糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)作为糖尿病的主要并发症之一，是目前导致终末期肾脏病的首要病因[1]。以间质炎症及肾小管萎缩、纤维化为主要特征的小管间质损害是DN发生发展的重要病理生理基础[2-3]。Parkin是一种E3泛素连接酶，可调控炎症因子分泌、抑制纤维化等，在糖尿病心肌病、神经病变等多种糖尿病并发症中扮演重要角色[4-6]。目前Parkin在DN中的表达变化规律及其与疾病进展的关系尚不清楚。本研究拟通过观察DN患者肾组织中Parkin的表达变化及其与肾组织结构和功能损伤的关系，为进一步探讨其在DN进展中的作用打下基础。
1 对象与方法 1.1 临床资料选取2015-2016年我院收治的40例2型糖尿病并经肾活检病理检查确诊的DN患者，包括男性22例，女性18例。排除DN合并IgA肾病、膜性肾病、局灶节段硬化性肾小球肾炎等其他肾病，以及恶性肿瘤、病毒性肝炎、结核等疾病患者。选取10例肾肿瘤切除术后经病理诊断为正常肾组织的患者作为对照组，包括男性4例，女性6例。纳入患者均签署知情同意书。收集两组年龄、性别、体质量指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)等临床资料。采集肾活检或手术前1 d患者的血尿标本，按生化方法测定患者血肌酐(Scr)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、血清胱抑素C(Cyc)、血清白蛋白(Alb)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血糖(Glu)、C反应蛋白(CRP)、尿蛋白定量、尿N-乙 酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)，并根据CKD-EPI公式计算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration，eGFR)。本研究经过我院伦理委员会讨论批准(2016年)。
1.2 主要试剂和仪器鼠抗人Parkin抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人IL-6、Col-Ⅳ抗体购自美国Abcam公司，兔抗人TGF-β抗体购自美国Proteintech公司，抗小鼠或兔通用性免疫组化二步法检测试剂盒购自丹麦Dako公司，封闭用山羊血清购自北京中山金桥公司，FITC标记山羊抗鼠、Cy3标记山羊抗兔IgG购自上海碧云天公司，LEICA DM1000显微镜购自Leica公司。
1.3 肾组织肾小管上皮细胞Parkin与肾间质炎症因子IL-6、促纤维化因子TGF-β及间质纤维化标志Col-Ⅳ表达的检测肾组织经过常规甲醛固定石蜡包埋，切片厚度为2 μm。采用免疫组化二步法染色，常规过氧化氢、山羊血清封闭，一抗为小鼠抗人Parkin抗体(1 ：100)。细胞膜和/或细胞质呈棕黄色为Parkin表达阳性细胞。随机选取10个高倍视野对Parkin表达阳性的肾小管进行计数，计算肾小管上皮细胞Parkin表达的阳性率。免疫荧光染色检测Parkin与IL-6、TGF-β及Col-Ⅳ的表达关系：一抗为小鼠抗人Parkin分别与IL-6、TGF-β、Col-Ⅳ的混合液，二抗为FITC标记羊抗小鼠(1 ：50)与Cy3标记羊抗兔(1 ：50)混合液。采用激光共聚焦显微镜检测肾小管细胞Parkin与IL-6、TGF-β、Col-Ⅳ的表达。
1.4 病理损伤评分参考2010年《美国肾脏病杂志》针对DN肾间质的新型病理分级系统进行病理损伤评分[7]。肾小管萎缩与间质纤维化(interstitial fibrosis and tubular atrophy，IFTA)评分：0分，无IFTA；1分，病变范围＜25%； 2分，病变范围25%～50%；3分，病变范围>50%。间质炎症：0分，无间质炎症；1分，与IFTA相关的炎性浸润；2分，无IFTA区域也存在炎性浸润。肾小球评分依据肾小球硬化程度：0分，无肾小球硬化；1分，小球硬化≤25%；2分，小球硬化26%～50%；3分，小球硬化>50%。每张切片在低倍(100倍)视野下随机选取10个视野，由两名与本研究无关人员进行病理损伤评分，取其平均值。
| 组别 | n | 年龄(岁) | BMI | SBP(mmHg) | DBP(mmHg) | Alb(g/L) | HA1c(%) | Glu(mmol/L) | 尿酸(μmol/L) | CRP(mg/L) | TG(mmol/L) | TC(mmol/L) | HDL(mmol/L) | LDL (mmol/L) | 尿蛋白定量(g/d) | 尿NAG(U/L) | 尿素氮(mmol/L) | 胱抑素C (mg/L) | 血肌酐(μmol/L) | eGFR (mL/min) |
| 对照组 | 10 | 52.7±10.0 | 23.9±3.9 | 116.9±16.6 | 75.6±7.4 | 41.8±4.7 | 5.8±0.5 | 5.2±1.1 | 306.3±97.7 | 3.2±2.0 | 1.4±0.8 | 5.4±1.4 | 1.4±0.4 | 3.5±0.9 | 0.2±0.1 | 19.2±6.7 | 4.6±1.0 | 0.9±0.6 | 70.7±12.8 | 102.7±11.2 |
| 糖尿病肾病组 | 40 | 57.3±9.0 | 25.0±3.4 | 149.1±22.3a | 76.1±11.0 | 38.2±6.6 | 8.1±3.1a | 8.1±3.4a | 355.1±95.2 | 5.6±8.9 | 2.4±3.0 | 7.3±8.8 | 1.3±0.4 | 3.8±1.3 | 2.9±2.9a | 28.1±10.5a | 8.0±3.0a | 1.5±0.7a | 143.5±83.2a | 59.4±31.2a |
| BMI：体质量指数；SBP：收缩压；DBP：舒张压；Alb：血清白蛋白；HA1c：糖仪血红蛋白；Glu：血糖；CRP：C反应蛋白；TG：甘油三酯；TC：血清总胆固醇；HDL：高密度脂蛋白胆固醇；LDL：低密度脂蛋白胆固醇；尿NAG：尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶；eGFR：肾小球滤过率 a：P＜0.05,与对照组比较 | ||||||||||||||||||||
1.5 统计学分析
计量资料以x±s表示，采用SPSS 18.0统计软件，DN组临床资料与对照组的比较采用独立样本t检验；Parkin的表达与临床资料的相关性采用Pearson相关 分析，与病理损伤评分(肾小球硬化、肾小管萎缩与间质纤维化、肾间质炎症)的关系采用Spearman 相关分析。
2 结果 2.1 两组临床资料比较与对照组比较，DN组的收缩压、血糖、HA1c、尿蛋白定量、尿NAG、胱抑素C、血肌酐显著升高，eGFR水平明显降低(P＜0.05)。两组年龄、BMI、舒张压、血清白蛋白、尿酸、CRP、甘油三酯、总胆固醇、HDL、LDL水平差异均无统计学意义(P＞0.05，表 1)。
2.2 不同IFTA评分DN肾组织Parkin的表达变化免疫组化结果显示，Parkin主要于肾小管上皮细胞细胞质中表达。对照组肾组织中Parkin表达广泛，阳性率为(43.5±6.0)%。而随着IFTA评分增加Parkin表达呈逐渐下降的趋势，其中IFTA 0分组 Parkin阳性率为(40.8±4.3)%,IFTA 1分组为(32.8± 4.8)%，IFTA 2分组为(28.5±4.2)%，IFTA 3分组为(19.0±4.9)%。IFTA 1～3分组与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。提示Parkin表达随着DN疾病进展逐渐降低(图 1)。
2.3 肾小管细胞Parkin的表达与肾组织结构损伤评分的相关性相关性分析显示肾组织Parkin表达水平与肾小 球硬化(r=-0.734，P＜0.01)、肾小管萎缩及肾间质 纤维化 (r=-0.773，P＜0.01)、肾间质炎症(r=-0.673，P＜0.01)均呈显著负相关，提示Parkin表达降低与DN肾结构损伤程度密切相关。
2.4 肾小管细胞Parkin的表达与肾脏功能损伤指标的相关性相关性分析显示肾组织Parkin表达水平与年龄、BMI、舒张压、HA1c、血糖、尿酸、CRP、甘油三酯、总胆固醇、HDL、LDL均不相关(P＞0.05)。而与肾脏功能损伤指标(尿蛋白定量、尿NAG、尿素氮、血清胱抑素C、血肌酐)和收缩压负相关(P＜0.01)，与肾小球滤过率、血清白蛋白正相关(P＜0.05，表 2)。提示Parkin表达降低与DN肾功能损伤水平密切相关。
| 临床指标 | r值 | P值 |
| SBP | -0.442 | 0.007 |
| Alb | 0.413 | 0.014 |
| 尿素氮 | -0.662 | <0.01 |
| 血清胱抑素c | -0.501 | 0.004 |
| 尿蛋白定量 | -0.606 | <0.01 |
| 尿NAG | -0.572 | <0.01 |
| 血肌酐 | -0.644 | <0.01 |
| eGFR | 0.677 | <0.01 |
| SBP：收缩压； Alb：血清白蛋白；尿NAG：尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶；eGFR：肾小球滤过率 | ||
2.5 肾小管上皮细胞Parkin与IL-6、TGF-β及Col-Ⅳ表达的关系
免疫荧光检测发现DN组肾小管炎症因子IL-6表达较对照组显著增多，Parkin表达阳性的肾小管细胞并不表达IL-6(图 2)，亦不表达间质纤维化标志物Col-Ⅳ和促纤维化因子TGF-β(图 3、4)。
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| A：对照组；B：IFTA 0分组；C：IFTA 1分组；D：IFTA 2分组；E：IFTA 3分组 图 1 免疫组化检测Parkin在各组患者肾组织中的表达 (二步法) |
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| 图 2 免疫荧光检测Parkin与IL-6在各组肾组织中的表达 |
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| 图 3 免疫荧光检测Parkin与Col-Ⅳ在各组肾组织中的表达 |
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| 图 4 免疫荧光检测Parkin与TGF-β在各组肾组织中的表达 |
3 讨论
Parkin是一种E3泛素连接酶，在脑、骨骼肌、心、肝、肾等多种组织器官中广泛表达[8]。研究发现Parkin在糖尿病心脏、神经等相关靶器官损害中表达减少。糖尿病鼠心肌细胞和大脑多巴胺能神经细胞的Parkin表达均明显降低，导致细胞线粒体自噬异常、炎症因子分泌等，引起神经元及心肌细胞的应激性衰老，最终导致糖尿病心肌病与神经病变的发生[5-6]。相似的，在DN小鼠模型中肾小管细胞Parkin的表达下降[9]。本研究在DN患者中证实，Parkin主要在肾小管上皮细胞细胞质中表达，且随着肾小管间质损伤的加重，肾小管细胞Parkin的表达逐渐减少，证明DN可抑制肾小管上皮细胞Parkin表达。进一步分析Parkin的表达与肾脏结构损伤(炎症、间质萎缩及纤维化)评分的相关性发现，肾组织Parkin表达水平与肾小球硬化、肾间质损伤评分均呈负相关，提示Parkin表达降低可能与肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质炎症、肾间质纤维化不断加重存在关联。不仅如此，Parkin的肾小管阳性率与肾功能损伤指标(尿蛋白定量、尿NAG、尿素氮、血清胱抑素C、血肌酐)均呈负相关，与eGFR呈正相关，提示Parkin与DN肾功能损害存在密切联系。此外，本研究发现，Parkin尚与DN患者血清白蛋白水平存在正相关，一方面可能与本研究纳入的样本较少，存在偏倚有关；另一方面可能与Parkin具有调控IL-6表达，延缓小球滤过屏障损伤或球管反馈异常从而减少白蛋白的滤过相关[10-12]，但仍需进一步研究证实。
本研究通过免疫荧光共染检测Parkin与肾间质损伤重要的效应分子IL-6、TGF-β及纤维化标志物Col-Ⅳ表达的关系，发现无论对照组或DN组，Parkin仅在健全的肾小管细胞中表达。结合研究[13]报道认为Parkin是线粒体自噬的关键调控因子，在线粒体质量控制中扮演重要角色。研究[14]发现，良好的线粒体质量控制可抑制炎性小体的聚集和促炎性因子的表达。在糖尿病小鼠心肌细胞中，Parkin的表达下降，导致线粒体自噬缺陷，引起细胞内ROS的产生、线粒体DNA向细胞质漏出，以及IL-1β、IL-18等炎性因子的表达[6]。同时上调Parkin的表达可保持线粒体的完整性，抑制老年小鼠心肌细胞IL-1β、TNF-a等炎性因子的表达[15]。由此我们推测在DN中，Parkin可能同样发挥着抑制IL-6表达、抑制炎性反应的作用，但仍需进一步研究证实。Parkin不仅可调控炎症因子的表达，在组织纤维化进程中亦扮演重要角色。研究发现，在四氯化碳介导的大鼠肝脏纤维化模型中，肝细胞内Parkin的表达显著下降，进一步给予褪黑素则可促进肝细胞Parkin的表达，抑制TGF-β的分泌，从而显著改善肝脏纤维化[4]。TGF-β可加速肾小管细胞凋亡、衰老、向间充质干细胞转化，促进成纤维干细胞增生及细胞外基质沉积，是肾小管萎缩及肾间质纤维化的关键细胞因子[16-17]。结合在DN肾组织中，Parkin阳性的肾小管上皮细胞并不表达Col-Ⅳ和TGF-β，我们推测Parkin可能同样发挥着抑制TGF-β表达，抵抗肾小管萎缩及肾间质纤维化的作用，但Parkin是否拮抗DN肾间质纤维化仍需进一步研究证实。
综上所述，本研究发现Parkin的表达随DN肾小管间质损伤的加重逐渐减少，并与DN肾组织结构和功能损害密切相关，但具体作用机制仍需进一步的体内体外干预实验证实。Parkin的减少与肾小管上皮细胞IL-6、TGF-β、Col-Ⅳ的表达增多密切相关，但具体调控机制尚不清楚，这将是我们未来关注的重点。
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