肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是左向右分流先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)最常见的并发症之一,也是先天性心脏病的主要死亡原因之一[1]。先天性心脏病肺动脉高压发病率较高,早期缺乏明显的症状体征,进展到重度肺动脉高压时,患者预后差,死亡率高[2]。现有诊断肺动脉高压主要是心脏超声,右心导管检测,但缺乏特异性血清标志物[3]。
环状RNA(circular RNA, CircRNA)是一类具有特殊未知功能的RNA,而且是客观大量存在, 由前体RNA通过剪切,然后由线性RNA的头对尾连接形成[4]。研究表明在生物体内大量存在环状的RNA分子,环状RNA由于形成闭合的环,不受RNA外切酶影响,不易降解,在生物体内非常的稳定,使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的应用上具有明显优势[5]。那么在先天性心脏病肺动脉高压患者,肺血管病理性重塑,内皮细胞及成纤维细胞的增殖过程中,环状hsa_circ_0029642与先天性心脏病肺动脉高压是否存在相关性,本研究就此进行了分析。
1 资料与方法 1.1 研究对象经新桥医院2016年3月伦理委员会批准,选取新桥医院心血管外科2016年3-7月住院的先天性心脏病伴肺动脉高压患者20例(A组),先天性心脏病不伴肺动脉高压患者20例(B组),风湿性心脏病伴动脉高压患者20例(C组)。患者签署知情同意书。具体纳入标准:根据临床症状、体征、心电图、心脏超声、胸部X线片等明确诊断有先天性心脏病或风湿性心脏病,且拟行心脏手术。肺动脉收缩压(pulmonary artery systolic pressure,PASP)>37 mmHg为肺动脉高压[6]。肺动脉压估测采用:肺动脉收缩压(PASP)=右房压+三尖瓣跨瓣压差,其中右房压估计为5 mmHg,三尖瓣跨瓣压差=4V2, V为最大三尖瓣反流速度[6]。三尖瓣反流均为我科经验丰富的医师由同1台超声设备检测。排除标准:排除冠心病、糖尿病、感染、肿瘤、严重高血压等可能会潜在影响循环血RNA表达的疾病,排除明显的左心功能衰竭、右室流出道梗阻、肺部疾病, 或者慢性血栓栓塞性疾病及其他原因肺动脉高压性疾病。
1.2 实验室检测在患者手术前麻醉后,从桡动脉抽取动脉血5 mL,室温静置1 h,4 ℃,1 000×g离心15 min,移取血清置于无RNA酶的EP管中,冻存于-80 ℃冰箱中备用。
1.3 方法 1.3.1 总RNA提取及质量检测参照TaKaRa RNAiso Blood试剂说明书,每份样品取血清250 μL,逐步提取3组标本中的总RNA。应用分光光度计测定总RNA的光密度D(260) 和D(280) 值,用D(260) 值计算其浓度,并计算D(260)/D(280) 值检测其纯度,D(260)/D(280) 值范围在1.7~2.1认为合格。
1.3.2 实时荧光定量PCR检测环状RNA按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser,说明书进行操作。引物由广州吉赛生物科技有限公司设计,hsa_circ_0029642-F5:5′-CCGCCTGCAATATGCAATCA,hsa_circ_0029642-R2:5′ACAACTTGGAAGGCATGAGA。以GAPDH为内参,GAPDH上游:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT,GAPDH下游:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA。
1.3.2.1 去除基因组DNA反应体系为:5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μL,gDNA Eraser 1.0 μL,总RNA 2 μg,RNase Free dH2O补至10 μL。反应条件为:42 ℃ 2 min,4 ℃。
1.3.2.2 反转录反应上一步实验的反应液: 10.0 μL,Prime Script RT Enzyme MixⅠ 1.0 μL,RT Primer Mix 1.0 μL,5×PrimeScript Buffer2 4.0 μL,RNase Free dH2O 4.0 μL,总共20 μL。反应条件为:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃。
1.3.2.3 RT-PCR反应用Applied Biosystems Stepous荧光定量PCR测定仪进行反应,按下列组分配制PCR反应液:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,PCR正向引物(10 μmol/L)0.8 μL,PCR反向引物(10 μmol/L)0.8 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,RT反应液(cDNA溶液)2.0 μL,dH2O(灭菌蒸馏水)6 μL,总共20 μL。采用两步法PCR反应程序。反应结束后确认PCR的扩增曲线和融解曲线。
1.4 统计学方法应用SPSS 22.0统计软件进行数据统计分析。计量资料用x±s表示, 多组间均数比较采用单因素方差分析, 若方差不齐,则采用非参数检验(Kruskal-Wallis检验)进行组间比较。
2 结果 2.1 各组患者基本资料比较3组患者年龄、身体质量指数符合正态分布,采用单因素方差分析,3组间年龄差异无统计学意义(F=0.738,P>0.05),各组间身体质量指数差异无统计学意义(F=0.440,P>0.05,表 1)。
组别 | 男/女(例) | 年龄(x±s,岁) | BMI(x±s) | 肺动脉压 | RQ值 | ||||
M | P25,P75 | 平均秩次 | M | P25,P75 | 平均秩次 | ||||
A组 | 6/14 | 33.1±13.7 | 23.5±1.6 | 47.69 | 39.29,61.55 | 42.05a | 2.27 | 1.00,7.16 | 26.55b |
B组 | 11/9 | 31.5±10.5 | 24.0±1.8 | 22.89 | 19.03,25.98 | 10.50 | 8.00 | 2.63,16.43 | 40.60 |
C组 | 9/11 | 36.2±12.5 | 23.9±2.0 | 43.32 | 39.11,52.04 | 38.95a | 2.44 | 1.04,4.92 | 24.35b |
a:P<0.01,b:P<0.05,与B组比较 |
2.2 各组患者肺动脉收缩压比较
由于3组数据方差不齐,通过非参数检验(Kruskal-Wallis检验)进行组间差异比较,经检验,组间差异有统计学意义(χ2=39.669,P<0.01)。进一步两两比较,A组和C组显著高于B组(P<0.05),但A组和C组组间差异无统计学意义(P>0.05,表 1)。
2.3 总RNA质量检测应用紫外分光光度计检测3组标本总RNA的D(260)/D(280) 值均在1.7~2.1之间,各组总RNA均有较好质量,可以进行实时定量PCR检测。
2.4 实时定量PCR检测环状RNA结果以SYBR Green实时荧光定量qPCR法测出各组标本Ct值,确认PCR反应的扩增曲线和融解曲线良好。用2-△△Ct计算RQ值。经正态性检验,A、B、C组数据RQ值均不呈正态分布(P<0.05),非参数检验显示组间RQ值差异有统计学意义(χ2=10.192,df=2,P<0.05,表 1),两两比较提示:A组和C组的RQ值显著低于B组(P<0.05),而A组与C组的RQ值差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5 血清环状RNA hsa_circ_0029642浓度对肺动脉高压的诊断价值在60例中,肺动脉压正常者20例,肺动脉高压者40例。绘制ROC曲线,曲线下面积AUC=0.752,P<0.01,95%CI=0.621~0.884,根据测定值来判读肺动脉高压具有一定的诊断价值。根据不同测定值,约登指数大小,计算出到RQ值为6.35时,约登指数最大,为0.50。此时,判读肺动脉高压的敏感度为70%,特异度为80%(图 1)。
3 讨论
CircRNA是新近确认的一类特殊的非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)分子,是继微小RNA(microRNA,miRNA)后RNA家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星,也是RNA领域最新的研究热点[7]。已有研究表明,circRNA在人体细胞中广泛表达,在转录后水平具有调控基因表达的重要功能[8]。有些circRNA具有天然miRNA海绵作用,可通过与miRNA结合而抑制其活性,从而调控miRNA靶标发挥作用, 参与多种疾病的发生、发展[9]。例如环状RNA与miR-223作用阻止心肌肥厚和心衰[10]。
先天性心脏病患者长期血流动力学改变则会造成肺血管出现不可逆性结构性重塑,形成先天性心脏病相关性肺动脉高压[11]。在血管重建过程中,内皮素、前列环素、TGF-β、钙通道、钾通道等多种因素参与其中[12]。特别是平滑肌细胞从收缩性表型转换为合成表型发挥了关键性作用[13]。而RNA编码酶ADAR1通过调节平滑肌细胞标记基因的前体RNA拼接从而控制平滑肌细胞表型的形成[14]。也有研究证明ADAR1表达及活性的升高促进了肺的微血管损伤[15]。环状RNA作为一类特殊的非编码RNA, 其表达量与RNA编码酶ADAR1负相关,上调的ADAR1导致了环状RNA表达量的降低[16]。国内动物实验发现肺动脉高压小鼠肺组织中环状RNA mm9_circ_010120表达下调[17],可能就是ADAR1上调后导致了环状RNA的表达降低,我们推测先天性心脏病肺动脉高压患者,肺血管内皮细胞在高血流及高血压所产生的剪切力的作用下,内皮细胞损伤,导致血小板黏附及激活凝血途径和炎症反应,这可能导致了内皮细胞中RNA编码酶ADAR1的升高,与环状RNA负相关的ADARI导致环状RNA hsa_circ_0029642的降低,环状RNA hsa_circ_0029642吸附miRNA的海绵作用减弱,导致了某种miRNA的升高,最终导致了内皮细胞的增殖,肺血管的重建。另一方面,内皮细胞在长期的损伤及炎症反应的作用下,可能导致了其13号染色体的缺失,而位于13号染色体上的CRYLI基因也可能因此受损,CRYLI基因通过Cd2/cyclin通路延长内皮细胞G2~M周期、增加细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用减弱[18],这也导致了内皮细胞的增殖,肺血管的重建。
我们检测发现先天性心脏病伴肺动动脉高压患者血清中环状RNA hsa_circ_0029642比先天性心脏病不伴肺动脉压患者明显降低,风湿性心脏病伴肺动脉高压患者血清中环状RNA hsa_circ_0029642含量与先天性心脏病伴肺动脉高压患者差异无统计学意义,但比先天性心脏病不伴肺动脉高压者明显降低,证实了环状RNA hsa_circ_0029642与肺动脉高压有明显相关性,但是其浓度梯度与肺动脉高压的程度是否具有对应关系,仍需进一步试验证明。在本实验中,我们检测了血清中环状RNA hsa_circ_0029642,在肺动脉高压患者肺组织中环状RNA含量如何,还需要加以明确,而环状RNA hsa_circ_0029642与ADAR1作用的具体机制则是下一步试验研究的重点。
总之,本实验在人血清中检测出环状RNA hsa_circ_0029642, 其表达量在先天性心脏病肺动脉高压患者血清中下调。与肺动脉压正常者具有明显差别。可能是未来肺动脉高压治疗的新靶点。
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