低矿物质饮水连续3代饮用对大鼠蛋白质平衡及维生素A和维生素D<sub>3</sub>水平的影响

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谭瑶, 陈济安, 黄玉晶, 赵清, 邱志群, 曾惠, 舒为群. 低矿物质饮水连续3代饮用对大鼠蛋白质平衡及维生素A和维生素D₃水平的影响[J]. 第三军医大学学报, 2017, 39(11): 1093-1098. 复制到剪切板

Tan Yao, Chen Ji'an, Huang Yujing, Zhao Qing, Qiu Zhiqun, Zeng Hui, Shu Weiqun. Multiple generation effects of drinking low mineral water for 3 generations on protein balance and vitamin A and 25-hydroxy vitamin D₃ levels in offspring rats[J]. Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(11): 1093-1098. 复制到剪切板

低矿物质饮水连续3代饮用对大鼠蛋白质平衡及维生素A和维生素D₃水平的影响

谭瑶, 陈济安, 黄玉晶, 赵清, 邱志群, 曾惠, 舒为群

400038 重庆，第三军医大学军事预防医学院军队环境卫生学教研室

收稿: 2016-12-13；修回: 2017-01-15

基金项目: 国家自然科学基金重点项目(81230064)；重庆市卫生局医学科研项目(2012-2-447)

通讯作者: 舒为群，E-mail: xm0630@sina.com

[摘要] 目的观察低矿物质饮水连续多代饮用后对机体蛋白质平衡和维生素水平的影响。方法实验以自来水[简称A，溶解性总固体(total dissolved solids, TDS)为229.0 mg/L]作为正常水对照，3种低矿物质水分别为低矿水1(B，TDS 87.2 mg/L)、低矿水2(C，TDS 10.9 mg/L，在纯净水中人工添加了氯化钾和硫酸镁)、低矿水3(D，TDS 1.2 mg/L，纯净水)。断乳SD雌鼠120只、雄鼠60只，按随机数字表法分为4组，分别饮用上述4种水。参照国际经济合作与发展组织的两代繁殖实验标准OECD416，并参考中国《GB15193.15-2003繁殖试验标准》建立大鼠连续3代饮水暴露模型，至F2代10月龄时处死大鼠，采集腹主动脉血，采用自动生化分析仪检测血清蛋白合成指标总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PALB)、球蛋白(GLB)以及蛋白分解指标尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)；采用ELISA试剂盒检测雌鼠血浆维生素A和25(OH)维生素D₃[25-hydroxyvitamin D₃，25(OH)VD₃]水平。蛋白质代和维生素指标与水质的相关性采用双变量相关分析，其余指标采用单因素方差分析和t检验进行分析。结果与A组相比较，雄鼠在B组和C组出现共同的变化，PALB降低(P=0.006，P=0.037)，BUN(P=0.015，P=0.012) 降低，BUN/CRE比值降低(P=0.001，P=0.002)，同时B组还出现CRE增加(P=0.050)；雌鼠除D组的PALB增高外(P=0.030)，CRE在B组、C组和D组均增加(P=0.033，P=0.015，P=0.000)，BUN/CRE比值在3组都降低(P=0.002，P=0.003，P=0.044)。B组和D组维生素A均升高(P=0.020，P＜0.001)，但B、C组和D组的25(OH)D₃均降低(P均＜0.001)。相关性分析显示，25-OH-D₃水平与水质多项指标具有较强关联。结论多代连续饮用低矿物质饮水可能不利于蛋白正向平衡，并降低25(OH)VD₃水平；25(OH)VD₃较维生素A更可能是水质健康效应的敏感指标。

[关键词] 低矿物质饮用水蛋白平衡维生素A 25(OH)维生素D₃ 大鼠

Multiple generation effects of drinking low mineral water for 3 generations on protein balance and vitamin A and 25-hydroxy vitamin D₃ levels in offspring rats

Tan Yao , Chen Ji'an , Huang Yujing , Zhao Qing , Qiu Zhiqun , Zeng Hui , Shu Weiqun

Department of Environmental Hygiene, College of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China

the Key Program of National Natural Science Foundation of China (81230064) and the Project of Medical Scientific Research of Chongqing Municipal Health Bureau (2012-2-447)

Corresponding author: Shu Weiqun, E-mail:xm0630@sina.com

[Abstract] Objective To determine the multiple-generation effects of low mineral drinking water (LMDW) on protein metabolism, vitamin A and vitamin D₃ levels in offspring rats. Methods Four kinds of drinking water were used in the experiment, that is, tap water [A, total dissolved solids (TDS), 229.0 mg/L, as control], and LMDW water B, C and D (containing TDS 87.2, 10.9 and 1.2 mg/L, respectively. Water C was artificially mineralized water with a small amount of KCl and MgSO₂ added in purified water). Totally 120 weaning female and 60 male SD rats were randomly divided into 4 groups, and given the water separately for 3 generations continuously, based on the International Economic Cooperation and Development Organization of the 2 generations of experimental standard OECD416 and the Chinese National Standard GB15193.15-2003. The rats after 10 months of breeding were sacrificed, and the abdominal aortic blood samples were collected for separating serum protein. Total protein (TP), albumin (ALB), pre-albumin (PALB), globulin (GLB), albumin and globulin ratio, and protein metabolism related indicators of urea, serum creatinine, blood urea nitrogen (BUN) and creatinine (CRE) were detected by automatic biochemistry analyzer, and the levels of vitamin A, 25-hydroxy vitamin D₃ [25(OH)VD₃] by the ELISA. Correlation of protein metabolism and vitamins with water quality were analyzed with bivariate correlation analysis, and the other indicators were analyzed by single factor analysis of variance and students' t test. Results Compared with the group A, the male rats showed similar changes in the group B and group C, including significantly decreased PALB (P=0.006, P=0.037), BUN (P=0.015, P=0.012) and BUN/CRE ratio (P=0.001, P=0.002), and CRE was significantly increased (P=0.050) in the group B. In the female rats, except the increased PALB in group D (P=0.030), CRE was elevated in the groups B, C and D (P=0.033, P=0.015, P=0.000), and the BUN/CRE ratio was also decreased in the 3 groups (P=0.002, P=0.003, P=0.044). The levels of vitamin A were raised in the groups B and D (P=0.02, P < 0.001), but that of 25(OH)VD₃ was reduced in the groups B, C and D simultaneously (all P < 0.001). Correlation analysis showed that there was a strong correlation between the level of 25(OH)VD₃ and multiple water components. Conclusion Drinking LMDW for multiple generations may have negative effect on protein metabolism and 25(OH) VD₃. 25(OH) VD₃ may be a sensitive biomarker for drinking water with mineral differences than vitamin A.

[Key words] low mineral drinking water protein balance vitamin A 25-hydroxy vitamin D₃ rats

水与健康息息相关，WHO提出尽管饮水不是人体矿物元素的主要来源，但现代人饮食中所含的矿物质不足，从饮水中摄取矿物质非常重要^[1]。部分水种由于经过多重处理，对人体健康有重要影响的水中天然矿物质含量存在不同程度的下降, 成为低矿物质含量的饮水。受研究过程中诸多因素的影响，长期饮用较低矿物质含量的水对健康有何利弊至今仍没有统一定论。

虽然水与健康的研究在心血管、骨骼、繁殖能力方面已有较多报道，但是水质与蛋白质代谢和维生素营养水平的研究甚少，仅有资料显示水质提升能明显改善血液透析患者的营养状态^[2]，水中的钙元素能调节机体维生素D的合成^[3]。多代连续饮用不同矿物含量的饮水和人群饮水干预对机体蛋白质代谢和对维生素A、25(OH)维生素D₃[25-hydroxyvitamin D₃，25(OH)VD₃]水平影响尚不清楚。因此，我们选择3代连续饮用自来水和不同矿物含量饮用水的大鼠进行动物实验，研究和探讨低矿物质饮水对机体蛋白代谢、维生素A、25(OH)VD₃水平的影响，为进一步深入研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 实验用水

实验用到的4种水分别为自来水[A，溶解性总固体(total dissolved solids, TDS)为229.0 mg/L]作为正常水对照, 源于重庆城市供水系统；低矿水1(B，TDS 87.2 mg/L, 某品牌瓶装水)；低矿水2(C，TDS 10.9 mg/L, 在纯净水中人工添加了氯化钾和硫酸镁)；低矿水3(D，TDS 1.2 mg/L, 纯净水)。3种低矿水均为市售相同批次的瓶装饮用水，经电导率和TDS检测合格后用于实验。4种饮水经检测均符合水质标准^[3]，其主要水质指标见表 1。

表 1 4种饮用水水质比较(mg/L)

水质参数	水种
水质参数	A	B	C	D
TDS	229.00	87.20	11.30	1.20
总硬度	200.30	69.60	2.30	0.80
钙	52.90	10.60	0.02	0.04
镁	12.70	9.40	0.40	0.02
钠	12.40	9.00	0.10	0.10
钾	2.50	3.80	3.40	＜0.50
铁	0.13	＜0.01	＜0.01	＜0.01
铝	＜0.10	＜0.10	＜0.10	＜0.10
锰	0.02	0.02	0.03	0.02
铜	0.05	0.06	0.05	0.05
锌	0.07	0.01	0.01	0.01
化学需氧量(COD)	1.00	0.60	0.60	0.50

表选项

1.2 动物实验

繁殖程序参照国际经济合作与发展组织的两代繁殖实验标准OECD416(Ao-Generation Reproduction Toxicity Study)并参考中国《GB15193.15-2003繁殖试验标准》^[4]进行实验设计：亲代(F0代)：断乳SD雌鼠120只、雄鼠60只，均按随机数字表法分为4组，每组30(雌性)/15(雄性)只。饮水至4月龄开始繁殖实验，雌雄2：1比例交配，产生约20只受孕F0代雌鼠。雄鼠处死，孕鼠保留至生产F1代仔鼠。各组F1代雌鼠继续保留30只，雄仔鼠15只，饮用相同饮水至4月龄，雌雄2：1比例交配，产生约20只受孕F1代雌鼠。雄鼠处死，孕鼠保留至生产F2代仔鼠。此时各组雌雄各保留30只，仍然饮用相同饮水直至10个月实验结束。实验动物均由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供[许可证号：SCXK(军)2007-017]。饲养于该动物中心清洁级动物实验室，喂饲大鼠用全价颗粒饲料，每组自由饮水及进食，组间除饮水外其他条件均一致，每日早上定时更换饮水及添加饲料。

1.3 取材和检测指标

F2代大鼠10月龄时，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，采集腹主动脉血，分离血清，采用自动生化分析仪检测总蛋白、白蛋白、球蛋白、前白蛋白、白球比、尿素氮、肌酐、尿酸、尿素氮肌酐比，采用上海博谷生物科技有限公司提供的ELISA试剂盒检测雌鼠血浆维生素A和25(OH)VD₃含量。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件, 蛋白质代和维生素指标与水质的相关性采用双变量相关分析，其余指标采用单因素方差和t检验进行分析。动物实验数据以x±s表示，水质与体内蛋白质合成代谢和维生素水平的相关性以相关系数r值表示，检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 4种饮用水水质比较

4种饮水的TDS分别为229.00、87.20、11.30、1.14 mg/L，总硬度、钙、镁、钠、铁、锌含量均为A＞B＞C＞D，钾含量B＞C＞A＞D。D中的铜含量高于其他3种水，C中的锰含量高于其余3种饮水(表 1)。

2.2 各组大鼠体质量变化

整个实验过程中各组大鼠整体生长发育状况良好，体质量增长较稳定，雌雄大鼠观察时间点体质量组间差异均无统计学意义。

2.3 大鼠蛋白质平衡指标

前白蛋白含量雄鼠B组(P=0.006) 和C组(P=0.037) 低于A组，雌鼠D组高于A组(P=0.030)。各组间总蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比差异均无统计学意义。与A组相比，B组(P=0.015) 和C组(P=0.012) 雄鼠尿素含量降低；B组肌酐含量升高(P=0.050)；B组(P=0.001) 和C组(P=0.002) 尿素肌酐比(U/C)降低。B组(P=0.033) 和C组(P=0.000) 雌鼠肌酐含量升高；B组(P=0.002)、C组(P=0.003) 和D组(P=0.044) 尿素肌酐比(U/C)均降低；各组间尿素含量差异无统计学意义(表 2)。

表 2 各组大鼠蛋白质平衡相关指标比较(x±s)

组别	n	总蛋白 (g/L)	白蛋白 (g/L)	球蛋白 (g/L)	白球比	前白蛋白 (g/L)	血清尿素氮 (mmol/L)	血清肌酐 (μmol/L)	尿素氮肌酐比
雄鼠
A组	10	60.01±4.29	16.32±0.99	43.67±3.48	0.37±0.01	57.05±14.43	5.05±1.39	39.30±12.59	33.86±10.42
B组	26	59.19±4.15	15.78±1.19	43.37±3.66	0.36±0.03	44.24±9.05^a	4.28±0.65^b	46.59±9.38^b	23.81±6.84^a
C组	21	58.24±4.31	15.77±1.68	42.42±2.98	0.37±0.03	47.23±17.63^b	4.23±0.77^b	45.21±9.84	24.12±6.38^a
C组	24	59.95±4.12	16.11±1.36	43.79±3.34	0.36±0.03	50.85±14.28	4.66±0.79	36.38±9.23	33.28±8.72
P值		0.533	0.608	0.565	0.786	0.034	0.034	0.002	0.000
雌鼠
A组	22	60.50±4.99	20.84±1.71	44.10±3.76	0.47±0.03	47.06±14.92	4.32±0.67	37.34±11.49	31.08±9.86
B组	20	65.55±4.65	20.18±1.81	45.32±3.72	0.44±0.04	44.81±9.28	3.85±0.78	45.07±11.56^b	22.18±5.87^a
C组	21	66.80±5.36	21.35±1.94	45.40±4.07	0.46±0.004	47.48±11.96	4.56±0.80	50.58±9.42^a	23.18±6.70^a
C组	16	66.13±4.49	20.50±1.87	45.58±2.99	0.45±0.03	59.16±13.94^b	4.15±1.20	42.12±10.94	25.71±10.13^b
P值		0.657	0.248	0.542	0.051	0.004	0.073	0.002	0.006
a：P＜0.01，b：P＜0.05，与A组比较

表选项

2.4 雌鼠维生素水平

与A组相比，B组(P=0.020) 和D组(P=0.000) 雌鼠维生素A含量升高(图 1)；B组(P=0.000)、C组(P=0.000) 和D组(P=0.000)25(OH)VD₃含量降低(图 2)。

a：P＜0.01，与A组比较图 1 各组雌鼠血浆维生素A含量比较

图选项

a：P＜0.01，与A组比较图 2 各组雌鼠血浆25(OH)VD₃含量比较

图选项

2.5 大鼠蛋白质代谢及维生素相关指标与水质相关性分析

水中TDS、总硬度、钙、铁、锌含量与白球比、尿素氮肌酐比、25(OH)VD₃呈正相关，与肌酐呈负相关。镁与25(OH)VD₃呈正相关。钾、铜含量与前白蛋白、尿素氮肌酐比、25(OH)VD₃呈负相关，与肌酐呈正相关。铜、铁与维生素A呈负相关(表 3)。

表 3 雌雄大鼠蛋白质代谢和维生素A、25(OH)VD₃与水质双变量相关性分析

因素	总蛋白	白蛋白	前白蛋白	球蛋白	白球比	尿素	肌酐	尿素肌酐比	维生素A	25(OH)VD₃
TDS	-0.013	0.068	0.065	-0.024	0.137	0.044	-0.165^b	0.165^b	-0.119	0.460^a
总硬度	-0.009	0.076	-0.045	-0.028	0.147^a	0.047	-0.187^b	0.188^b	-0.119	0.460^a
钙	-0.002	0.095	-0.010	-0.036	0.172^a	0.054	-0.217^b	0.222^b	-0.037	0.670^a
镁	-0.026	0.019	-0.125	-0.005	0.067	0.024	-0.091	0.081	-0.119	0.460^a
钠	-0.025	0.020	-0.118	-0.006	0.069	0.024	-0.101	0.090	-0.081	0.589^a
钾	-0.038	-0.035	-0.298^a	0.036	-0.029	-0.015	0.284^a	-0.275^a	0.172	-0.457^a
铁	0.007	0.118	0.034	-0.046	0.200^a	0.062	-0.246^a	0.257^a	-0.263^a	0.703^a
锰	0.006	0.032	-0.096	0.009	0.030	-0.002	0.248^a	-0.213^a	-0.145	-0.547^a
铜	-0.044	-0.128	-0.208^a	0.051	-0.169^a	-0.047	0.184^b	-0.214^a	0.321^a	-0.250^a
锌	0.007	0.118	0.034	-0.046	0.200^a	0.062	-0.246^a	0.257^a	-0.263^a	0.703^a
a：P＜0.01, b：P＜0.05

表选项

3 讨论

我国生活饮用水的基本卫生要求，除满足流行病学安全以外，还要求水质化学组成有利健康，不会影响子孙后代的健康成长^[5]。目前国内外在饮用水的生物学效应方面主要集中在20世纪五六十年代的人群流行病学调查和基于单代动物的实验研究，不能完全反映多代连续饮用后机体的变化。因此我们选择多代连续饮用4种饮水的大鼠模型进行比较研究，更能客观比较水质对健康的长期影响。

本研究蛋白质平衡方面主要观察到前白蛋白、肌酐、尿素指标的显著差异。血清前白蛋白是在肝实质细胞^[6]合成的一种快速转运蛋白质，在体内再分配后不能蓄积，更能敏感地反映近期肝脏蛋白质的合成与分泌情况以及营养状况的早期变化^[7-9]。肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，在饮食和饲养条件一致的情况下，肌酐水平可以反映肾脏功能和机体部分的肌肉代谢状况。尿素是蛋白质代谢的主要终末产物。实验结果显示雄鼠前白蛋白含量A组高于B组和C组，尿素含量B组和C组低于A组，肌酐含量B组高于A组。雌鼠前白蛋白含量D组高于A组，B组和C组高于A组。提示不同水质对雌、雄大鼠在蛋白合成与分解的平衡方面影响不同：饮用自来水的雄鼠蛋白合成较多，蛋白质的代谢物相对饮用低矿物质水的雄鼠多。同时，肌肉分解较饮用矿物质稍低的瓶装水低，这使肌肉的合成大于分解，利于肌肉蛋白质的维持。饮用低矿物质水的雌鼠蛋白合成和肌肉分解均较自来水多，可能使肌肉合成与分解处于平衡的趋势，并未表现出蛋白质维持方面的优势。

相关性分析显示：水中的铜、钾与前白蛋白呈负相关，与已有的研究报道铜能抑制蛋白质合成^[10]结论一致，但钾与前白蛋白的相关性，目前少见其他相同报道，有待进一步研究。自来水中丰富的铁、锌元素也可能促进了蛋白质的合成^[11-12]。水中TDS、总硬度、钙、铁、锌含量与血清肌酐呈显著负相关，钾、铜、锰与血清肌酐呈显著正相关。这可能是自来水组在肌肉代谢中具有优势的原因。此外稍低矿物质的B组水中较高含量的钾使肌肉兴奋性增强^[13]，分解速度加快，增加了肌酐代谢。

维生素是维持细胞正常生理机能的必需营养素，维生素A进入血液后以脂蛋白的形式储存在肝脏并参与蛋白质的合成。实验结果显示雌鼠血浆维生素A水平B组和D组高于A组，血清25(OH)VD₃含量B组、C组、D组均低于A组。美国健康与营养状况调查发现，25(OH)VD₃缺乏与贫血相关^[14]。流行病学资料显示，各类肝病患者均普遍存在不同程度的维生素D缺乏^[15]。我们推测饮用自来水组机体较高的维生素D水平有利于肝脏营养和功能, 饮水对机体维生素A的影响不如25(OH)VD₃敏感，可能与负责运输维生素A的前白蛋白^[16]在A组偏少有关^[17]。相关性分析显示，水中TDS、总硬度、钙、镁、钠、铁、锌含量与25(OH)VD₃水平呈显著正相关，钾、铜、锰与25(OH)VD₃水平呈负相关。水中铁、锌含量与维生素A水平呈显著负相关，铜与维生素A水平呈负相关。维生素D的转化和在体内的转运需要铁和钙的间接参与，自来水中丰富的铁和钙可能更利于体内钙的吸收和调节体内维生素D的水平，这可能是25(OH)VD₃较维生素A更敏感的另一原因。铁和锌与维生素A的负相关性，与补铁和锌能改善体内维生素A营养水平的报道不一致^[18-19]，还有待进一步实验研究。

综上，食物的摄入并不能平衡因饮水中矿物质和微量元素的摄入减少对机体营养状况产生的改变。饮用矿物质种类及含量丰富的自来水，比饮用低矿物质的水，更有利于维持机体蛋白正向平衡以及较高的25(OH)VD₃水平。因此就从蛋白合成代谢和维生素A、25(OH)VD₃方面来看，饮用自来水是一种良好的饮水方式，对动物和人类的机体健康和营养平衡都是有益的，特别是对蛋白需求敏感的人群尤为有益，应值得提倡和推广。而长期饮用低矿物质饮水则可能对机体蛋白质营养状况和维生素D水平产生不利影响。本研究对饮水干预的机体效应方面做了初步探索，不同饮水对机体影响的因素较多，特别是对多代连续饮用后机体的影响，还有待更深入的机制研究(如表观遗传学等方面)予以解释。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612090
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准，
由第三军医大学主管、主办

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谭瑶, 陈济安, 黄玉晶, 赵清, 邱志群, 曾惠, 舒为群.

Tan Yao, Chen Ji'an, Huang Yujing, Zhao Qing, Qiu Zhiqun, Zeng Hui, Shu Weiqun.

低矿物质饮水连续3代饮用对大鼠蛋白质平衡及维生素A和维生素D₃水平的影响

Multiple generation effects of drinking low mineral water for 3 generations on protein balance and vitamin A and 25-hydroxy vitamin D₃ levels in offspring rats

第三军医大学学报, 2017, 39(11): 1093-1098

Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(11): 1093-1098

http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201612090

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收稿: 2016-12-13

修回: 2017-01-15

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