发育期是骨骼生长的最重要时期，其矿物质需求量远大于其他年龄阶段(婴儿期除外)[1]。人从出生到青春期前、青春期阶段分别获得人体30%、50%的峰值骨量[2]，建立较大的骨量峰值是预防骨质疏松的关键[3]。骨质疏松症已成为全球关注的热点，也是我国步入老龄化社会所面临的重要的公共卫生问题。机体矿物质摄入主要来源于膳食，但营养调查显示我国居民钙、镁等矿物质摄入不足问题严重[4]。水中的钙、镁等矿物元素主要以离子形式存在而容易被机体吸收，饮水是机体补充矿物质的一条重要途径[5-6]。
现阶段我国饮水类型多样，除自来水外，包装饮用水市场发展迅速，但是水中矿物元素含量差异较大。本课题组前期研究显示，饮用水矿物质含量下降可能带来包括骨骼发育不良在内的一系列健康风险[7-8]。为进一步探讨水中天然矿物元素与发育期骨骼生长的关系，本研究以发育期SD大鼠为研究对象，比较天然矿物质含量差别大的5种饮水对大鼠骨代谢水平、骨微结构和骨生物力学性能的影响，为选择有益青少年骨骼发育的饮水提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验用水自来水(tap water，TP)为重庆市政供水，天然水(natural water，NW)、纯净水(purified water，PW)、天然矿泉水1(natural mineral water 1，NMW1)、天然矿泉水2(natural mineral water 2，NMW2) 为市售包装饮用水。
5种水样水质指标由重庆市地质矿产检测中心检测，检测指标包括：pH值、溶解性总固体(total dissolved solids，TDS)、总硬度(total hardness，TH)、钠离子(Na+)、钾离子(K+)、钙离子(Ca2+)、镁离子(Mg2+)、硫酸根(SO42-)、氯离子(Cl-)、碳酸氢根(HCO3-)、磷(P)、偏硅酸(H2SiO3)，水质检测依据为饮用天然矿泉水检验方法(GB/T8538-2008)[9]。
1.2 方法 1.2.1 动物分组饲养3周龄断乳SD大鼠50只由第三军医大学实验动物中心提供[动物合格证号SCXK(渝)：2012-0003]，适应性喂养1周后，按随机数字表法分为5组，分别饮水瓶给予TP、NW、PW、NMW1、NMW2 5种饮水。饲料为大鼠全价颗粒饲料，由第三军医大实验动物中心生产提供[饲料生产许可证号：SCXK(军)2012-0009]。自由进食和摄水。每日早上定时更换饲料和饮水(自来水为管道中存留的水流放2 min后的新鲜水)，同时观察大鼠生长情况。每周称量大鼠体质量。喂养13周取材。
1.2.2 取材实验结束时，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉取血，静置，3 500 r/min离心5 min，分离血清以备血清学检测。取左侧股骨，仔细剔除肌肉组织，以浸润生理盐水的纱布包裹，再用锡箔纸包裹冷冻保存，实验前24 h将标本取出，室温下解冻。
1.2.3 骨代谢标志物检测取各组大鼠血清，采用酶联免疫法，按照上海酶联生物科技有限公司试剂盒说明测定甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、降钙素(calcitonin，CT)、25-羟维生素D3(25-hydroxy vitamin D3，25(OH)VD3)、1型前胶原氨基端前肽(procollagen type 1 N-terminal propeptide，P1NP)、骨钙素(osteocalcin，OC)、β-胶原特殊序列(β-collagen special sequence，β-crosslaps)、脱氧吡啶啉(deoxypyridinoline，DPD)。
1.2.4 骨微结构检测对股骨远心端进行Micro-CT(VivaCT 40，SCANCO Medical AG，Swizerland)扫描，选取距生长板远端1.0 mm、层厚3.0 mm的骨组织行三维重建，分析物理参数如下：骨密度(bone mineral density，BMD)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨表面积密度(bone surface/volume ratio，BS/BV)、结构模型指数(structure model index，SMI)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁连接性密度(trabecular connectivity density，Conn-D)。
1.2.5 骨生物力学检测股骨三点弯曲实验在Instron E1000电子动静态材料实验机上进行。加载于股骨中点，支点跨距20 mm，加载速度为2 mm/min。记录并计算生物力学指标：最大载荷(maximum load)、杨氏模量(Young's modulus)、最大应力(maximum stress)。
1.3 统计学分析数据分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Spearman相关性分析，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 5种水主要水质指标情况5种饮水的溶解性总固体大小依次为：NMW1、NMW2、TP、NW、PW。NW水中含有较多的偏硅酸；PW水中矿物质含量几乎为零；NMW1水中含有丰富的钙、镁、碳酸氢根等矿物成分；NMW2水中含有丰富的钙、镁、硫酸根等矿物成分(表 1)。
| 组别 | pH | TDS (mg/L) | TH (mg/L) | Ca2+ (mg/L) | Mg2+ (mg/L) | Na+ (mg/L) | K+ (mg/L) | SO42- (mg/L) | Cl- (mg/L) | HCO3- (mg/L) | P (mg/L) | H2SiO3 (mg/L) |
| TP组 | 8.32 | 333.87 | 184.64 | 50.40 | 14.29 | 14.16 | 5.12 | 45.54 | 19.16 | 166.99 | 0.06 | 5.44 |
| NW组 | 7.10 | 177.30 | 60.81 | 12.39 | 7.52 | 8.96 | 4.09 | 0 | 4.56 | 98.96 | 0.02 | 38.82 |
| PW组 | 6.33 | 3.63 | 0.43 | 0.17 | 0.08 | 0.33 | 0.04 | 0 | 0 | 0 | 0.03 | 0 |
| NMW1组 | 6.20 | 1 934.23 | 766.21 | 155.33 | 94.76 | 174.40 | 11.97 | 35.64 | 58.38 | 1 360.70 | 0.05 | 40.81 |
| NMW2组 | 8.21 | 953.79 | 650.67 | 175.15 | 54.65 | 3.89 | 7.31 | 531.79 | 10.03 | 139.16 | 0.03 | 22.74 |
2.2 各组大鼠一般情况
实验期间大鼠一般情况良好，体质量持续正常增加，大鼠体质量各组间未出现明显差异。
2.3 各组大鼠骨代谢生化指标的变化与TP组相比，PW组大鼠血清骨钙素(OC)水平显著降低(P＜0.05)；与PW组相比，NMW1组、NMW2组大鼠血清骨钙素水平显著升高(P＜0.05)。其余各指标组间差异无统计学意义(表 2)。
| 组别 | PTH (ng/L) | CT(ng/L) | 25(OH)VD3(μg/L) | PINP (μg/L) | OC (ng/L) | β-Crosslaps(pg/mL) | DPD (nmol/L) |
| TP组 | 54.66±16.07 | 505.32±252.14 | 23.97±8.05 | 17.73±3.77 | 673.02±350.31 | 1 167.24±451.56 | 1 172.93±519.30 |
| NW组 | 39.59±22.01 | 580.95±200.51 | 24.58±10.40 | 13.90±6.00 | 582.57±439.66 | 1 184.65±483.66 | 1 218.06±488.70 |
| PW组 | 40.56±13.45 | 515.75±143.49 | 20.63±9.56 | 17.15±6.19 | 149.17±65.12a | 1 159.00±402.40 | 1 058.73±483.70 |
| NMW1组 | 46.50±19.41 | 466.18±198.92 | 20.99±9.75 | 12.59±5.72 | 689.95±382.50b | 1 246.54±497.87 | 1 065.64±404.52 |
| NMW2组 | 45.97±17.79 | 547.28±191.38 | 18.14±8.17 | 17.76±4.94 | 955.92±198.93b | 1 375.15±574.86 | 741.00±381.18 |
| a: P＜0.05，与TP组比较；b: P＜0.05，与PW组比较 | |||||||
2.4 各组大鼠股骨远端松质骨定量结构参数的变化
Micro-CT结果显示：与NW组相比，NMW1组、NMW2组的骨表面积密度(BS/BV)显著降低(P＜0.05)；与PW组相比，NMW1组、NMW2组的骨表面积密度显著降低(P＜0.05)。其余各指标组间比较差异无统计学意义(表 3)。
| 组别 | BMD(mg/mm3) | BV/TV(%) | Conn.D(1/mm3) | BS/BV(1/mm) | SMI | Tb.N(1/mm) | Tb.Th(μm) | Tb.Sp(μm) |
| TP组 | 367.80±53.13 | 33.00±5.89 | 125.64±16.84 | 27.10±3.57 | 1.00±0.57 | 5.18±0.33 | 91.20±9.91 | 180.00±18.26 |
| NW组 | 361.66±38.07 | 37.86±2.73 | 123.40±19.17 | 28.53±3.02 | 0.41±0.20 | 5.24±0.55 | 87.10±7.56 | 182.90±25.63 |
| PW组 | 356.12±47.49 | 38.57±4.12 | 117.66±18.28 | 28.67±3.18 | 0.50±0.40 | 5.35±0.44 | 85.70±7.87 | 172.90±12.54 |
| NMW1组 | 391.38±19.61 | 34.13±8.20 | 117.03±27.59 | 24.76±0.77ab | 0.94±0.65 | 5.12±0.82 | 94.30±5.35 | 188.70±45.81 |
| NMW2组 | 391.46±17.15 | 32.14±6.90 | 124.87±23.39 | 24.71±2.27ab | 1.03±0.68 | 5.18±0.49 | 97.10±4.88 | 187.10±24.30 |
| a: P＜0.05，与NW组比较；b: P＜0.05，与PW组比较 | ||||||||
2.5 各组大鼠股骨生物力学指标的变化
股骨三点弯曲实验，各组间的最大载荷、杨氏模量、最大应力相比较差异无统计学意义(表 4)。
| 组别 | 最大载荷(N) | 杨氏模量(MPa) | 最大应力(MPa) |
| TP组 | 119.95±17.15 | 218.69±40.30 | 30.549±4.37 |
| NW组 | 115.40±14.64 | 203.61±27.77 | 29.391±3.73 |
| PW组 | 113.41±14.25 | 205.00±27.53 | 28.880±3.63 |
| NMW1组 | 118.73±10.24 | 213.76±20.31 | 30.236±2.61 |
| NMW2组 | 126.65±13.99 | 218.67±32.62 | 32.257±3.56 |
2.6 骨钙素、骨表面积密度与水质主要指标相关性分析
将上述观察指标中具有统计学差异的骨钙素、骨表面积密度与水质指标进行Spearman相关性分析。结果显示：骨钙素与水中多数矿物质显著正相关，并与溶解性总固体、总硬度、钙、镁、钾、硫酸根有较强正相关(r>0.5, P＜0.05)；骨表面积密度与溶解性总固体、总硬度、钙、镁、钾的有较强的负相关(r＜-0.05, P＜0.05，表 5)。
| 指标 | pH | TDS | TH | Ca2+ | Mg2+ | Na+ | K+ | SO42- | Cl- | HCO3- | P | H2SiO3 |
| BGP | ||||||||||||
| r | 0.289b | 0.554a | 0.554a | 0.645a | 0.554a | 0.333b | 0.554a | 0.584a | 0.462a | 0.462a | 0.166 | 0.378a |
| P | 0.044 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.019 | 0.000 | 0.000 | 0.001 | 0.001 | 0.254 | 0.007 |
| BS/BV | ||||||||||||
| r | 0.045 | -0.522a | -0.522a | -0.524a | -0.522a | -0.229 | -0.522a | -0.423b | -0.404b | -0.404b | -0.222 | -0.266 |
| P | 0.793 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.179 | 0.001 | 0.010 | 0.015 | 0.015 | 0.193 | 0.116 |
| a: P＜0.01，b:P＜0.05 | ||||||||||||
3 讨论
近年来关于新型饮水(纯净水、矿泉水等)与骨骼健康的比较研究开始增多，但对儿童及青少年时期关注较少。对骨质疏松症的研究已明确其发病与儿童及青少年时期骨骼生长有直接的关系，从儿童及青少年开始预防骨质疏松(一级预防)已受到高度重视[10]。骨的生长发育是骨形成和骨吸收不断转换的过程, 骨量峰值前期骨形成大于骨吸收。SD大鼠在性成熟后，3~4月龄时骨形成和骨吸收活跃程度最高，骨量达到峰值[11]。本研究从骨代谢、骨微结构、骨生物力学等方面全面观察了天然矿物质含量不同的5种饮水对发育期大鼠骨骼生长的影响。
骨代谢生化指标分为骨形成标志物和骨吸收标志物，能够早期反映骨量的变化和动态反映整体骨重建，更能反映出骨代谢的病理生理变化[12-13]。骨钙素主要由成骨细胞合成并分泌，反映骨组织转换水平综合状态[14]。儿童及青少年骨组织代谢旺盛，成骨细胞生长活跃，骨转换更新加快，骨钙素水平升高[15-16]。本实验观察到骨钙素含量纯净水组显著低于自来水组和2种天然矿泉水组，提示饮用几乎不含矿物质的纯净水后，发育期大鼠成骨细胞活性及骨转换水平较自来水、矿泉水低，同时也有低于天然水组的趋势。
Micro-CT通过X线扫描和三维重建，是理想的研究骨形态学的工具，成为分析骨微观结构的新兴技术[17]。骨小梁结构改变对骨强度具有重要的影响。骨表面积密度(BS/BV)是骨表面积占骨总体积的比值，比值越大表明骨表面积大，骨小梁强度越弱。我们观察到天然水组和纯净水组的骨表面积密度显著高于两组天然矿泉水组；虽然也高于自来水组，但差异没有统计学意义。另外，骨密度、骨小梁厚度，2种矿泉水组也有高于其他3种水的趋势。本研究结果提示饮用富含矿物质的2种矿泉水更有利于发育期大鼠骨微结构发育。
骨生物力学性能的检测是评价骨质量不可缺少的指标，是骨质量和骨结构的综合反映[18]。饮用5种水3个月后，各组间大鼠股骨的生物力学指标并没有表现出统计学差异，可能与本实验观察时间不够有关。本课题组前期研究发现，SD大鼠多代连续饮用4种矿物质含量不同的水后，矿物质含量低的3种水可致骨力学性能降低[7]。
本研究除饮水外，其他条件均一致。相关性分析发现骨钙素、骨表面积密度与水中多数矿物质显著相关，并与溶解性总固体、钙、镁等相关性较强。本研究发现纯净水组大鼠的骨生长水平较低，可能是由于长期饮用不含矿物元素的纯净水可以改变细胞内、外液的分子组成，钠、钾、钙、镁和其他微量元素通过尿液、粪便和汗水途径排出体外，会诱发电解质紊乱如低镁血症和低钙血症[19-20]。本课题组前期研究亦发现长期饮用纯净水可导致雌鼠的血清镁含量降低[21]，而众所周知，钙、镁等矿物质摄入对于骨骼的矿化极为重要。天然矿泉水可以作为机体摄入钙、镁及其他矿物质的重要来源，尤其是钙含量大于150 mg/L、镁含量大于50 mg/L的天然矿泉水[5]。Meunier等[22]发现富钙矿泉水可以降低骨更新周期，对老年性骨质丢失具有显著抑制作用。Guillemant等[23]在青年男性水干预实验中发现，饮用钙含量176 mg/L的矿泉水能够迅速降低PTH分泌和骨吸收。本研究发现富含钙、镁的两种矿泉水能够提高发育期大鼠骨钙素水平和骨小梁强度，利于骨骼生长。
综上所述，本研究在发育期这个阶段观察了饮用5种水后大鼠骨骼生长的变化，相比较而言，长期饮用自来水和天然水对骨生长指标的影响差异不明显，饮用纯净水后大鼠骨生长水平较低，而富含矿物质的矿泉水对骨骼生长较有利。本研究还发现众多观察指标中，骨钙素和骨小梁强度是对水质变化较为敏感的指标。饮水中矿物质含量及比例各有不同，水质的健康效应又容易受到食物等多种复杂因素的干扰，需要长时间的观察才能显现出来，水中矿物质适宜的水平及组成的确定还需要进一步的研究。
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