脑胶质瘤是颅内肿瘤中恶性程度最高的肿瘤，占颅内肿瘤的45%[1]。目前治疗方法是手术治疗为主，辅以放化疗，但平均生存期仍不足14个月[2-4]。其主要原因是血脑屏障的存在阻止了绝大多数化疗药物进入脑组织，在颅内难以达到有效药物浓度，且常见化疗药物毒性太大，难以达到既消灭胶质瘤又不损伤正常组织的效果。因此，迫切需要寻找安全高效的抗胶质瘤药物。
双氢青蒿素(dihydroartemisinine，DHA)是一种从中草药黄花蒿中提取的青蒿素提取物，主要用于疟疾治疗，其安全性得到了广泛证实[5-6]。研究表明DHA对肝癌[7]、肺癌[8]、乳腺癌[9]、宫颈癌[10]等肿瘤细胞具有显著的抑制作用，对正常细胞几乎没有影响[11]。更为关键的是DHA能够透过血脑屏障，在颅内达到有效药物浓度[12]。研究证实DHA对脑胶质瘤细胞也具有抑制作用，但其机制仍不十分清楚。Notch信号通路的异常激活对肿瘤细胞维持、增殖、凋亡等具有重要作用[13]，胶质瘤中Notch1的表达与胶质瘤的发展正相关，且Notch1高表达可以作为胶质瘤低生存率的独立指标[14-15]。基于上述发现，本研究将验证DHA对胶质瘤增殖、凋亡的影响，分析其是否与Notch信号通路有关，以期为阐明DHA抗胶质瘤作用机制提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞培养与试剂人胶质瘤U251细胞株购于中国上海生命科学院细胞库，DMEM/F12购自美国Gibco公司，青霉素-链霉素购自美国HyClone公司，胎牛血清购自德国PAN生物公司。U251细胞株用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素的DMEM/F12培养基，在37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。DHA购自美国Sigma公司，DAPT(γ分泌酶抑制剂)购自美国MCE公司，二甲基亚砜(DMSO)购自中国上海碧云天生物公司。DHA被DMSO溶解为200 mmol/L的储存液，置于-80 ℃储存，实验前将其稀释为所需浓度的工作液，并保证工作液中最终DMSO浓度不超过0.5%。兔抗人activated Notch1(NICD-1) 多克隆抗体及兔抗人Hes1多克隆抗体购自英国Abcam公司，鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自中国上海碧云天生物公司。CCK-8试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、超敏ECL试剂盒、高效RIPA细胞裂解液、Western blot试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔及山羊抗鼠IgG购自中国上海碧云天生物公司。
1.2 实验动物20只4周龄的雌性BALB/c-nu裸鼠购自北京阜康生物科技股份有限公司，体质量约20 g，饲养于重庆医科大学实验动物中心[动物生产许可证号为SCXK(京)2014-0004]，动物饲养及实验过程遵守实验动物管理及保护相关规定。
1.3 实验分组 1.3.1 细胞实验分为空白对照组、DMSO组、DAPT组和DHA(10、20、40、80 μmol/L)实验组。
1.3.2 动物实验将20只裸鼠按随机数字表法分为DMSO组、DAPT组和DHA(50、100 mg/kg)治疗组，每组5只。
1.4 实验方法 1.4.1 CCK-8检测DHA对U251细胞增殖的影响将U251胶质瘤细胞接种于96孔板中，每孔2 500个细胞，每组5个复孔，培养24 h，用无菌PBS清洗后分别加入150 μL含有不同浓度DHA的完全培养基分别培养12、24、48 h，然后每孔加入15 μL CCK-8试剂孵育80 min，置于酶标仪450 nm处检测各孔光密度。
1.4.2 流式细胞术检测DHA对U251细胞周期与早期凋亡的影响U251胶质瘤细胞孵育24 h后，每组收集至少5×105个U251细胞2份，一份重悬于70%预冷的乙醇中4 ℃过夜，次日避光加入PI(50 g/mL)和RNA酶(10 mg/mL) 30 min，流式细胞仪分析各组细胞周期分布情况；另一份重悬于1 mL PBS，取1×105个细胞离心后按说明书依次加入Annexin Ⅴ-FITC凋亡试剂盒各试剂，室温避光孵育20 min，流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况。
1.4.3 Western blot检测DHA对U251细胞蛋白表达的影响收集各组U251细胞，加入高效蛋白裂解液充分裂解细胞，离心后取上清液，提取细胞总蛋白。BCA法检测蛋白质浓度。将蛋白样品进行10% SDS-PAGE，然后电转至PVDF膜，孵育一抗(NICD-1，1：500；Hes1，1：1 000；GAPDH，1：1 000)4 ℃过夜，次日用含0.1% Tween-20的PBST清洗PVDF膜3次，在37 ℃下用二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠IgG, 1：5 000) 孵育1 h。PBST洗膜3次后用超敏ECL试剂发光显色，应用Quantity One 4.6软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参照蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达水平=实验组目的蛋白表达水平/对照组目的蛋白表达水平×100%。
1.4.4 裸鼠皮下成瘤实验及免疫组化法检测DHA对移植瘤组织中NICD-1蛋白表达的影响构建裸鼠皮下移植肿瘤模型(n=20)，每只裸鼠左侧背部分别注射1×107个U251细胞，10 d后可见皮下移植瘤形成。分别隔日腹腔注射DMSO、DAPT(5 mg/kg)及DHA(50、100 mg/kg)，7、14、21、28 d分别测量每个皮下移植瘤的长径和短径，肿瘤体积=长径(cm)×短径(cm)2/2，绘制肿瘤生长曲线；抑瘤率=[DMSO组瘤平均体积(cm3)-治疗组瘤平均体积(cm3)]/DMSO组瘤平均体积(cm3)×100%。完整取出皮下移植瘤，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，60 ℃烤片20 min，二甲苯脱蜡，再水化，柠檬酸缓冲液100 ℃抗原修复10 min，3%过氧化氢溶液室温封闭10 min，加入兔抗人NICD-1多克隆抗体( 1：100)，4 ℃过夜，即用型辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反应30 min，DAB显色，苏木精对比染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.5 结果判断NICD-1由Notch1分裂至细胞核，故细胞质和细胞核中均有表达，呈棕黄色染色。在光学显微镜(×400) 下随机选取5个视野，计数每个视野中NICD-1阳性表达细胞数。NICD-1的表达指数为每100个细胞中NICD-1阳性表达细胞数所占百分比。
1.6 统计学分析本研究中的各项实验均独立重复3次，采用SPSS 22.0对实验数据进行统计分析，进行单因素方差分析和t检验分析，计量数据用x±s表示，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 DHA抑制U251细胞的增殖活性CCK-8检测空白对照组、DHA(10、20、40、80 μmol/L)实验组在12、24、48 h时对U251细胞增殖活性的影响。检测结果(图 1)显示12 h时DHA实验组(40、80 mol/L)U251细胞增殖活性显著低于空白对照组及低浓度DHA组(10、20 mol/L，P＜0.05)，24 h后DHA各实验组细胞增殖活性显著低于空白对照组(P＜0.05)，且呈时间、浓度依赖关系。
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| 1：空白对照组；2：DHA 10 μmol/L组；3: DHA 20 μmol/L组；4: DHA 40 μmol/L组；5: DHA 80 μmol/L组 a: P＜0.05，b：P＜0.01，与空白对照组比较 图 1 CCK-8检测不同浓度DHA对U251细胞增殖活性的影响 |
2.2 DHA阻滞U251细胞周期及促进早期凋亡
流式细胞术检测空白对照组、DMSO组、DHA(10、20、40 μmol/L)实验组的U251细胞周期和早期凋亡情况。结果显示，DHA(10、20、40 μmol/L)各实验组处于G1期的U251细胞所占百分比显著高于空白对照组及DMSO组(P＜0.05)，S期的U251细胞所占百分比显著低于空白对照组及DMSO组(P＜0.05)，呈浓度依赖关系(图 2)；各实验组U251细胞的早期凋亡率显著高于空白对照组及DMSO组(P＜0.05，P＜0.01)，呈浓度依赖关系(图 3)。而空白对照组与DMSO组对比，细胞周期和早期凋亡差异均无统计学意义(P＞0.05)。
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| A~E：流式检测结果，分别为空白对照组，DMSO组，DHA 10、20、40 μmol/L组；F：定量分析 1：空白对照组，2：DMSO组，3：DHA 10 μmol/L组，4: DHA 20 μmol/L组，5: DHA 40 μmol/L组 a:P＜0.05，与空白对照组比较 图 2 流式细胞术检测不同浓度DHA对U251细胞周期的影响 |
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| A~E：流式检测结果，分别为空白对照组，DMSO组，DHA 10、20、40 μmol/L组；F：定量分析 1：空白对照组，2：DMSO组，3：DHA 10 μmol/L组，4: DHA 20 μmol/L组，5: DHA 40 μmol/L组 a: P＜0.05，b：P＜0.01，与空白对照组比较 图 3 流式细胞术检测不同浓度DHA对U251细胞早期凋亡的影响 |
2.3 DHA抑制NICD-1及下游蛋白Hes1表达
Western blot分析空白对照组、DAPT组、DHA(10、20、40 μmol/L)实验组的U251细胞中NICD-1及下游蛋白Hes1表达的变化。结果显示，DAPT组及DHA实验组的NICD-1表达均低于空白对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05，图 4A、B)；DHA(10、20、40 μmol/L)实验组的NICD-1表达及其下游蛋白Hes1表达均显著低于空白对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，图 4C、D)，且均呈浓度依赖关系。
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| A：Western blot检测NICD-1表达；B：NICD-1表达水平半定量分析 a: P＜0.05，与空白对照组比较；C：Western blot检测NICD-1与Hes1表达；D：NICD-1与Hes1表达水平半定量分析 1：空白对照组；2：DHA 10 μmol/L组；3: DHA 20 μmol/L组；4: DHA 40 μmol/L组 a: P＜0.05，b: P＜0.01，与空白对照组比较 图 4 Western blot检测DHA对U251细胞中NICD-1及Hes1表达的影响 |
2.4 DHA抑制U251裸鼠皮下移植瘤生长及移植瘤组织中NICD-1表达
观察DHA对U251细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响，免疫组化法检测各组移植瘤组织中NICD-1的表达情况。结果显示，在7、14、21、28 d时，DAPT组、DHA 50 mg/kg治疗组、DHA 100 mg/kg治疗组肿瘤体积均显著小于DMSO组，差异具有统计学意义(P＜0.05，图 5A)；根据第28天肿瘤体积计算出各组抑瘤率，DHA 100 mg/kg治疗组的抑瘤率显著高于DAPT组及DHA 50 mg/kg治疗组，差异具有统计学意义(P＜0.05，图 5B)；DAPT组和DHA治疗组的NICD-1在肿瘤组织中的表达指数显著低于DMSO组，差异具有统计学意义(P＜0.05，图 5C、D)。
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1：DMSO组；2：DAPT组；3: DHA 50 mg/kg治疗组；4: DHA 100 mg/kg治疗组 A：U251细胞移植瘤时间体积生长曲线 a: P＜0.05，b：P＜0.01，与DMSO组比较；B：各干预组抑瘤率a：P＜0.01，与DHA 50 mg/kg治疗组比较；C：NICD-1表达指数a：P＜0.01，与DMSO组比较；D：NICD-1免疫组化观察(×400) 图 5 DHA对U251裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤组织中NICD-1表达的影响 |
3 讨论
DHA是从天然植物中提取出来的一种药物，因其突出的抗疟疾效果被全世界广泛使用，其对人体的安全性得到了广泛验证[6]，并且有文献[11]报道DHA对正常细胞几乎没有影响。研究[7-10]表明DHA对多种肿瘤细胞具有突出的抗癌活性，表明DHA具有作为抗癌药物的潜在可能性。DHA可以通过二价铁介导产生的氧自由基(reactive oxygen species, ROS)直接杀伤肿瘤细胞[16-18]。DHA也可以通过线粒体途径促进肿瘤细胞凋亡，外源性凋亡通路中，DHA可以减少Bcl-2等抗凋亡基因表达及增加Bax凋亡相关基因表达以促进Caspase-3等凋亡基因表达，从而激活Caspase级联反应导致凋亡[10, 19-20]；内源性凋亡通路中，DHA可以通过影响线粒体膜电位促进Cyt-C释放，增强Casepase-3表达，从而激活Caspase级联反应导致凋亡[7, 21]。DHA还可以通过下调CyclinD1等周期蛋白阻滞肿瘤细胞增殖周期，从而抑制肿瘤增殖[19-20, 22]。然而，现阶段DHA抑制肿瘤生长的信号通路机制仍不十分明确。本研究证实了DHA可以抑制人胶质瘤U251细胞增殖，促进凋亡，阻滞U251细胞周期由G1期进入S期。
Notch信号通路在肿瘤的发生、发展过程中都具有重要作用[13]。研究表明Notch信号通路可以通过调节Bax/Bcl-2抑制Caspase-3等凋亡基因表达[23-25]，下调CyclinD1等周期蛋白调节细胞周期[24-25]，还可以调节线粒体内ROS水平[26-27]。Notch信号通路有Notch1~4受体蛋白，受体分为胞外段、跨膜段、胞内段3个区域，通过受体胞外段与配体结合，在γ分泌酶的作用下，Notch受体的胞内段NICD被释放，转移进细胞核后，NICD与CSL蛋白家族结合，解除转录抑制，促进下游靶蛋白Hes、Hey等家族蛋白的表达，产生生物学效应，其中Hes1的表达可以作为评价Notch信号通路的指标[28]。研究发现Notch1及其下游靶点在胶质瘤中相较于正常脑组织高表达，并且Notch1高表达可以作为胶质瘤低生存率的独立指标[14-15, 28]。因此推测DHA抑制胶质瘤生长的作用信号通路有可能与Notch信号通路有关。本研究证实DHA可以抑制NICD-1的表达，且NICD-1及其下游蛋白Hes1的表达水平均与DHA有浓度依赖关系；DHA可以抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，且肿瘤组织中的NICD-1水平也受到抑制。因此，通过下调NICD-1的表达来抑制Notch信号通路是DHA抗胶质瘤的可能作用机制之一，而DHA通过此途径发挥抗胶质瘤作用有以下两种可能通路，最主要的可能通路是下调NICD-1导致线粒体中ROS生成增加和Caspase级联反应的产生，其次是进入细胞核的NICD-1减少导致产生Cyclin D1表达下降等生物学效应。
综上所述，本研究表明DHA通过下调NICD-1抑制Notch信号通路，进而抑制胶质瘤U251细胞增殖, 阻滞细胞周期，促进U251细胞凋亡；DHA还下调移植瘤组织中NICD-1的表达，从而抑制U251细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。并且DHA可以通过血脑屏障在颅内达到有效药物浓度[12]，使它具有了成为治疗胶质瘤药物的可能，大量抗疟临床应用中也已证实DHA具有低毒高效的特点[6]，所以双氢青蒿素在抗胶质瘤治疗中的前景非常值得期待。
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