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IL-17A抑制Th2细胞分化减轻哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症
王熠杰, 赵生涛, 杨旭, 王冉, 郭东霖, 蒋云秋, 王长征     
400037 重庆,第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所,全军呼吸病研究重点实验室
[摘要] 目的 研究IL-17A对哮喘小鼠Th2细胞分化及其相关炎症的作用。 方法 24只C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为对照组、哮喘组和IL-17A处理组(n = 8)。哮喘组和IL-17A处理组予以卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏及激发。每次雾化激发前1 h,IL-17A处理组给予重组小鼠IL-17A气道滴入。各步对照均予以生理盐水。末次激发后24 h处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)行细胞总数及分类计数。ELISA检测BALF中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-17A的浓度。HE和PAS染色及半定量评分评估小鼠肺部病理变化。流式细胞术检测脾脏和支气管淋巴结Th细胞分化。免疫磁珠分选健康小鼠幼稚CD4 + T细胞,用Th2极化培养基体外培养,并给予IL-17A或等量PBS干预,检测Th2细胞的增殖、凋亡和分化。 结果 哮喘组较对照组,BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数及其比例(P<0.05)、IL-4、IL-5、IL-17A浓度均显著增高(P<0.05),IFN-γ浓度显著下降(P<0.05);支气管、血管周围炎症细胞浸润和杯状细胞化生明显加重(P<0.01);脾脏和淋巴结Th2细胞分化比例显著增高(P<0.05)。IL-17A处理组较哮喘组,BALF中的细胞总数[(26.00 ± 5.43)× 104/mL vs(58.40 ± 26.93)× 104 /mL,P<0.05]、嗜酸性粒细胞数[(8.04 ± 1.98)× 104/mL vs(31.95 ± 12.28)× 104 /mL,P<0.05]及其比例[(29.93 ± 3.03)% vs(53.47 ± 6.62)%,P<0.01]显著降低,而中性粒细胞数及其比例无明显变化;BALF中Th2相关因子IL-4浓度[(9.86 ±2.77)pg/mL vs(28.13 ± 4.62)pg/mL,P<0.01]、IL-5浓度[(7. 30 ± 0. 50)pg/mL vs(10.50 ± 1.10)pg/mL,P<0.01]均显著降低;支气管、血管周围炎症细胞浸润减轻,HE染色半定量评分降低[(2.00 ± 0.51)vs(3.12 ± 0.64),P<0.05],杯状细胞化生减少[(0.80 ± 0.45)vs(2.40 ± 0.55),P<0.01];脾脏[(2.24 ± 0.44)% vs(4.82 ± 1.83)%,P<0.01]和淋巴结[(7.05 ± 0.58)% vs(10.57 ± 1.35)%,P<0.05]中Th2细胞分化比例显著减少。极化培养的幼稚CD4+T细胞,予IL-17A干预后,诱导分化的Th2细胞比例显著减少(P<0.05),而增殖和凋亡无显著变化。 结论 IL-17A有抑制Th2细胞分化,减轻哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症的作用。
[关键词] 支气管哮喘     嗜酸性粒细胞     白介素-17A     Th2细胞    
IL-17A inhibits Th2 cell differentiation and alleviates eosinophilic airway inflammation in a mouse model of asthma-
Wang Yijie , Zhao Shengtao , Yang Xu , Wang Ran , Guo Donglin , Jiang Yunqiu , Wang Changzheng     
Institute of Respiratory Diseases, Key Laboratory of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81270075)
Corresponding author: Wang Changzheng, E-mail: czwang@netease.com
[Abstract] Objective To investigate the effect of IL-17A on the differentiation of Th2 cells and airway inflammation in a mouse model of asthma. Methods Twenty-four C57BL/6J mice were randomly divided into control group, asthmatic group and IL-17A treatment group. The mice in asthmatic group and IL-17A treatment group were sensitized and challenged with ovalbumin (OVA), and in the latter group, the mice received intratracheal instillation of IL-17A 1 h before each OVA challenge; normal saline was used for all the control treatments. The mice were sacrificed 24 h after the last challenge, and the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were collected for cytological examination and detection of IL-4, IL-5, IL-17A, and interferon-γ (IFN-γ) using ELISA. The lung pathologies were assessed semi-quantitatively using HE and PAS staining. The differentiation of Th cells in the spleen and tracheobronchial lymph nodes were analyzed with flow cytometry. The effects of IL-17A on cell proliferation, apoptosis, and differentiation were examined in naive CD4+T cells sorted by immunomagnetic beads from normal mice. Results Compared with the control mice, the asthmatic mice showed significantly increased total cell and eosinophil counts and eosinophil percentage (P < 0.05), elevated IL-4, IL-5, and IL-17A concentrations (P < 0.05), and lowered IFN-γ concentration in the BALF (P < 0.05). The asthmatic mice presented with more obvious inflammatory cell infiltration (P < 0.01) and goblet cell hyperplasia (P < 0.05) and significantly increased proportion of Th2 cells in the spleen and lymph nodes (P < 0.05). IL-17A treatment of the asthmatic mice significantly reduced the total cell number [(26.00 ± 5.43) × 104 /mL vs (58.40 ± 26.93) × 104 /mL, P < 0.05], eosinophil count [(8.04 ± 1.98) × 104 /mL vs (31.95 ± 12.28) × 104 /mL, P < 0.05] and eosinophil percentage [(29. 93 ± 3. 03)% vs (53.47 ± 6.62)%, P < 0.01] in the BALF without affecting neutrophil count or percentage. IL-17A treatment also resulted in lowered levels of IL-4 (9.86 ± 2.77 pg/mL vs 28.13 ± 4.62 pg/mL, P < 0.01) and IL-5 (7.30 ± 0.50 pg/mL vs 10.50 ± 1.10 pg/mL, P < 0.01) in the BALF, alleviated inflammatory cell infiltration (2. 00 ± 0.51 vs 3.12 ± 0.64, P < 0.05) and goblet cell hyperplasia (0.80 ± 0.45 vs 2. 40 ± 0.55, P < 0.01), and reduced the percentages of Th2 cells in the spleen [(2.24 ± 0.44)% vs (4.82 ± 1.83)%, P < 0.01] and lymph nodes [(7.05 ± 0.58)% vs (10.57 ± 1.35)%, P < 0.05 ]. In naive CD4+T cells from normal mice, IL-17A treatment obviously inhibited cell differentiation into Th2 cells in vitro [(4.15 ± 0.55)% vs (2.53 ± 0.47)%, P < 0.05 ] without affecting the cell proliferation or apoptosis. Conclusion IL-17A can inhibit the differentiation of Th2 cells and alleviate eosinophilic airway inflammation in mice.
[Key words] asthma     eosinophils     interleukin-17A     Th2 cells    

支气管哮喘是一种具有异质性的慢性气道炎症性疾患,其病理生理特征是慢性气道炎症、气道高反应、气道黏液高分泌等。Th2型免疫应答过度增强是哮喘慢性气道炎症的关键机制之一[1]。过度活化的Th2细胞及其产生的IL-4、IL-5等细胞因子在哮喘气道嗜酸性粒细胞炎症的发生、发展中起着关键的作用[2]。近年也发现IL-17A可能参与哮喘慢性气道炎症的发生、发展。在哮喘患者的支气管肺泡灌洗液(bronch-oalveolar lavage fluid,BALF)、诱导痰及肺组织中均发现有IL-17水平升高[3],但IL-17在哮喘中起到的作用尚未阐明[4]。在哮喘小鼠模型中,发现气道给予IL-17A能降低气道嗜酸粒细胞数[5],而过继产IL-17A的γδT细胞后,小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症得到改善[6]。本课题组既往发现IL-17A敲除后,OVA和脂多糖构建的中性粒细胞性哮喘小鼠出现Th2细胞分化增高和气道嗜酸性粒细胞炎症加重[7]。因此,我们假设IL-17A能直接抑制Th2细胞的分化,改善哮喘气道嗜酸性粒细胞炎症。

本研究通过给予外源性的IL-17A处理,观察对哮喘小鼠气道中嗜酸性粒细胞炎症的影响,并探讨IL-17A在体内外对Th2细胞分化的作用,旨在揭示IL-17对哮喘Th2分化的调节作用,为支气管哮喘防治提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 材料

6~8周龄清洁级雌性C57BL/6J小鼠24只,体质量16~22 g,由第三军医大学新桥医院实验动物中心提供,来源于北京华阜康生物科技股份有限公司,SCXK(京)2014-0004。卵清蛋白(OVA,美国Sigma公司),氢氧化铝混悬液(Imject Alum,美国Thermo Fisher公司),雾化器(型号ss-7B,江苏双盛医疗器械公司),胎牛血清(美国Gibco公司),重组小鼠IL-17A、IL-2、IL-4(美国PeproTech公司),Wright-Giemsa染液(珠海贝索公司),IL-4、IL-5、IL-17A、IFN-γ ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司),红细胞裂解液(Biosharp公司),RPMI1640培养基(美国HyClone公司),细胞活化刺激剂(cell activation cocktail with BFA,美国Biolegend公司),FACS Verse流式细胞仪、流式细胞抗体(FITC-抗IFN-γ,PE-抗IL-4,Percp-Cy5.5-抗CD4,AF647-抗IL-17A)、FITC-Annexin V凋亡试剂盒均购自美国BD公司,幼稚CD4+T细胞分选磁珠(naive CD4+ T cell isolation kit,德国Miltenyi Biotec公司),抗CD3e抗体、抗CD28抗体、抗IFN-γ抗体(美国eBioscience公司),CCK-8增殖检测试剂盒(同仁化学)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与模型建立

24只小鼠按随机数字表法分为3组(n=8):对照组、哮喘组、IL-17A处理组。哮喘组和IL-17A处理组于建模第1、7天腹腔注射致敏液200 μL(氢氧化铝混悬液100 μL+1 μg/μL OVA 100 μL),于第14~18天以1% OVA连续雾化激发,每次1 h,对照组予以等量的生理盐水致敏和激发[7];每次雾化激发前1 h,IL-17A处理组小鼠在用1%戊巴比妥钠5 μL/g麻醉后给予20 μL重组小鼠IL-17A(含IL-17A 100 ng)气道滴入[8],哮喘组小鼠和对照组小鼠予以等量的生理盐水滴入。

1.2.2 BALF细胞分类计数和细胞因子检测

末次雾化激发小鼠24 h以后,注射200 μL的1%戊巴比妥钠入腹腔,麻醉处死小鼠,行支气管肺泡灌洗[7],解剖暴露气管,用规格为24G的静脉留置针气管插管,注入1 mL预冷生理盐水灌洗,共3次,灌洗液计细胞总数,离心后收集BALF上清,-80 ℃冰箱冻存。离心后细胞沉淀以100 μL生理盐水重悬后涂片,行Wright-Giemsa染色[7],显微镜下计数300个细胞行分类计数。ELISA试剂盒检测BALF上清液中IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-17A浓度,按说明书操作。

1.2.3 肺组织病理染色和分析

摘取小鼠左肺浸于4%多聚甲醛中,经过固定、脱水、石蜡包埋后,制备5 μm厚肺组织切片,行HE和PAS染色,显微镜下观测并进行半定量评分[9]。肺组织HE染色后对支气管、血管周围炎症评分如下:0分,正常;1分,支气管、血管周围少量炎症细胞浸润;2分,支气管周围、血管被1层炎症细胞浸润;3分,支气管、血管周围被2~4层炎症细胞浸润;4分,支气管、血管周围被4层以上炎症细胞浸润。黏液分泌程度根据气道PAS阳性细胞比例进行半定量评分:0分,<5%;1分,5%~<25%;2分,25%~<50%;3分,50%~<75%;4分,≥75%。

1.2.4 脾脏和支气管淋巴结Th细胞分化

小鼠支气管淋巴结和脾脏经70 μm滤网研磨,过滤后得单细胞悬液,利用红细胞裂解液处理5 min,除尽细胞悬液中的红细胞[7]。细胞经洗涤后用10%胎牛血清的1640培养基重悬细胞浓度为106/mL,种在24孔板中,每孔1 mL。每孔加入2 μL细胞活化刺激剂,置于37 ℃,5% CO2的孵箱中培养5 h后,行Th细胞相应的流式抗体染色标记并检测[7]。结果使用Flowjo7.6软件分析,Th细胞分化比例为在CD4+T细胞群中,Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)和Th17(CD4+IL-17A+)所占百分比。

1.2.5 磁珠分选幼稚CD4+T细胞及诱导Th2分化培养

取6~8周健康雌性C57BL/6J小鼠脾脏制备单细胞悬液,按照幼稚CD4+T细胞分选磁珠说明书分选,得到纯化CD4+CD25- CD44lowCD62Lhigh T细胞。分选后的CD4+T细胞比例在95%左右。24孔培养板经0.5 mL含1 μg/mL抗CD3e和抗CD28抗体的PBS于4 ℃孵育过夜包被后用于极化培养[10]。用极化培养基重悬分选后的细胞,调整浓度为4×105/mL接种于包被后的24孔板中,每孔1 mL,于37 ℃,5% CO2的孵箱中培养24~96 h。极化培养基组成:10%胎牛血清,2% 100 μg/mL青霉素/链霉素,0.1% 55 μmol/L β-巯基乙醇,1%非必需氨基酸混合制剂,86.9% RPMI1640培养基;添加Th2极化因子为:10 ng/mL重组小鼠IL-2,5 μg/mL抗IFN-γ抗体,2 μg/mL抗CD28抗体,20 ng/mL重组小鼠IL-4。根据种板时是否添加30 ng IL-17A因子分为Th2极化组和Th2+IL-17A极化组。培养48 h后收集细胞用不添加Th2极化因子的培养基重新调细胞浓度至4×105/mL,每孔1 mL接种于未包被的24孔板中,每孔加入10 ng/mL IL-2,继续培养至96 h。流式细胞术检测24、96 h时Th2细胞分化和24 h两组细胞凋亡率(Annexin V+ PI-细胞百分比);在96孔板中培养24 h后检测450 nm处光密度值,比较两组细胞增殖活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,数据以x±s形式表示,两组之间数据比较使用独立样本t检验,两组以上数据比较使用单因素方差分析。

2 结果 2.1 各组小鼠BALF细胞总数和各类细胞计数及比例

哮喘组较对照组,BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞数及其比例增高(P < 0.05);IL-17A处理后,细胞总数和嗜酸性粒细胞数及其比例均较哮喘组减少(P < 0.05),但嗜酸性粒细胞数及其比例较对照组仍有增高(P < 0.05,图 12),中性粒细胞数及其比例与哮喘组比较差异无统计学意义。

a:P < 0.05,与对照组比较;b:P < 0.05,与哮喘组比较 图 1 各组小鼠BALF中的细胞总数及各类细胞计数比较(n=8,x±s)

a:P < 0.01,与对照组比较;b:P < 0.01,与哮喘组比较 图 2 各组小鼠BALF中的各类细胞比例比较(n=8,x±s)

2.2 各组小鼠炎症细胞浸润程度比较

对照组小鼠肺组织无显著的炎症细胞浸润;哮喘组较对照组小鼠具有更严重的肺部病理改变(图 3),支气管和血管周围有大量炎症细胞浸润,炎症评分增高[(3.12 ± 0.64)vs(0.44 ± 0.26),P<0.01 ];IL-17A处理后,支气管和血管周围炎症细胞浸润程度减轻,炎症评分较哮喘组明显降低[(2.00 ± 0.51)vs (3.12±0.64),P < 0.05],但较对照组仍有增高(P < 0.01)。

A:对照组;B:哮喘组;C:IL-17A处理组 图 3 各组小鼠肺部支气管和血管周围炎症改变 (HE ×200)

2.3 各组小鼠杯状细胞化生程度比较

对照组小鼠肺部未见明显杯状细胞化生;哮喘组较对照组小鼠有明显的杯状细胞化生(图 4);IL-17A处理后,小鼠气道中杯状细胞化生程度较哮喘组降低[(0.80 ± 0.45)vs(2.40 ± 0.55),P<0.01 ]。

A:对照组;B:哮喘组;C:IL-17A处理组 图 4 各组小鼠肺组织病理学变化(PAS ×200)

2.4 各组小鼠BALF中细胞因子比较

哮喘组较对照组,小鼠BALF中Th2型因子IL-4、IL-5浓度升高(P < 0.05),Th1型细胞因子IFN-γ浓度降低(P < 0.05),IL-17A浓度增高(P < 0.05);IL-17A处理后,小鼠BALF中IL-4、IL-5浓度均明显降低(P < 0.01),IL-17A浓度增高(P < 0.01,图 5),IFN-γ浓度无明显变化。

A:IL-4;B:IL-5;C:IFN-γ;D:IL-17A a: P < 0.05,与对照组比较;b: P < 0.01,与哮喘组比较 图 5 各组小鼠BALF中细胞因子浓度比较(n=8,x±s)

2.5 各组小鼠支气管淋巴结Th细胞分化

哮喘组较对照组,小鼠支气管淋巴结的Th2细胞比例增高[(10.57 ± 1.35)% vs(5.74 ± 0.29)%,P < 0.05],Th1细胞比例降低[(0.55 ± 0.17)% vs(1.02 ±0.19)%,P < 0.05];IL-17A处理后,Th2细胞比例较哮喘组降低[(7.05 ± 0.58)% vs(10.57 ± 1.35)%,P<0.05],但仍较对照组增高(P < 0.05),Th1细胞比例较哮喘组无明显变化,但仍较对照组降低[(0.51 ±0.13)% vs (1.02±0.19)%,P < 0.05]。各组之间Th17细胞比例差异无统计学意义。

2.6 各组小鼠脾脏Th细胞分化

哮喘组较对照组,小鼠脾脏Th2细胞比例增高[(4.82 ± 1.83)% vs(1.58 ± 0.13)%,P<0.01 ],Th1细胞比例降低[(4.27 ± 0.55)% vs(6.20 ±0.76)%,P<0.01];IL-17A处理后,脾脏Th2细胞比例较哮喘组显著降低[(2.24 ± 0.44)% vs(4.82 ± 1.83)%,P<0.01],Th1细胞比例较哮喘组无明显变化,但Th1细胞比例较对照组仍有降低[(3.62 ± 0.81)% vs(6.20 ± 0.76)%,P<0.01]。各组间Th17细胞比例差异无统计学意义。

2.7 IL-17A在体外诱导Th2细胞分化中的作用

相比于Th2极化组,Th2+IL-17A极化组培养24 h时Th2细胞分化比例出现下降趋势(P > 0.05),在培养96 h时显著下降(P < 0.05);培养24 h时,两组间细胞增殖活性[(0.86 ± 0.04)vs(0.83 ± 0.01),P>0.05]和早期凋亡率[(8.58 ± 0.75)% vs(8.68 ± 1.53)%,P>0.05]差异无统计学意义。

3 讨论

本研究通过构建OVA诱发的哮喘模型,并给予IL-17A气道滴入,发现IL-17A能显著降低脾脏和支气管淋巴结中Th2细胞分化比例,改善气道嗜酸性粒细胞炎症,初步揭示IL-17A在哮喘中可能具有一定的调节免疫和改善气道炎症的作用。过度增高的Th2细胞分化及其相关的嗜酸性粒细胞炎症是哮喘的重要发病基础。本研究发现IL-17A在哮喘小鼠体内外抑制Th2细胞分化,降低BALF中Th2型因子IL-4、IL-5的水平,改善气道嗜酸性粒细胞炎症,对其中机制的深入探讨有助于我们进一步了解哮喘并寻求可能的干预靶点。

我们既往研究发现脂多糖可以降低哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞数,抑制IL-17A基因表达后气道嗜酸性粒细胞数增高[7]。本研究给予哮喘小鼠气道滴入IL-17A后,发现BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞数及其比例显著降低,肺组织病理显著减轻,气道嗜酸性粒细胞炎症得到改善,与Hellings等[5]和Tian等[11]的研究有相似结果。

IL-17A可能通过多种机制改善气道嗜酸性粒细胞炎症。Hellings等[5]发现中和IL-17A后哮喘小鼠骨髓嗜酸性粒细胞数增高,气道嗜酸性粒细胞炎症加重,而气道滴入IL-17A[11]能降低嗜酸性粒细胞趋化受体3、转录因子Gata-1等的基因表达,直接抑制骨髓嗜酸性粒细胞分化,改善哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症。Murdoch等[12]发现给予哮喘小鼠IL-17A或者γδT细胞后能加速气道嗜酸性粒细胞炎症的吸收,可能与其减少肺部IL-23产生而降低嗜酸性粒细胞募集相关。IL-17A还能抑制DCs分泌趋化因子17[13],减少Th2细胞的趋化,降低哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症;本研究发现给予哮喘小鼠IL-17A气道滴入后,BALF中Th2型相关因子IL-4、IL-5显著降低,而Th2细胞是机体IL-4、IL-5的最重要的来源,尽管目前研究表明除了Th2细胞以外,其他如固有淋巴细胞和嗜碱性粒细胞等也可分泌IL-4、IL-5[2],但这些细胞在体内数量很少,不是哮喘中IL-4、IL-5的主要来源。因此推测IL-17A对Th2细胞分化可能有抑制作用。气道滴入IL-17A后,哮喘小鼠脾脏和支气管淋巴结的Th2细胞分化比例减少,而Th1和Th17细胞分化比例无显著变化,并发现IL-17A在体外也能降低Th2细胞分化比例,而对增殖和凋亡无明显影响。这些结果均表明IL-17A在哮喘小鼠体内外抑制Th2细胞分化。未对肺部Th2细胞分化进行检测是研究中不足的一点。本研究的发现提示IL-17A对Th2细胞分化的抑制可能是其改善哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症的机制之一。

IL-17A通过结合IL-17受体(IL-17R)对下游信号的调控可能是IL-17A抑制Th2细胞分化的机制之一。在小鼠体内,IL-17A结合IL-17R后,可激活接头分子ACT1并启动ERK、NF-κB等信号通路,调控细胞因子、转录因子等的表达[14]。Yamane等[15]发现ERK活化后可以抑制早期的GATA3产生而减少Th2细胞分化。目前发现STAT6、STAT5a、GATA3是Th2细胞分化的3种关键转录因子[16]。因此,IL-17A可能通过IL-17R信号抑制如GATA3等分子的表达减少Th2细胞分化,但具体机制需要进一步研究。

本研究初步揭示IL-17A在体内外能抑制Th2细胞的分化,并减少哮喘小鼠BALF中Th2型因子IL-4、IL-5的产生,减轻哮喘气道嗜酸性粒细胞炎症,为支气管哮喘防治提供新的思路。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612143
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

王熠杰, 赵生涛, 杨旭, 王冉, 郭东霖, 蒋云秋, 王长征.
Wang Yijie, Zhao Shengtao, Yang Xu, Wang Ran, Guo Donglin, Jiang Yunqiu, Wang Changzheng.
IL-17A抑制Th2细胞分化减轻哮喘小鼠气道嗜酸性粒细胞炎症
IL-17A inhibits Th2 cell differentiation and alleviates eosinophilic airway inflammation in a mouse model of asthma-
第三军医大学学报, 2017, 39(10): 954-959
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(10): 954-959
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612143

文章历史

收稿: 2016-12-20
修回: 2017-01-30

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