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焦虑模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴高反应性与糖皮质激素受体蛋白表达降低相关
余庆, 蒋雪, 李琴     
400016 重庆,重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室
[摘要] 目的 研究焦虑模型大鼠在应激条件时下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)轴呈高反应性是与轴本身功能亢进还是与反馈调节中糖皮质激素受体(glucocorticoid steroid receptor,GR)蛋白表达改变相关。方法 SD健康雄性大鼠随机分为对照组(n=20) 和焦虑模型组(n=26)。对照组正常饲养。采用不可预知的情绪应激方法建立大鼠焦虑模型。所有大鼠每周称量体质量。造模结束后,通过行为学鉴定造模是否成功。旷场和高架作为应激源刺激大鼠,测定两组大鼠血清中促肾上腺激素和皮质酮水平。Western blot检测GR蛋白在大鼠海马、下丘脑、垂体和肾上腺组织中的表达。结果 焦虑模型大鼠体质量增长率与对照组相比明显降低(P < 0.01)。高架十字迷宫实验和旷场实验显示:与对照组相比,模型组大鼠进入开臂次数、开臂停留时间、进入开臂次数百分比和进入开臂时间百分比均显著降低(P < 0.01);总路程、中央活动路程百分比和中央活动时间百分比均显著降低(P < 0.05,P < 0.01)。在基础条件下,两组大鼠分泌促肾上腺激素和皮质酮差异无统计学意义(P > 0.05);而应激条件下,模型组大鼠分泌两种激素显著高于对照组(P < 0.01)。与对照组比较,模型组在大鼠海马、下丘脑和肾上腺组织中GR蛋白表达显著降低(P < 0.05,P < 0.01),而在垂体中表达差异无统计学意义(P > 0.05)。结论 焦虑模型大鼠在应激条件下,HPA轴反应性增加与GR所介导的负反馈调节作用减弱有关。
[关键词] 焦虑模型     高架十字迷宫     旷场实验     促肾上腺激素     皮质酮     糖皮质激素受体    
Hyperactivity of hypothalamus-pituitary-adrenalaxis is associated with reduced expression of glucocorticoid steroid receptor in a rat model of anxiety
YU Qing , JIANG Xue , LI Qin     
Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
Supported by the Foundation of Chongqing Science and Technology Committee (CSTC2016jcyjA0220)
Corresponding author: JIANG Xue, E-mail: jiangxue868@sina.com
[Abstract] Objective To determine whether the hyperactivity of the hypothalamus-pituitary-adrenal(HPA) axis in response to stress is associated with the hyperfunction of the HPA axis or with the feedback regulation of glucocorticoid steroid receptor (GR) expression in rat model of anxiety. Methods Healthy male SD rats were randomly divided into control group(n=20) without any stimulation and anxiety model group(n=26) exposed to unpredictable emotional stress. All the rats were weighed once a week and at the end of the stimulus, and the behavioral changes of the rats were observed in elevated plus-maze (EPM) and open-field tests. Serum levels of adrenocorticotropic hormone(ACTH) and corticosterone were measured in the rats following stimulation with open-field and EPM as the stressors, and the expression of GR in the hippocampal, hypothalamic, pituitary and adrenal tissues was detected with Western blotting. Results The rat models of anxiety showed a significantly lower rate of body weight increase than the control rats (P < 0.01). The rats with anxiety exhibited a significantly lower number and a lower percentage of open arm entry, shorter and lower percentage of retention time in the open arm (P < 0.01), shorter total distance and central time, and lower central distance percentage in the open-field test (P < 0.05, P < 0.01). No significant differences were found in the serum levels of ACTH or corticosterone between the 2 groups at baseline, but after stress stimulation, their levels became obviously higher in the model group than in the control group(P < 0.01). The protein level of GR was significantly reduced in the hypothalamic(P < 0.05) and adrenal tissues (P < 0.01) in the model group as compared with the control group, but no significant difference was found in GR level in the pituitary tissue between the 2 groups (P > 0.05). Conclusion The hyperactivity of the HPA axis under stress is associated with the attenuation of GR-mediated negative feedback regulation in rat models of anxiety.
[Key words] anxiety model     elevated plus-maze test     open-field test     adrenocorticotrophic hormone     corticosterone     glucocorticoid receptor    

现代社会各种负性应激所导致的情感精神疾病(如焦虑症等)发病率逐年上升[1],但目前对其发病机制仍不清。应激是引起焦虑障碍的一种重要影响因素,在应激条件下,内环境平衡易受到破坏,其中下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal,HPA)轴的调节是维持内环境稳定的重要机制之一[2]。临床研究表明,焦虑症患者存在明显的HPA轴功能异常,HPA轴调节在其他精神疾病的发生发展中也起着关键作用,如抑郁症[3]、阿尔茨海默病[4]、帕金森病[5]等都有报道。HPA轴发挥正常生理作用与轴本身功能及轴的负反馈调节都密不可分,并相互影响。本实验通过建立大鼠焦虑模型,研究HPA轴功能紊乱是与轴本身异常还是轴负反馈调节作用改变相关,以期为寻找与焦虑症发病机制相关的因素提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要材料

动物:SD健康雄性大鼠46只,体质量180~220 g(动物及饲料由重庆医科大学实验动物研究中心提供)。仪器:高架十字迷宫实验和旷场实验视频跟踪系统及软件数据分析仪(第三军医大学提供)。试剂:大鼠促肾上腺激素(adrenocorticotrophichormone,ACTH)和皮质酮水平(corticosterone,CORT)ELISA试剂盒由上海Elisa生物技术有限公司提供;GR抗体、β-actin抗体购自Abcam公司。SDS配胶试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物饲养及分组

实验期间,饲养温度(24±2) ℃、湿度50%~60%,12 h昼夜循环,7: 00开灯,19: 00关灯,自由进食、饮水。实验分组前所有大鼠适应性饲养1周,然后随机分为对照组(n=20) 和模型组(n=26)。

1.2.2 造模方法

对照组大鼠正常饲养,模型组大鼠用慢性不可预知的情绪应激方法造模。在文献[6]的方法的基础上给予改进,从造模第1天起,模型组大鼠开始接受不同应激源刺激,包括电击足底、禁水、禁食、热水浴(45 ℃左右)、冷水浴(4 ℃左右)、噪音(5 h)、频闪、摇床(10 min)、行为限制(1 h)、24 h光照、24 h黑暗、昼夜颠倒、空垫料和湿垫料等14种方法,每天安排2种强弱不等的应激源,避免相邻2 d方法重复、相邻周次顺序重复,以免造成大鼠规律性的适应,连续刺激4周。

1.3 行为学检测

1.3.1 一般状态

每日观察大鼠毛发色泽、身体姿态、活动情况、精神状态和对外界的反应情况等。每周称量两组大鼠的体质量,并比较体质量的变化。

1.3.2 旷场实验

采用50 cm×50 cm×30 cm实验木箱。在测试前1 d,把动物搬进测试室适应环境,测试开始后,每次放置大鼠头部固定朝向一侧。每只大鼠旷场活动10 min,计算机将自动记录下述指标:运动总距离、中央区活动时间百分比、中央区活动路程百分比、中央区活动时间、中央区活动路程和运动平均速度。

1.3.3 高架十字迷宫实验

高架十字迷宫由两条开放臂(50 cm×10 cm)和两条封闭臂(50 cm×10 cm× 40 cm)组成,呈十字形交叉,中间由中央区连接(10 cm× 10 cm),距离地面高50 cm,测试前1 d把动物搬进测试室适应环境。实验时,大鼠置于高架十字平台中央区域,头部正对其中一侧开放臂,每只大鼠迷宫时间5 min,计算机将自动记录下述指标:进入开放臂的次数(open arm entry,OE)、进入开放臂次数百分比、进入开放臂时间(open arm time,OT)、进入开放臂时间百分比。

1.4 血清ACTH和CORT测定

造模结束后,分别收集对照组和模型组应激前后的颈部大血管血液。血液室温静置20~30 min,在4 ℃、3 000 r/min离心20 min后收集上清,用ELISA试剂盒检测血清中ACTH和CORT水平。

1.5 蛋白免疫印迹(Western blot检测)

分别取两组大鼠新鲜海马、下丘脑、垂体和肾上腺组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心(14 000 r/min,4 ℃),提取上清蛋白。BCA法测蛋白浓度,取总蛋白量为40 μg进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,湿电转法将蛋白转移到PVDF膜上,5%的脱脂奶粉封闭2 h, 加入一抗GR抗体,4 ℃孵育过夜,PBST洗膜后加二抗, 常温孵育1 h,PBST洗膜后, 用ECL发光法显色,Image-Lab凝胶成像系统采集图像。

1.6 统计学分析

计量资料数据以x±s表示,应用SPSS 17.0统计软件,进行独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 行为学检测

2.1.1 一般状态观察

刺激1周后,模型组大鼠开始出现精神紧张,随着时间的延长,大鼠逐渐变得警惕性高,稍有声响即成防御姿态。造模结束后,模型组大鼠大多表现为毛发凌乱,易激惹,喜蜷伏于角落,活动度较对照组明显减少。

2.1.2 大鼠体质量

2周后,模型组大鼠的体质量增长明显低于对照组,差异有统计意义(P < 0.05,P < 0.01,表 1)。

表 1 两组大鼠体质量变化比较[n=20,(x±s)g]
组别 应激前 刺激第1周 刺激第2周 刺激第3周 刺激第4周
对照组 196.35±10.65 223.70±8.05 238.96±15.13 244.02±14.26 252.90±15.13
模型组 196.50±10.32 218.50±13.78 198.93±12.29a 194.38±11.12a 208.63±13.47a
a:P < 0.01,与对照组比较

2.1.3 旷场实验

与对照组相比,模型组大鼠运动总路程、中央活动路程、中央活动路程百分比、中央活动时间、中央活动时间百分比和运动平均速度均明显降低(P < 0.01, 表 2)。

表 2 两组大鼠旷场实验结果(n=20,x±s)
组别 总路程(cm) 中央活动路程(cm) 中央活动时间(s) 平均速度(s) 中央活动时间(%)
对照组 4 674.76±1 858.67 92.34±55.27 7.20±2.49 7.79 ±3.09 8.53±5.58
模型组 2 837.73±1 819.81a 16.55±15.81a 1.99±2.49a 4.72±2.53a 4.69±6.69a
a:P < 0.01,与对照组比较

2.1.4 高架十字迷宫实验

与对照组相比,模型组大鼠进入开放臂的次数、进入开放臂次数百分比、进入开放臂时间和进入开放臂时间百分比均显著降低(P < 0.01,表 3)。

表 3 两组大鼠高架十字迷宫实验结果(n=20,x±s)
组别 进入开放臂的次数 进入开放臂次数百分比(%) 进入开放臂时间(s) 进入开放臂时间百分比(%)
对照组 6.85±1.69 0.28±0.08 94.05±24.82 0.31± 0.07
模型组 3.54±1.86a 0.12±0.07a 53.54±22.80a 0.17± 0.07a
a:P < 0.01,与对照组比较

2.2 旷场应激对大鼠ACTH和CORT分泌的改变

图 1所示,基础条件下,两组大鼠分泌ACTH和CORT差异无统计学意义(P > 0.05)。5 min旷场应激后,模型组大鼠分泌ACTH和CORT显著高于对照组(P < 0.01)。旷场应激前后相比,对照组大鼠分泌ACTH和CORT无明显增高(P > 0.05),而模型组大鼠5 min旷场后分泌ACTH和CORT均显著增加(P < 0.01)。

a:P < 0.01,与应激后对照组比较;b:P < 0.01,与应激前模型组比较
A:ACTH表达;B:CORT表达
图 1 旷场应激大鼠血清中ACTH和CORT表达水平测定

2.3 高架十字迷宫应激对大鼠ACTH和CORT分泌的改变

图 2所示,基础条件下两组大鼠分泌ACTH和CORT差异无统计学意义(P > 0.05)。5 min高架十字迷宫应激后,模型组大鼠分泌ACTH和CORT显著高于对照组(P < 0.01)。应激前后相比,对照组大鼠分泌ACTH和CORT无明显增高(P > 0.05),而模型组大鼠5 min应激后分泌ACTH和CORT均显著增加(P < 0.01)。

a:P < 0.01,与应激后对照组比较;b:P < 0.01,与应激前模型组比较
A:ACTH表达;B:CORT表达
图 2 高架十字迷宫应激大鼠血清中ACTH和CORT表达水平测定

2.4 旷场和高架十字迷宫两种应激源对大鼠分泌ACTH和CORT的影响

图 3所示,高架十字迷宫和旷场作为两种不同应激源刺激大鼠后,两组大鼠ACTH和CORT分泌均显著增加,但影响差异无统计学意义(P > 0.05)。

A:ACTH表达;B:CORT表达 图 3 旷场和高架十字迷宫应激大鼠血清中ACTH和CORT表达水平测定

2.5 Western blot检测GR的表达

图 4所示,与对照组相比,模型组大鼠GR蛋白表达在海马、下丘脑和肾上腺组织中显著降低(P < 0.05,P < 0.01),在垂体中表达差异无统计学意义(P > 0.05)。表明,模型大鼠在应激条件下,HPA轴反应性增高与GR蛋白表达水平降低有关。

A:Western blot检测1~4:模型组大鼠;5~8:对照组大鼠;B:半定量分析a: P < 0.05,b: P < 0.01,与对照组比较 图 4 Western blot检测2组大鼠GR的表达

3 讨论

大量研究表明,机体受到强烈、持久的应激时,会增加患各类精神疾病的风险,其中焦虑症已成为一种普遍的精神疾病之一。研究发现焦虑情绪往往伴随着其他情感性精神疾病出现,大多与HPA轴功能紊乱有关[7]。有关报道[8]指出,机体遇到应激事件引起HPA轴功能紊乱会增加患抑郁症的风险,早期很多会出现焦虑行为,故本实验研究关于焦虑模型HPA轴的反应性。

行为学实验结果表明,通过改进后的方法可以成功建立大鼠焦虑模型。实验结果显示,基础条件下,两组大鼠分泌ACTH和CORT无明显差异,说明模型组大鼠HPA轴未因造模过程中的应激而引起功能亢进。造模结束后,选取相对温和的应激方式(旷场和高架)刺激大鼠。结果显示,在应激条件下,两组大鼠分泌ACTH和CORT均出现增加,且模型组增加显著高于对照组,说明较对照组而言,模型组大鼠在应激条件下,HPA轴敏感性增加,所以血清中出现了高浓度的ACTH和CORT。血清学结果显示,两种应激源对大鼠的影响无明显不同。表明焦虑模型大鼠HPA轴本身功能亢进与在应激条件下其轴呈高反应性无直接联系[9]

压力条件下,应激源激活HPA轴,使糖皮质激素分泌增加,引发HPA轴的负反馈调节系统,进而帮助机体有效对抗外界应激。中枢神经系统内有两类皮质类固醇受体:盐皮质类固醇受体(MR)和GR,其中GR对皮质酮亲和力低,所以在应激条件下,主要是GR负责HPA轴负反馈调节[10]。大量研究表明,正常海马可抑制HPA轴的活性,促进应激状态下亢进的HPA轴尽快恢复到基础水平。海马是HPA轴应激反应的高位调节中枢,也是GR含量最高的脑区之一。本实验显示,模型组大鼠GR蛋白表达在海马、下丘脑和肾上腺均显著降低,说明焦虑模型大鼠HPA轴负反馈调节作用减弱,其中GR蛋白在海马中表达明显减少,也为HPA轴负反馈调节功能减弱提供了组织学依据。

有关报道[11]指出,焦虑往往发生在抑郁之前,实验也发现大鼠在造模过程中,大多先出现焦虑行为,而随着应激时间的延长,则可能出现抑郁行为。综上所述,大鼠在造模过程中,持续高水平的糖皮质激素可能会降低HPA轴GR蛋白的表达,所以造模结束后,模型组大鼠在应激条件下HPA轴出现高反应性,提示HPA轴负反馈调节功能受损。焦虑模型大鼠HPA轴调节异常与GR蛋白表达相关,与文献[12]报道相符。生活中小应激事件时常发生,多数人通过机体自身调节而不影响身体健康,若HPA轴异常,持续表现为高反应性,可能会引起机体分泌高水平的糖皮质激素,对神经星形胶质细胞造成过重的负担,增加患情感精神疾病的风险[13],从而影响我们身心健康。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201611238
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余庆, 蒋雪, 李琴.
YU Qing, JIANG Xue, LI Qin.
焦虑模型大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴高反应性与糖皮质激素受体蛋白表达降低相关
Hyperactivity of hypothalamus-pituitary-adrenalaxis is associated with reduced expression of glucocorticoid steroid receptor in a rat model of anxiety
第三军医大学学报, 2017, 39(14): 1464-1468
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(14): 1464-1468
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201611238

文章历史

收稿: 2016-11-28
修回: 2017-02-19

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