1转基因成功表达于小鼠睾丸间质细胞(图 4)。通过Western blot检测分析PRL3C1与FLAG-PRL3C1蛋白,可观察到TG小鼠总的PRL3C1表达量较WT小鼠明显增加(P<0.01),FLAG-PRL3C1可在TG小鼠检测到,而WT小鼠无表达(图 5),进一步证实TG小鼠的成功构建。其他重要组织器官,如心脏、肾脏、附睾、肺等均未检测到FLAG-PRL3C1表达。

A:TG小鼠睾丸抗FLAG荧光染色;B:TG小鼠睾丸抗HSD3B荧光染色;C:TG小鼠睾丸DAPI染核(A、B图融合);D:WT小鼠睾丸抗FLAG、抗HSD3B荧光染色与DAPI染核融合图像 图 4 免疫荧光实验分析Prl3c1转基因载体在Prl3c1 TG与WT小鼠睾丸中表达情况

1: WT小鼠; 2: Prl3c1 TG小鼠 图 5 Western blot检测Prl3c1转基因载体在WT小鼠与Prl3c1 TG小鼠睾丸中表达情况

2.3 HE染色观察结果

睾丸切片HE染色显示,3月龄Prl3c1 TG小鼠与WT小鼠的生精小管均边界完整,各级生精细胞排列紧密有序,间质区丰富,未见明显的组织病变特征差异(图 6)。测定睾丸生精小管直径与周长,WT小鼠为(178.0±14.9)μm与(573.0±37.9)μm,Prl3c1 TG小鼠为(172.3±13.6)μm与(560.5±27.9)μm,差异无统计学意义。

图 6 WT小鼠(A)与Prl3c1 TG小鼠(B)睾丸组织病理学变化 (HE ×200)

2.4 上调Prl3c1基因不影响睾酮基础水平,但减弱HCG诱导的睾酮产生

WT组小鼠(2.61±0.34) 与Prl3c1 TG组小鼠(2.51±0.35) 基础睾酮水平差异无统计学意义(P>0.05);而在HCG刺激后,WT小鼠与TG小鼠睾酮水平均明显增加,但WT小鼠睾酮增加幅度明显高于TG小鼠,二者差异具有统计学意义[(7.56±1.17)vs(5.35±0.83),P<0.01],表明Prl3c1与睾酮产生有关。

2.5 Prl3c1过表达抑制HCG诱导的STAR表达上调

Western blot检测结果(图 7)显示WT组与TG组小鼠在HCG刺激后,与各自对照组比较,STAR均明显上调(P<0.01),但WT+HCG组增加更明显,与TG+HCG组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。而CYP11A在WT组与TG组经HCG刺激后均无明显改变。

A:Western blot检测结果1: WT组,2: TG组,3: WT+HCG组,4: TG+HCG组; B:STAR与CYP11A1蛋白表达半定量分析(n=6,x±s) a:P<0.01,与WT组比较;b:P<0.01,与TG组比较;c:P<0.01,与WT+HCG组比较 图 7 Western blot检测STAR与CYP11A1在小鼠睾丸中表达

3 讨论

我们发现Prl3c1基因表达于雄性睾丸间质细胞,其在睾丸中生物学意义未明。为了研究其体内功能,我们制备了Prl3c1转基因载体,显微受精卵原核注射后获得了Prl3c1 TG小鼠。

Insl3基因在雄性特异表达于睾丸间质细胞[7]。SHIRNESHAN等[8]报道发现Insl3基因启动子可有效介导外源insulin基因表达于小鼠睾丸间质细胞。因此,我们利用Insl3基因启动子介导Prl3c1表达。此外,为便于区分鉴定外源转基因表达的PRL3C1与睾丸自身表达PRL3C1蛋白,在转基因载体Prl3c1基因片段前加入了Flag标签序列,可以利用抗FLAG标签抗体检测。免疫荧光检测发现转基因表达的FLAG-PRL3C1与睾丸间质细胞特异基因HSD3B共定位于间质细胞,生精小管中的支持细胞与生精细胞均无阳性染色,说明Insl3基因启动子可介导Prl3c1在睾丸间质细胞中的特异表达。进一步通过Western blot检测蛋白的表达情况,TG小鼠可检测到FLAG-PRL3C1表达,而WT小鼠不能检测到,且总PRL3C1表达水平显著高于WT小鼠,条带大小与预期一致,提示构建的转基因载体在小鼠睾丸间质细胞有效的表达。

成年雄性动物睾酮主要来源于睾丸间质细胞。睾丸睾酮主要活性是参与到性功能维持、启动生精功能,促进精子发生与成熟等[9]。因而,间质细胞对机体的效应主要体现在睾酮产生量。睾酮产生受到间质细胞自分泌、旁分泌因素的精细调控。睾丸支持细胞、各级生精细胞表达、产生的各种细胞因子、激素等主要以旁分泌途径调控睾酮产生;而特异或非特异表达于间质细胞的基因,包括细胞因子、生长因子、参与睾酮合成的各种酶等形成自分泌调控网络[10-12]。多种因素,包括衰老、化学毒物则可能通过损伤某些基因表达水平或功能,破坏自分泌、旁分泌因素的精细调控平衡网络,从而抑制睾酮产生[13-14]

Prl3c1表达水平从出生后到成年期间呈现增加趋势,而此后表达下调,其是否属于睾酮调控网络成员之一而参与睾酮产生呢?我们在建立的Prl3c1 TG小鼠基础上,首先测定了3月龄小鼠睾酮水平。结果表明Prl3c1过表达不影响睾酮基础水平。黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体(luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor,LHCGR)表达于睾丸间质细胞,HCG可以通过结合到LHCGR,刺激下游信号通路,促进间质细胞产生睾酮[15]。为了研究PRl3c1过表达是否影响间质细胞睾酮产生潜能,通过HCG刺激后,我们发现PRl3c1 TG小鼠睾酮增加水平不及WT小鼠,提示Prl3c1过表达减弱睾酮产生刺激效应,间接参与睾酮水平维持。

类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,STAR)把细胞内储存胆固醇转运到线粒体的内膜,是细胞内胆固醇快速转运的调节因子,在类固醇激素合成过程中发挥限速步骤的作用。胆固醇转化为孕烯醇酮,是类固醇激素合成第一步,由位于线粒体内膜的细胞色素P450家族成员11A1 (cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1,CYP11A1) 催化[16]。为进一步研究Prl3c1过表达减弱HCG刺激睾酮产生效应机制,我们通过Western blot检测结果显示,HCG刺激6 h后对CYP11A1未见明显影响,而WT与TG小鼠STAR表达均明显上调,但WT小鼠增加幅度显著高于TG小鼠,表明Prl3c1减弱HCG刺激的STAR增加。

综上,本研究成功制备Prl3c1 TG小鼠,为进一步深入研究Prl3c1基因奠定了基础。体内功能研究显示,Prl3c1过表达可减弱HCG刺激的STAR蛋白表达,从而减少睾酮产生,提示Prl3c1间接调控睾丸间质细胞睾酮产生。结合睾酮产生量与Prl3c1表达量呈现同向变化的现象,我们推测Prl3c1可能参与维持睾酮稳态。进一步深入揭示Prl3c1基因在雄性生殖中的效应对延缓衰老、防治外源化学物损伤睾丸生殖功能具有研究价值。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612144
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文章信息

先艺, 李冲, 黎刚.
XIAN Yi, LI Chong, LI Gang.
睾丸间质细胞Prl3c1过表达转基因小鼠建立与生物学功能初步研究
Establishment and biological functions ofa transgenic mouse with Prl3c1 over-expression in testicular Leydig cells
第三军医大学学报, 2017, 39(15): 1556-1561
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(15): 1556-1561
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612144

文章历史

收稿: 2016-12-20
修回: 2017-03-20

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