现代社会各种负性应激所导致的情感精神疾病(如焦虑症等)发病率逐年上升[1]，但目前对其发病机制仍不清。应激是引起焦虑障碍的一种重要影响因素，在应激条件下，内环境平衡易受到破坏，其中下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)轴的调节是维持内环境稳定的重要机制之一[2]。临床研究表明，焦虑症患者存在明显的HPA轴功能异常，HPA轴调节在其他精神疾病的发生发展中也起着关键作用，如抑郁症[3]、阿尔茨海默病[4]、帕金森病[5]等都有报道。HPA轴发挥正常生理作用与轴本身功能及轴的负反馈调节都密不可分，并相互影响。本实验通过建立大鼠焦虑模型，研究HPA轴功能紊乱是与轴本身异常还是轴负反馈调节作用改变相关，以期为寻找与焦虑症发病机制相关的因素提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 主要材料动物：SD健康雄性大鼠46只，体质量180~220 g(动物及饲料由重庆医科大学实验动物研究中心提供)。仪器：高架十字迷宫实验和旷场实验视频跟踪系统及软件数据分析仪(第三军医大学提供)。试剂：大鼠促肾上腺激素(adrenocorticotrophichormone，ACTH)和皮质酮水平(corticosterone，CORT)ELISA试剂盒由上海Elisa生物技术有限公司提供；GR抗体、β-actin抗体购自Abcam公司。SDS配胶试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。
1.2 方法 1.2.1 动物饲养及分组实验期间，饲养温度(24±2) ℃、湿度50%~60%，12 h昼夜循环，7: 00开灯，19: 00关灯，自由进食、饮水。实验分组前所有大鼠适应性饲养1周，然后随机分为对照组(n=20) 和模型组(n=26)。
1.2.2 造模方法对照组大鼠正常饲养，模型组大鼠用慢性不可预知的情绪应激方法造模。在文献[6]的方法的基础上给予改进，从造模第1天起，模型组大鼠开始接受不同应激源刺激，包括电击足底、禁水、禁食、热水浴(45 ℃左右)、冷水浴(4 ℃左右)、噪音(5 h)、频闪、摇床(10 min)、行为限制(1 h)、24 h光照、24 h黑暗、昼夜颠倒、空垫料和湿垫料等14种方法，每天安排2种强弱不等的应激源，避免相邻2 d方法重复、相邻周次顺序重复，以免造成大鼠规律性的适应，连续刺激4周。
1.3 行为学检测 1.3.1 一般状态每日观察大鼠毛发色泽、身体姿态、活动情况、精神状态和对外界的反应情况等。每周称量两组大鼠的体质量，并比较体质量的变化。
1.3.2 旷场实验采用50 cm×50 cm×30 cm实验木箱。在测试前1 d，把动物搬进测试室适应环境，测试开始后，每次放置大鼠头部固定朝向一侧。每只大鼠旷场活动10 min，计算机将自动记录下述指标：运动总距离、中央区活动时间百分比、中央区活动路程百分比、中央区活动时间、中央区活动路程和运动平均速度。
1.3.3 高架十字迷宫实验高架十字迷宫由两条开放臂(50 cm×10 cm)和两条封闭臂(50 cm×10 cm× 40 cm)组成，呈十字形交叉，中间由中央区连接(10 cm× 10 cm)，距离地面高50 cm，测试前1 d把动物搬进测试室适应环境。实验时，大鼠置于高架十字平台中央区域，头部正对其中一侧开放臂，每只大鼠迷宫时间5 min，计算机将自动记录下述指标：进入开放臂的次数(open arm entry，OE)、进入开放臂次数百分比、进入开放臂时间(open arm time，OT)、进入开放臂时间百分比。
1.4 血清ACTH和CORT测定造模结束后，分别收集对照组和模型组应激前后的颈部大血管血液。血液室温静置20~30 min，在4 ℃、3 000 r/min离心20 min后收集上清，用ELISA试剂盒检测血清中ACTH和CORT水平。
1.5 蛋白免疫印迹(Western blot检测)分别取两组大鼠新鲜海马、下丘脑、垂体和肾上腺组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心(14 000 r/min，4 ℃)，提取上清蛋白。BCA法测蛋白浓度，取总蛋白量为40 μg进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿电转法将蛋白转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭2 h, 加入一抗GR抗体，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜后加二抗, 常温孵育1 h，PBST洗膜后, 用ECL发光法显色，Image-Lab凝胶成像系统采集图像。
1.6 统计学分析计量资料数据以x±s表示，应用SPSS 17.0统计软件，进行独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 行为学检测 2.1.1 一般状态观察刺激1周后，模型组大鼠开始出现精神紧张，随着时间的延长，大鼠逐渐变得警惕性高，稍有声响即成防御姿态。造模结束后，模型组大鼠大多表现为毛发凌乱，易激惹，喜蜷伏于角落，活动度较对照组明显减少。
2.1.2 大鼠体质量2周后，模型组大鼠的体质量增长明显低于对照组，差异有统计意义(P < 0.05，P < 0.01，表 1)。
| 组别 | 应激前 | 刺激第1周 | 刺激第2周 | 刺激第3周 | 刺激第4周 |
| 对照组 | 196.35±10.65 | 223.70±8.05 | 238.96±15.13 | 244.02±14.26 | 252.90±15.13 |
| 模型组 | 196.50±10.32 | 218.50±13.78 | 198.93±12.29a | 194.38±11.12a | 208.63±13.47a |
| a：P < 0.01，与对照组比较 | |||||
2.1.3 旷场实验
与对照组相比，模型组大鼠运动总路程、中央活动路程、中央活动路程百分比、中央活动时间、中央活动时间百分比和运动平均速度均明显降低(P < 0.01, 表 2)。
| 组别 | 总路程(cm) | 中央活动路程(cm) | 中央活动时间(s) | 平均速度(s) | 中央活动时间(%) |
| 对照组 | 4 674.76±1 858.67 | 92.34±55.27 | 7.20±2.49 | 7.79 ±3.09 | 8.53±5.58 |
| 模型组 | 2 837.73±1 819.81a | 16.55±15.81a | 1.99±2.49a | 4.72±2.53a | 4.69±6.69a |
| a：P < 0.01，与对照组比较 | |||||
2.1.4 高架十字迷宫实验
与对照组相比，模型组大鼠进入开放臂的次数、进入开放臂次数百分比、进入开放臂时间和进入开放臂时间百分比均显著降低(P < 0.01，表 3)。
| 组别 | 进入开放臂的次数 | 进入开放臂次数百分比(%) | 进入开放臂时间(s) | 进入开放臂时间百分比(%) |
| 对照组 | 6.85±1.69 | 0.28±0.08 | 94.05±24.82 | 0.31± 0.07 |
| 模型组 | 3.54±1.86a | 0.12±0.07a | 53.54±22.80a | 0.17± 0.07a |
| a：P < 0.01，与对照组比较 | ||||
2.2 旷场应激对大鼠ACTH和CORT分泌的改变
如图 1所示，基础条件下，两组大鼠分泌ACTH和CORT差异无统计学意义(P > 0.05)。5 min旷场应激后，模型组大鼠分泌ACTH和CORT显著高于对照组(P < 0.01)。旷场应激前后相比，对照组大鼠分泌ACTH和CORT无明显增高(P > 0.05)，而模型组大鼠5 min旷场后分泌ACTH和CORT均显著增加(P < 0.01)。
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a：P < 0.01，与应激后对照组比较；b：P < 0.01，与应激前模型组比较 A：ACTH表达；B：CORT表达 图 1 旷场应激大鼠血清中ACTH和CORT表达水平测定 |
2.3 高架十字迷宫应激对大鼠ACTH和CORT分泌的改变
如图 2所示，基础条件下两组大鼠分泌ACTH和CORT差异无统计学意义(P > 0.05)。5 min高架十字迷宫应激后，模型组大鼠分泌ACTH和CORT显著高于对照组(P < 0.01)。应激前后相比，对照组大鼠分泌ACTH和CORT无明显增高(P > 0.05)，而模型组大鼠5 min应激后分泌ACTH和CORT均显著增加(P < 0.01)。
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a：P < 0.01，与应激后对照组比较；b：P < 0.01，与应激前模型组比较 A：ACTH表达；B：CORT表达 图 2 高架十字迷宫应激大鼠血清中ACTH和CORT表达水平测定 |
2.4 旷场和高架十字迷宫两种应激源对大鼠分泌ACTH和CORT的影响
如图 3所示，高架十字迷宫和旷场作为两种不同应激源刺激大鼠后，两组大鼠ACTH和CORT分泌均显著增加，但影响差异无统计学意义(P > 0.05)。
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| A：ACTH表达；B：CORT表达 图 3 旷场和高架十字迷宫应激大鼠血清中ACTH和CORT表达水平测定 |
2.5 Western blot检测GR的表达
如图 4所示，与对照组相比，模型组大鼠GR蛋白表达在海马、下丘脑和肾上腺组织中显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，在垂体中表达差异无统计学意义(P > 0.05)。表明，模型大鼠在应激条件下，HPA轴反应性增高与GR蛋白表达水平降低有关。
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| A：Western blot检测1~4：模型组大鼠；5~8：对照组大鼠；B:半定量分析a: P < 0.05，b: P < 0.01，与对照组比较 图 4 Western blot检测2组大鼠GR的表达 |
3 讨论
大量研究表明，机体受到强烈、持久的应激时，会增加患各类精神疾病的风险，其中焦虑症已成为一种普遍的精神疾病之一。研究发现焦虑情绪往往伴随着其他情感性精神疾病出现，大多与HPA轴功能紊乱有关[7]。有关报道[8]指出，机体遇到应激事件引起HPA轴功能紊乱会增加患抑郁症的风险，早期很多会出现焦虑行为，故本实验研究关于焦虑模型HPA轴的反应性。
行为学实验结果表明，通过改进后的方法可以成功建立大鼠焦虑模型。实验结果显示，基础条件下，两组大鼠分泌ACTH和CORT无明显差异，说明模型组大鼠HPA轴未因造模过程中的应激而引起功能亢进。造模结束后，选取相对温和的应激方式(旷场和高架)刺激大鼠。结果显示，在应激条件下，两组大鼠分泌ACTH和CORT均出现增加，且模型组增加显著高于对照组，说明较对照组而言，模型组大鼠在应激条件下，HPA轴敏感性增加，所以血清中出现了高浓度的ACTH和CORT。血清学结果显示，两种应激源对大鼠的影响无明显不同。表明焦虑模型大鼠HPA轴本身功能亢进与在应激条件下其轴呈高反应性无直接联系[9]。
压力条件下，应激源激活HPA轴，使糖皮质激素分泌增加，引发HPA轴的负反馈调节系统，进而帮助机体有效对抗外界应激。中枢神经系统内有两类皮质类固醇受体：盐皮质类固醇受体(MR)和GR，其中GR对皮质酮亲和力低，所以在应激条件下，主要是GR负责HPA轴负反馈调节[10]。大量研究表明，正常海马可抑制HPA轴的活性，促进应激状态下亢进的HPA轴尽快恢复到基础水平。海马是HPA轴应激反应的高位调节中枢，也是GR含量最高的脑区之一。本实验显示，模型组大鼠GR蛋白表达在海马、下丘脑和肾上腺均显著降低，说明焦虑模型大鼠HPA轴负反馈调节作用减弱，其中GR蛋白在海马中表达明显减少，也为HPA轴负反馈调节功能减弱提供了组织学依据。
有关报道[11]指出，焦虑往往发生在抑郁之前，实验也发现大鼠在造模过程中，大多先出现焦虑行为，而随着应激时间的延长，则可能出现抑郁行为。综上所述，大鼠在造模过程中，持续高水平的糖皮质激素可能会降低HPA轴GR蛋白的表达，所以造模结束后，模型组大鼠在应激条件下HPA轴出现高反应性，提示HPA轴负反馈调节功能受损。焦虑模型大鼠HPA轴调节异常与GR蛋白表达相关，与文献[12]报道相符。生活中小应激事件时常发生，多数人通过机体自身调节而不影响身体健康，若HPA轴异常，持续表现为高反应性，可能会引起机体分泌高水平的糖皮质激素，对神经星形胶质细胞造成过重的负担，增加患情感精神疾病的风险[13]，从而影响我们身心健康。
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