2. 401147 重庆，重庆医科大学附属口腔医院：口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室
2. Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 401147, China
牙本质过敏症 (dentinal hypersensitivity, DH) 是指牙齿受到生理范围内的刺激，包括机械、化学、温度、渗透压等时出现的短暂、尖锐的疼痛或不适的疾病。DH在成人中的发生率为4% ~74%，在口腔门诊患者中占1/7~1/4[1]。其症状特点是随着刺激的来临和离去而迅速出现和消失。关于牙本质敏感症的发病机制，迄今为止还处于学说状态，代表性的学说有3个，分别是神经终末传导学说、成牙本质细胞传导学说和流体动力学说，目前被学者广泛接受的是流体动力学说。该学说认为作用于牙本质表面的刺激会引起牙本质小管内的液体发生多向流动，这种流动传到牙髓，引起牙髓神经纤维的兴奋而引起痛觉[2]。根据该学说理论，通过物理或化学方法封闭牙本质小管，减少甚至避免外界刺激导致牙本质内的液体流动是防治牙本质敏感的重要方法。
目前治疗牙本质过敏的方法有很多[3-4]，如药物治疗 (包括氟化物、生物活性玻璃、硅酸三钙等)、激光治疗或者两者的结合。这些治疗方式虽被证实能起到一定抗敏感的效果，但远期效果仍欠理想，故如何最大程度提高抗敏感的效果，并延长其有效时间一直是抗敏感药物的研究重心。葡萄籽提取物原花青素 (procyanidins，PA) 是一种天然的植物多酚，多个研究证实其具有抑菌、促进根面龋再矿化以及与胶原发生交联并保护胶原的作用[5-6]。锶能抑制牙本质敏感，而研究表明锶纳米羟基磷灰石 (strontium-substituted nanohydroxyapatite，SrHAP) 具有良好的吸附和抑菌防龋功效[7]。前期利用SrHAP吸附PA制成SrHAP-PA复合物，并以具有缓释作用的Eudragit RL100[8]为成膜基质制成SrHAP-PA复合涂膜，该涂膜涂布在牙齿表面后溶剂挥发快速成膜，覆盖在开放的牙本质小管中，有较好亲水性的渗透型丙烯酸树脂能快速渗入并阻塞牙本质小管，从而阻断外部刺激。同时由于纳米羟基磷灰石的缓释特性，该涂膜中的药效成分原花青素和锶离子能持续而缓慢的释放，从而该涂膜以发挥多种药物成分的多重功效，促进牙本质的再矿化，并尽量延长药效时间，从而达到提高抗敏感的远期疗效的目的，并且涂膜制剂的形式也为临床应用提供了便利条件。本研究通过实验验证其对牙本质小管的封闭作用，旨在为牙本质敏感的防治提供新的思考。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料与仪器羟基磷灰石 (hydroxyapatite，HAP)、SrHAP、纳米羟基磷灰石原花青素复合体 (procyanidins containing-nano hydroxyapatite compelx，HAP-PA)、SrHAP-PA、原花青素涂膜材料 (前期实验合成)，指甲油 (广州艾琳公司)，表面摩擦剂 (SiO2，重庆登康口腔护理用品股份有限公司)，激光共聚焦扫描显微镜 (laser confocal scanning microscope, CLSM，德国徕卡SP-8型)，体视显微镜 (ZEISS SteREO Lumar V20)，超声波洗涤器 (KQ-SOB型，昆山市超声仪器有限公司)，硬组织切割机 (Struers Minitom，丹麦)，抛光机 (Struers Lobopol，丹麦)，多振幅轨道摇床 (2HWY-103B型，上海智城分析仪器制造有限公司)，傅立叶变换红外光谱仪 (attenuated total reflectance fourier transform infrared spectroscopy, ATR-FTIR，德国Bruker Vector-33型)，扫描电子显微镜 (scanning electron microscope，SEM)/X线能谱分析仪 (energy-dispersion X-ray, EDX，国产KYKY-3800B型)。
1.2 实验方法 1.2.1 体外牙本质敏感模型的建立[9-10]收集牛的恒中切牙10颗 (同一头牛拔除两侧中切牙，要求牙齿发育完全，无龋坏、隐裂、颈部缺损)。低速硬组织切割机去除合面釉质，保留颈部牙块，使得釉牙骨质界在牙块中间。以“田字形”将每个牙块均切成4块。碳化硅砂纸 (600、1 200、3 000、5 000#) 在流水下依次磨除颊舌侧釉质和髓腔侧牙本质，保留釉牙本质界下1 mm牙本质，形成10 mm×10 mm×1 mm牙本质片后超声荡洗30 min，用0.5 mol/L EDTA浸泡30 min开放牙本质小管，超声荡洗2 h，置于去离子水中备用。
1.2.2 人工唾液的制备1.5 mmol/L CaCl2，130 mmol/L KCl, 0.9 mmol/L KH2PO4，20 mmol/L HEPES, 1 mmol/L NaN3, 添加质量分数为2%的牛血清蛋白，2 mol/L NaOH调pH至7.0。人工唾液每天重新配置。
1.2.3 SrHAP-PA复合涂膜对牙本质小管封闭作用研究将1.2.1制备的牛牙本质标本按照完全随机化分组法分为3组，SrHAP-PA涂膜组为实验组，含氟涂膜组为阳性对照组，空白组为阴性对照组，每组5个标本，依次将SrHAP-PA涂膜和含氟涂膜用小毛刷均匀涂在各组牛牙本质标本的颊面，空白组不做任何处理作为空白对照，其他几个面用指甲油密封，将每个样本的颊面作为观察面。
涂膜干燥后将每个样本的颊面朝下独立放在24孔板中，每孔加入2 mL人工唾液，每天早晚8:00取出刷牙3 min (要求各涂膜组使用同一电动牙刷，刷牙时涂抹表面摩擦剂，与牙本质面成45°，约200 g力刷牙5 min，频率设置为150 r/min；空白组不做任何处理)，去离子水冲洗1 min后放回24孔板中，用Parafilm封口膜密封，置于37 ℃恒温振荡器中保存，循环7 d。
1.2.4 体视显微镜观察体视显微镜下观察循环结束后每组涂膜的保留情况。
1.2.5 SEM观察每组涂膜用丙酮冲洗去除后，去离子水冲洗，临点干燥，镀金，扫描电镜下观察形貌学改变，工作电压为20 kV。
1.2.6 EDX分析每组含有涂膜的样本用丙酮去除涂膜后在用去离子水冲洗，临点干燥，镀金，然后对每组样本进行EDX，检测牙本质表面元素成分变化。
1.2.7 ATR-FTIR检测每组含有涂膜的样本用丙酮去除涂膜后再用去离子水冲洗，在每组样本的髓腔侧做一标记。样本标记面正对ATR-FTIR检测器，并记录每组ATR-FTIR光谱。
1.2.8 CLSM检测每组含有涂膜的样本用丙酮去除涂膜后再用去离子水冲洗，然后罗丹明染色，用CLSM观察每组进入牙本质小管的深度，调节参数：激发波长为488 nm，发射波长为522 nm。
2 结果 2.1 体式显微镜观察结果经过7 d循环后SrHAP-PA复合涂膜比含氟涂膜保存时间长，保存面积大 (图 1A、B), 说明选择渗透型丙烯酸树脂作为成膜基质制成的涂膜流动性好，可在牙本质表面保存较长时间。图 1C、D结果显示丙酮可去除牙本质片表面涂膜。
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| A：7 d后余留SrHPA-PA涂膜；B：7 d后余留含氟涂膜；C：丙酮去除涂膜前；D：丙酮去除涂膜后 图 1 体视显微镜下观察SrHPA-PA涂膜保存情况 (×20) |
2.2 SEM/EDX观察结果
空白组牙本质小管开口清晰，管周清晰。含氟涂膜组部分牙本质小管口被颗粒物封闭，较为疏松，部分开放。SrHAP-PA涂膜组大部分牙本质小管口封闭，较为密实，管周不清晰 (图 2)。对封闭小管内容物行EDX检测 (图 3) 可知Ca、Sr、P是SrHAP-PA涂膜组涂膜层的主要成分，含氟涂膜组涂膜层也检测到Ca、P元素，且两元素的含量较实验组相对增加。
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| A：SrHAP-PA涂膜组；B：含氟涂膜组；C：空白组 图 2 SEM观察各组处理后牙本质小管的开放情况 |
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| A：SrHAP-PA涂膜组；B：含氟涂膜组；C：空白组 图 3 EDX观察各组处理后牙本质小管内封闭物情况 |
2.3 ATR-FTIR检测结果
SrHAP-PA涂膜组和含氟涂膜组均有代表羟基磷灰石的峰在1 033.7 cm-1附近，因PO43-的P-O伸缩振动峰而得到加强 (图 4)。这说明两组均有羟基磷灰石类物质的生成。
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| A:SrHAP-PA涂膜组；B:含氟涂膜组 图 4 ATR-FTIR检测各组处理后各基团改变 |
2.4 CLSM检测结果
以渗透型丙烯酸树脂作为成膜基质的SrHAP-PA涂膜染色为明亮红色，可以快速进入牙本质小管内，且进入深度较深，通过图 5比较发现，该涂膜与含氟涂膜一样，有好的封闭性，除了罗丹明染色部位，在使用该涂膜封闭的工作面未见罗丹明液体进入牙本质小管内。
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| A：SrHAP-PA涂膜组纵切面；B：空白组纵切面；C：SrHAP-PA涂膜组横切面；D：含氟涂膜组横切面 图 5 CLSM观察各组处理后对牙本质小管的封闭作用 |
3 讨论
根据流体动力学说，牙本质敏感的主要原因是牙本质小管的暴露，牙本质敏感与否的主要区别就在于开放牙本质小管的数目和直径上，单位面积上牙本质敏感的开放牙本质小管数目是不敏感牙本质的8倍，直径是其2倍[11]。所以如何有效封闭开放的牙本质小管是防治牙本质敏感的关键。目前市面上治疗牙本质敏感的方法大多基于这一理论，激光抗敏感的作用机制是瞬间高温熔融牙本质小管，从而封闭牙本质小管[12]；而脱敏剂和生物活性材料等药物抗敏感的机制是释放离子或活性成分促进再矿化，从而阻塞牙本质小管[13-14]。
牙本质小管从釉牙本质界到髓腔侧直径逐渐变大，髓腔侧单位面积的牙本质小管是表面的4倍。所以目前研究牙本质敏感的模型取材都取自釉牙骨质界上下1 mm的牙体组织，该部位的牙本质小管的分布较均匀，管径较一致，且走向较直，有利于后期的观察。体外模型多半采用的是Mordan的改良法[15]或张成飞等[16]的方法。本研究体外牙本质模型脱矿采用的是EDTA浸泡30 min后超声荡洗去除玷污层，在SEM下观察牙本质小管影像清晰，牙本质小管开口敞开，周边圆钝，为进行下一步研究提供更好的前提条件。
本实验结果显示，SEM下SrHAP-PA涂膜组牙本质小管的封孔率较高，牙本质小管基本被堵塞，且突出牙本质开口，冠周牙本质上也有团状或片状的物质形成。人牙齿的主要组成成分是羟基磷灰石，而羟基磷灰石的主要元素为Ca和P，通过EDX检测结果显示，含氟涂膜组形成的矿化物的主要组成成分是Ca和P，提示矿化物的结构与羟基磷灰石类似。SrHAP-PA涂膜组元素结果中除了Ca、P，还检测出一定比例的Sr元素，是因为纳米羟基磷灰石的活性较高，Sr部分代替了其中的Ca，形成的锶纳米羟基磷灰石晶格发生了变化，生物性能也发生改变，溶解性能得到改善，并增大了生物降解性[17]。锶被认为具有抗龋和增强骨强度的作用，另外，研究证实锶能封闭牙本质小管，从而抑制牙本质敏感。Krishnan等[7]和Gjorgievska等[18]证明锶纳米羟基磷灰石能有效促进釉质再矿化。锶纳米羟基磷灰石在牙膏等口腔保健品领域具有广阔的应用前景[19]。本实验对循环结束后牙本质表面形貌的改变，牙本质表面矿物元素的构成，胶原、无机基团的改变及药物进入牙本质小管的深度进行了较为系统地研究讨论，证实SrHAP-PA复合涂膜能通过促进牙本质的再矿化来有效地封闭牙本质小管，但这些分析仍局限于定性分析，对牙本质小管的封孔率、Ca/P比值、进入牙本质小管的具体深度这些数据仍缺乏定量的研究，所以仍需进一步研究。
经过7 d循环后，体式显微镜结果显示含氟涂膜组涂膜已完全脱落，而SrHAP-PA涂膜组涂膜仍完整，说明该涂膜在口腔环境内保存时间较长。SrHAP-PA复合涂膜选择的Eudragit RL100渗透型丙烯酸树脂是一种醇溶性药用缓释高分子材料，其化学结构中含有使其具有一定的水溶胀性和渗透性的强亲水性基团——季胺盐基团, 可形成一种亲水性骨架型缓释系统[20]。Eudragit RL100已被证实能与药物结合并能发挥定位缓释作用从而使药效延长，且有较好生物相容性[21]，其作为一种高分子材料本身能有效封闭牙本质小管的开口，涂布在牙面上，粘度较低，流动性好，20 s左右溶剂挥发快速成膜，成膜均匀，为临床的使用提供了必备条件。
本实验对牙本质样本每天进行2次的刷牙处理，刷牙1周，为避免人为差异，实验中使用的是特定功率的电动牙刷，且功率一定，刷牙时间、方向、力度相同，其余时间浸泡在人工唾液中，并放置在37 ℃的恒温振荡器中，更好地模拟了人口腔环境，以上操作均由一人完成，避免了人员之间的差异，因此本实验结果对临床的使用有一定指导意义。但本实验仍有一定的不足，因7 d后含氟涂膜组的涂膜已完全脱落，所以只观察检测了7 d后实验组牙本质小管的封闭作用，对后续涂膜的保存情况及药效成分的药物释放动力学仍需进一步的研究。另外，每个人牙本质表面形态和口腔状态与实验状况有一定的差异，限于体外实验的局限性，不能很好地反映出牙本质过敏情况的复杂性，后续仍需对SrHAP-PA复合涂膜的体内应用情况进行进一步的临床研究。
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