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心室压力超负荷早期心肌纤维化的动态病理学变化
孟永胜, 蹇朝, 朱昀, 刘超, 姜云瀚, 罗桂平, 朱雨, 唐富琴, 肖颖彬     
400037 重庆,第三军医大学新桥医院全军心血管外科研究所
[摘要] 目的 通过主动脉弓缩窄建立小鼠心室压力超负荷模型,探讨在心室压力超负荷早期心肌纤维化的动态病理学变化。 方法 选用10周龄、体质量23 ~ 25 g的雄性C57BL/6J小鼠40只,随机分为4组(n = 10):① 假手术组(SHAM组)、② 缩窄3 d组(TAC3D组)、③ 缩窄7 d组(TAC7D组)、④ 缩窄14 d组(TAC14D组)。各缩窄组小鼠行主动脉弓缩窄术,假手术组除不缩窄主动脉弓部,其他操作同各缩窄组。心脏导管检测小鼠心脏功能变化情况;采用心脏体质量比、心肌细胞直径大小等指标评价小鼠心肌结构代偿性变化情况;Masson染色观察小鼠心肌纤维化变化情况。 结果 ① 与假手术组相比,各缩窄组射血分数无显著改变(P>0.05);② 与假手术组相比,各缩窄组心体比显著增加,心肌细胞直径显著增大[SHAM组、TAC3D组、TAC7D组、TAC14D组心肌细胞直径依次为(13.56 ± 0. 24)、(18.02 ± 0.52)、(18.76 ± 0.96)、(21.20 ± 1.85)μm,P<0.05]。③ 与假手术组相比,各缩窄组心肌管周纤维化程度显著增加,且随缩窄时间延长而加重[ SHAM组、TAC3D组、TAC7D组、TAC14D组血管周围纤维化面积与血管面积比依次为(0.18 ± 0.02)、(0.37 ± 0.02)、(1.22 ± 0.08)、(2.05 ± 0.12),P<0.05]。 结论 在心室压力超负荷早期,心肌纤维化主要出现于血管周围,且纤维化程度随缩窄时间延长而逐渐加重。
[关键词] 心肌肥厚     压力超负荷     心肌纤维化    
Dynamic pathological changes of myocardial fibrosis in mice in an early stage of ventricular pressure overload
Meng Yongsheng , Jian Zhao , Zhu Yun , Liu Chao , Jiang Yunhan , Luo Guiping , Zhu Yu , Tang Fuqin , Xiao Yingbin     
Institute of Cardiaouscular Surgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China
Corresponding author: Xiao Yingbin, E-mail: xiaoyb@vip.sina.com
[Abstract] Objective To investigate the dynamic pathological changes of myocardial fibrosis in an early stage of ventricular pressure overload in a mouse model of transverse aortic constriction (TAC). Methods Forty male C57BL/6J mice were randomly divided into the sham-operated group and 3 TAC groups for observation at 3, 7, and 14 d after TAC (TAC3D, TAC7D and TAC14D groups, respectively). Cardiac function of the mice was examined with cardiac catheter measurement. The myocardial structure changes were evaluated based on the heart weight index and the myocardial cell diameter, and the changes in the myocardial fibers were observed with the Masson staining. Results Compared with those in the sham-operated group, the mice in the TAC groups showed no significant changes in the ejection fraction (P > 0.05), but the heart-to-body weight ratio and myocyte width were increased obviously (the myocyte width in sham, TAC3D, TAC7D and TAC14D groups was 13.56 ± 0.24, 18.02 ± 0.52, 18.76 ± 0.96, and 21.20 ± 1.85 μm, respectively, P < 0.05). Compared with that in the sham-operated group, the severity of perivascular fibrosis increased significantly in the TAC groups and exacerbated as the TAC time extended (the perivascular fibrosis area/vascular area ratios in the 4 groups were 0.18 ± 0.02, 0.37 ± 0.02, 1.22 ± 0. 08, and 2.05 ± 0.12, respectively, P < 0.05). Conclusion Perivascular fibrosis is the major pathological finding in the early stage of ventricular pressure overload in mice and deteriorates progressively with the extension of TAC time.
[Key words] myocardial hypertrophy     pressure overload     myocardial fibrosis    

心室压力超负荷常见于高血压、主动脉瓣狭窄等心血管疾病。慢性心室压力超负荷会导致心肌肥厚[1],其主要病理特点是心肌纤维化[2]。目前,临床上对于心肌纤维化尚缺乏有效的干预措施[3]。主要原因是由于心肌纤维化的形成和发展机制尚不明确。因此,研究心肌纤维化的发生发展机制对干预和治疗心肌肥厚具有重要意义。

目前,在心肌纤维化研究方面,文献报道多集中于心脏功能失代偿阶段,很少研究涉及早期代偿阶段心肌纤维化的形成和发展。因此,明确心室压力超负荷早期心肌纤维化的发生发展对于进一步认识心肌纤维化的形成和发展,以及早期干预心肌纤维化十分重要。小鼠主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)是心室压力超负荷的经典动物模型,本研究使用该动物模型探究压力超负荷早期心肌纤维化的动态病理学变化。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组

选用10周龄、体质量23~25 g的雄性C57BL/6J小鼠,由北京华阜康生物技术有限公司购买,第三军医大学新桥医院实验动物中心喂养。将上述40只小鼠随机分为4组(n=10):① 假手术组(SHAM组)、② 缩窄3 d组(TAC3D组)、③ 缩窄7 d组(TAC7D组)、④ 缩窄14 d组(TAC14D组)。

1.1.2 主要试剂和仪器

小动物呼吸机,小动物麻醉机,体式显微镜,显微手术器械,27G缩窄针,冰冻切片机,石蜡切片机,HE染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),Masson染色试剂盒(南京建成科技有限公司),Millar心脏导管,麦胚凝集素等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠主动脉弓缩窄模型

具体手术方法参照文献[4]并加以改进:采用异氟烷吸入诱导麻醉,夹持小鼠四肢无明显反应后,使小鼠仰卧位固定于恒温垫上,面罩吸入麻醉,备皮消毒后,剪开颈部和胸部正中的皮肤,分离气管,经气管插管与小动物呼吸机连接(潮气量0.5 mL/次、呼吸频率105~110/min)。打开胸腔,分离胸腺,游离主动脉弓部,在左颈总动脉与头臂干之间的主动脉弓部垫以27G缩窄针,以4-0丝线将血管与针头一起扎紧,迅速抽出垫针,关胸,待小鼠自主呼吸恢复后脱机,拔出气管插管,缝合气管,最后缝合皮肤,手术切口处涂覆碘伏。假手术组除不做缩窄外,其余操作均与主动脉弓缩窄组相同。

1.2.2 Millar压力容积导管检测小鼠心脏功能

将Millar导管放入装有温生理盐水的烧杯中,应用Lab Chart Pro8.0专业版软件对仪器进行压力、容积校正。采用异氟烷吸入诱导麻醉,夹持小鼠四肢无明显反应后,使小鼠仰卧位固定于恒温垫上,面罩吸入麻醉,备皮消毒后,剪开颈部和胸部正中的皮肤,分离气管,经气管插管与小动物呼吸机连接(潮气量0.5 mL/次、呼吸频率105~110/min)。游离右颈总动脉,用4-0丝线结扎远心端。用4-0丝线结扎近心端并剪口,迅速插入Millar压力容积导管(SPR-839),松解近心端结扎的丝线并将导管迅速送至左心室,连接压力容积导管与MP150 16导生理记录仪,调整导管位置,收集记录小鼠心室内压力、心室内容积等数据。检测小鼠在体左心室压力容积(pressure-volume,P-V)关系,记录稳定状态下P-V波形变化,待波形平稳后进行盐水滴定。游离小鼠右侧颈静脉,用30G胰岛素针往颈静脉内注射30% NaCl溶液5 μL,记录P-V波形变化,重复3次。上述各项校正结束后,选取波形稳定的P-V环,计算射血分数(ejection fraction,EF, %)。具体操作参照文献[5-6]。

1.2.3 标本采集

称量各组小鼠体质量(body weight,BW,g)后以颈椎脱臼法处死,摘取心脏后称量心脏质量(heart weight,HW,mg),计算心脏体质量比(BW/HW,mg/g)。

1.2.4 心肌组织病理学检查

取心肌组织迅速冰冻切片,冰冻切片用4%中性多聚甲醛固定后行麦胚凝集素免疫荧光染色,剩余心肌组织用4%中性多聚甲醛固定48 h后经脱水透明处理后行石蜡包埋切片,行Masson染色,具体步骤参照试剂盒说明书。

1.3 统计学方法

应用Graph Pad Prism 6统计软件进行数据处理,计量资料以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。

2 结果 2.1 小鼠模型的存活率及术后并发症

主动脉弓缩窄术中及术后1周死亡率为16.7%(5/30),10只假手术组术后无1例死亡。实验发现,主动脉弓破裂、气道堵塞及大血管损伤为主动脉弓缩窄术中及术后导致小鼠死亡的主要原因。

2.2 心室压力超负荷早期小鼠心脏功能变化情况

小鼠心脏导管检测结果显示:与假手术组相比,各缩窄组小鼠射血分数差异无统计学意义(P > 0.05,图 1)。

图 1 心脏导管检测各组小鼠心脏射血分数变化情况(n=5,x±s)

2.3 心室压力超负荷早期小鼠心肌结构代偿性变化情况

采用麦胚凝集素标记心肌细胞膜,冰冻切片免疫荧光染色发现,与假手术组比较,各缩窄组心肌细胞直径均显著增大(P < 0.05,图 23A)。与假手术组比较,各缩窄组HW/BW均显著增大(P < 0.05),如图 3B所示。

A:SHAM组;B:TAC3D组;C:TAC7D组;D:TAC14D组 图 2 麦胚凝集素标记小鼠心肌细胞膜冰冻切片免疫荧光染色观察结果 (荧光显微镜×400)

A:心肌细胞直径;B:心脏体质量比 a: P < 0.05,与SHAM组比较 图 3 小鼠心肌结构代偿性变化情况 (n=5,x±s)

2.4 心室压力超负荷早期心肌纤维化动态病理学变化情况

Masson染色结果显示,心室压力超负荷早期心肌纤维化主要出现于血管周围。与假手术组相比,各缩窄组均出现明显血管周围纤维化(P < 0.05),且缩窄后3、7、14 d血管周围纤维化程度呈加剧趋势(图 45)。

A:SHAM组;B:TAC3D组;C:TAC7D组;D:TAC14D组 图 4 Masson染色观察各组小鼠心肌纤维化情况 (LM ×100)

a: P < 0.05, 与SHAM组比较 图 5 各组小鼠心肌血管周围纤维化面积与血管面积比 (n=5,x±s)

3 讨论

心肌肥厚是目前心血管疾病致死的主要因素之一[7]。心肌纤维化作为心肌肥厚的主要病理学特点,探究其发生发展机制是目前心血管疾病研究的重要目标。压力超负荷所引起的病理性心肌肥厚是一个从代偿阶段逐渐进展为失代偿阶段,最终导致心力衰竭的连续过程[7]。不同阶段的病理性心肌肥厚,其心肌纤维化程度存在显著差异[2, 8],因此,其相应阶段动物模型的建立对于心肌纤维化进展的研究具有重要指导作用。

小鼠主动脉弓缩窄所致病理性心肌肥厚是目前最常见的研究心肌肥厚及心力衰竭的动物模型[4]。本模型的成功建立需要熟练稳定的显微外科操作,术后小鼠的成活率是模型建立的关键之一。本实验中的建模成活率为83.3%,与国内外相关文献报道[9]相比,属较为理想的成活率,这为后续实验工作奠定了良好基础。另一个决定模型成败的关键是主动脉弓缩窄程度[9],本实验采用27G缩窄针对小鼠主动脉弓进行缩窄,缩窄程度为65%~75%,为重度缩窄。不同的缩窄程度出现心肌肥厚的程度和时间窗不同。根据文献报道[9-10],重度缩窄在术后3天即可出现代偿性的心肌肥厚。

目前,对心肌纤维化的研究主要集中在心肌纤维化进程的中晚期阶段,心肌纤维化严重,心脏功能多处于失代偿阶段。而心脏早期代偿阶段的心肌纤维化鲜有研究报道。临床研究中发现,早期干预心肌肥厚能够降低患者的病死率[11]。因此,明确早期代偿阶段的心肌纤维化的发生发展的动态变化对进一步认识心肌纤维化有重要作用,同时可以为早期干预心肌纤维化提供理论基础。

在本实验中,为研究早期心肌纤维化的形成发展,我们选取主动脉弓缩窄2周内的小鼠作为研究对象。我们研究发现,这一阶段的小鼠心脏功能处于代偿阶段,而心肌结构却已经出现了显著的改变。在术后3天,小鼠心脏体质量比和心肌细胞显著变大,且术后7、14天继续增大。

本实验发现在心室压力超负荷早期代偿阶段,心肌纤维化主要出现于血管周围,这与中晚期心肌纤维化主要弥散于心肌间质的病理形态有着显著差异。在压力超负荷早期,心功能处于代偿状态,心肌结构发生代偿性的变化,心脏体质量比增加,心肌细胞肥大,心肌纤维化起源于血管周围,并呈逐渐加剧趋势发展,这一显著的病理形态学改变在既往的研究中尚未明确报道。有研究发现,射血分数保留心脏衰竭的病理特点之一也是心肌血管周围纤维化[12]。而射血分数保留心衰常见于高血压、主动脉瓣狭窄等压力负荷增加的心血管疾病,并且如未及时干预,射血分数保留的心衰也终将进展为射血分数降低的心衰。所以,我们认为在压力超负荷早期代偿阶段干预血管周围纤维化可能是减缓心肌纤维化进程的关键。

因此,本模型的建立为心肌纤维化的机制研究和早期干预研究奠定了良好的基础。关于心室压力超负荷所致心肌纤维化的早期干预及其对心功能的影响我们会在后续试验中继续进行研究。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201611150
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孟永胜, 蹇朝, 朱昀, 刘超, 姜云瀚, 罗桂平, 朱雨, 唐富琴, 肖颖彬.
Meng Yongsheng, Jian Zhao, Zhu Yun, Liu Chao, Jiang Yunhan, Luo Guiping, Zhu Yu, Tang Fuqin, Xiao Yingbin.
心室压力超负荷早期心肌纤维化的动态病理学变化
Dynamic pathological changes of myocardial fibrosis in mice in an early stage of ventricular pressure overload
第三军医大学学报, 2017, 39(10): 966-970
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(10): 966-970
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201611150

文章历史

收稿: 2016-11-15
修回: 2017-01-31

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