2. 400011 重庆,重庆市中医院乳腺甲状腺科;
3. 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院:分子肿瘤及表观遗传学重庆市重点实验室
2. Department of Breast and Thyroid, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing, 400011, China;
3. Chongqing Key Laboratory of Molecular Oncology and Epigenetics, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016
结直肠癌 (colorectal cancer,CRC) 是一种常见的恶性肿瘤。一份全球最新数据显示,结直肠癌的发病率和死亡率在所有癌症中排名第3位[1]。在我国,结直肠癌的发病率和死亡率分别为8.7%和6.7%,且不断增加[2]。结直肠癌的发病率随年龄增加而提高,有研究报道显示79%的结直肠癌患者诊断时>60岁,34%的结直肠癌患者诊断时>80岁[3],可见结直肠癌好发于老年患者。虽然目前该疾病在诊断和治疗上已取得不小进步,但已有远处转移的患者预后仍然很差,故研究结直肠癌发生、发展过程和相关生物学特性,寻找有效治疗靶点非常重要。
内皮素 (endothelin,EDN) 主要由内皮细胞等释放,EDN系统包括3种EDN亚型:内皮素1(endothelin 1,EDN1)、内皮素2(endothelin 2,EDN2) 和内皮素3(endothelin 3,EDN3);2种受体亚型:内皮素受体A (endothelin receptor A,EDNRA) 和内皮素受体B (endothelin receptor B,EDNRB) 等[4-5]。EDN能与相应的内皮素受体结合,参与肿瘤细胞的增殖、分化及转移等[6],但是目前主要研究热点为EDN1和EDN2在肿瘤中的作用[7-9],EDN3在肿瘤中的研究较少。EDN3与EDNRA的亲和力低,主要与EDNRB结合发挥作用。有研究报道EDN3在甲状腺肿瘤中能抑制细胞迁移和侵袭[10],但对结直肠癌细胞生物学作用不明确。为了研究EDN3基因与结直肠癌发生、发展的关系,探讨其对结直肠癌细胞生长、迁移、侵袭等影响,本研究检测EDN3和EDNRB基因在结直肠癌细胞和癌旁组织中的表达情况,将表达EDN3基因和空载体的病毒液感染至表达ENDRB基因的结直肠癌细胞,并进行相关功能和机制检查。
1 材料与方法 1.1 细胞株及主要试剂结直肠癌细胞CaCO2、LoVo、HT-29均购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。RPMI1640培养液、胎牛血清和嘌呤霉素购自美国Gibco公司,TRIzol RNA试剂盒、慢病毒购自美国Invitrogen公司,RT-PCR试剂盒和qPCR Master Mix试剂盒购自美国Promega公司,PCR引物由中国华大基因公司合成。重组质粒构建和慢病毒包装由本课题组前期研究完成[11]。蛋白裂解液、BCA蛋白检测试剂盒和MTS试剂盒购自碧云天,鼠抗人EDN3单克隆抗体购自英国Abcam公司,兔抗人ERK1/2抗体和p-ERK1/2抗体购自美国CST公司,鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG (二抗) 购自北京中杉金桥生物技术有限公司,化学发光显影剂ECL试剂盒购自美国Bio-Rad公司,Transwell小室 (8 μm孔径) 及Matrigel基质胶购自美国BD公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养结直肠癌CaCO2、LoVo、HT-29细胞,在细胞培养箱内培养 (37 ℃,5% CO2,饱和湿度),每隔2天换1次培养基,当细胞密度达到70%~85%时用胰酶消化传代。
1.2.2 RT-PCR检测结直肠癌细胞及癌旁组织中EDN3和EDNRB mRNA的表达-80℃冰箱中取出15例人结直肠癌组织及其对应的癌旁组织,研碎,利用TRIzol试剂盒提取CaCO2、LoVo、HT-29细胞和研磨成粉末的组织的RNA。组织来自重庆医科大学附属第一医院组织库。所提取的结直肠癌细胞和2例癌旁组织RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板扩增,检测出EDN3和EDNRB的mRNA表达。PCR扩增引物由参考文献[12]合成,具体引物序列和反应条件见表 1,PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,随后分子成像仪 (Bio-Rad) 进行图片采集。
引物 | 引物序列 | 扩增条件 |
EDN3 | 上游:5′-ATTGCCACCTGGACATCATT-3′ 下游:5′-GCAGGCCTTGTCATATCTCC-3′ |
95 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s; 35个循环 |
EDNRB | 上游:5′-ATTCGTCGCTCTGCATCTG-3′ 下游:5′-GCGTCATTATCTCTGCGGTT-3′ |
95 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s; 35个循环 |
β-actin | 上游:5′-ATTGCCACCTGGACATCATT-3′ 下游:5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′ |
95 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s; 23个循环 |
1.2.3 实时荧光定量PCR检测人结直肠癌及对应癌旁组织中EDN3 mRNA的表达
15例人结直肠癌组织和对应的癌旁组织的RNA反转录成cDNA,稀释20倍,以稀释后的cDNA为模板进行PCR扩增,检测EDN3 mRNA在人结直肠癌及对应癌旁组织中表达情况。EDN3基因引物见表 1,按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书操作,反应条件:50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s,共40个循环。β-actin为内参基因,以2-ΔΔCt值表示EDN3 mRNA的表达水平。
1.2.4 构建稳定表达EDN3的细胞将LoVo细胞接种于6孔板内贴壁12 h,用包装过pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-EDN3重组质粒 (实验组) 和空载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (对照组) 的慢病毒液感染细胞,每组重复3个孔,每孔加入病毒液均为100 μL/mL,病毒液作用于细胞48 h后,培养液中加入质量浓度为1 μg/mL嘌呤霉素,细胞培养1周后将嘌呤霉素终浓度改为0.5 μg/mL。最后在药物筛选下存活的细胞即为稳定株,代表目的质粒已感染入细胞。
1.2.5 RT-PCR检测过表达EDN3后LoVo细胞中EDN3 mRNA的表达收集筛选出的稳定表达EDN3和空载体的LoVo细胞,采用TRIzol试剂盒方法提取总的RNA,RT-PCR扩增方法同1.2.2,检测实验组 (EDN3/LoVo) 和对照组 (pCDH/LoVo) 细胞中的EDN3基因表达。
1.2.6 Western blot检测感染EDN3后LoVo细胞的EDN3蛋白表达和对ERK表达水平的影响收集处于对数生长期的实验组和对照组细胞,采用蛋白裂解液 (碧云天) 提取各组细胞总蛋白,用BCA检测所提蛋白浓度。以50 μg/孔蛋白质进行SDS-PAGE电泳,将分离后的蛋白质转移到浸泡过无水乙醇的PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的封闭液室温下封闭PVDF膜1 h,加入一抗稀释液 (稀释比例皆为1 :1 000)4 ℃过夜。次日以PBST液洗膜3次,每次10 min,接着室温下孵育二抗稀释液 (稀释比例均为1 :3 000) 1 h,然后以PBST液洗膜5次,每次10 min,最后ECL显影剂显影曝光并图像分析。
1.2.7 MTS检测细胞增殖情况分别取对数生长期的实验组和对照组细胞种到96孔板中,每组细胞重复3个孔,每孔2 000个细胞。待细胞贴壁后0、24、48、72 h弃去原培养液,加入100 μL培养液 (含20 μL MTS试剂),继续在37 ℃孵箱中培养1.5 h。最后用酶联免疫检测仪检测细胞在490 nm波长处的光密度值[D(490)],根据时间和D(490) 值绘制细胞生长曲线。
1.2.8 克隆形成实验检测过表达EDN3对LoVo细胞增殖的影响取对数生长期的实验组和对照组LoVo细胞,以细胞800个/孔加入到6孔板中,每组细胞重复3个孔。每隔2天换1次培养液,约13 d后出现肉眼可见的细胞克隆团,弃去培养液,4%多聚甲醛固定细胞30 min,0.1%结晶紫染色30 min,用清水缓慢清洗2次,待晾干后可扫描计数。
1.2.9 划痕愈合实验检测过表达EDN3对LoVo细胞迁移能力的作用将实验组和对照组细胞接种到底部画有直线的6孔板中 (以3×105/孔为准),待细胞长满整个孔,用20 μL无菌枪头垂直于6孔板的底部画线划痕,脱落的细胞用PBS液洗去后,用不含胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养。选择0、24、48、72 h,高倍显微镜下拍照,测量各组细胞划痕宽度,计算各时间点宽度和初始划痕宽度差值,绘制出时间愈合能力曲线。
1.2.10 Transwell小室实验检测过表达EDN3对LoVo细胞迁移的作用取孔径为8 μm的小室置于24孔板中,下室加入700 μL的含15%胎牛血清的RPMI1640培养液,收集饥饿过24 h的实验组和对照组细胞混合入无血清RPMI1640培养液,计数至2×105个/mL,取200 μL细胞悬液置于上室,继续孵箱培育细胞48 h后取出小室,弃上室液,4%多聚甲醛固定细胞20 min,0.1%结晶紫染色20 min,用清水清洗小室,未穿过室膜的细胞即用棉签拭去,光学显微镜 (×100) 下观察穿过小室的细胞情况并拍照,计算穿过小室膜的细胞数。
1.2.11 Matrigel侵袭实验检测过表达EDN3对LoVo细胞侵袭的作用冻存在-30 ℃冰箱里的Matrigel胶取出后置于4 ℃冰箱过夜融化,将融化后的Matrigel胶稀释于无血清RPMI1640培养液中 (体积比为1 :7),然后取70 μL上述稀释后的Matrigel胶均匀铺在小室膜上,置于37 ℃孵箱中凝固后,分别加入同1.2.10处理并计算的实验组和对照组细胞,细胞穿过小室培养时间及固定染色等步骤同Transwell实验。
1.3 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件。实验均重复3次,计量资料以x±s表示,MTS检测、克隆形成实验和划痕实验等对照组与实验组之间的比较采用配对t检验,多组间比较采用方差分析。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 结直肠癌组织中EDN3 mRNA的表达实时荧光定量PCR检测15例结直肠癌组织和对应癌旁组织中的EDN3 mRNA表达水平,结果见图 1,EDN3 mRNA在80%(12/15) 的人结直肠癌组织表达水平明显低于对应癌旁组织 (P < 0.01)。
2.2 结直肠癌细胞中EDN3和EDNRB mRNA的表达
采用半定量PCR (RT-PCR) 检测结直肠癌细胞CaCO2、LoVo、HT-29及结直肠癌癌旁组织中的EDN3和EDNRB mRNA的表达水平,结果见图 2。相对于结直肠癌癌旁组织,EDN3 mRNA在结直肠癌细胞中表达降低,EDNRB mRNA在LoVo细胞中可见表达。
2.3 EDN3慢病毒感染后LoVo细胞中EDN3基因mRNA和蛋白的表达
3株结直肠癌细胞里仅LoVo细胞中有EDNRB表达,故空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和重组载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-EDN3经病毒包装后感染结直肠癌LoVo细胞。分别提取实验组和对照组LoVo细胞的总mRNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western blot检测,结果显示实验组细胞中EDN3 mRNA和蛋白水平明显高于对照组细胞 (图 3)。
2.4 EDN3基因对结直肠癌LoVo细胞增殖的影响
MTS检测细胞贴壁后0、24、48、72 h增殖情况,实验组和对照组细胞的光密度值差异无统计学意义 (P > 0.05,图 4)。平板克隆形成实验结果显示实验组和对照组细胞克隆数分别为 (281.33±19.55)、(291.00±9.64),差异无统计学意义 (P > 0.05,图 5)。
2.5 EDN3对结直肠癌LoVo细胞迁移的影响
应用划痕愈合实验检测实验组和对照组LoVo细胞划痕愈合能力,结果显示,实验组细胞划痕愈合能力显著低于对照组 (P < 0.01,图 6A);Transwell小室实验48 h后结果显示,实验组穿过小室膜的细胞数 (138.00±15.10) 少于对照组 (300.00±23.33),差异有统计学意义 (P < 0.01,图 6B),提示迁移能力降低。
2.6 EDN3对结直肠癌LoVo细胞侵袭的影响
48 h后对照组穿过小室膜的细胞数为 (526.00±69.23),实验组穿过小室膜的细胞数为 (299.00±61.43),实验组细胞数明显低于对照组 (P < 0.01,图 7),提示侵袭能力降低。
2.7 EDN3抑制结直肠癌LoVo细胞中ERK1/2蛋白磷酸化
通过Western blot检测ERK信号通路中ERK1/2蛋白表达水平,结果见图 8,在结直肠癌LoVo细胞中,相对于对照组,过表达EDN3能显著地抑制ERK1/2蛋白磷酸化。
3 讨论
人类EDN3位于20q13,由内皮细胞、大脑神经细胞、肾小管上皮细胞、肠黏膜细胞、胰腺细胞、脾脏细胞和前列腺细胞等分泌[12-13],主要作用于细胞表面的EDNRB受体[14],影响细胞的增殖和迁移等生物功能[15]。有研究显示EDN3在乳腺癌中相对于正常乳腺组织中的表达降低[16-18],且在乳腺癌中EDN3基因受甲基化调控,高表达EDN3的患者较非高表达EDN3患者有更长的总生存期,提示EDN3可能发挥抑癌作用[12];也有研究报道EDN3在恶性胶质瘤细胞中能促进细胞凋亡和抑制细胞迁移侵袭[10];研究显示EDN3在结直肠癌中受甲基化调控且表达降低[19-20],猜测EDN3基因在结直肠癌中可能具有抑癌基因特性,但并没有深入研究其在结直肠癌中的生物学作用。
本研究结果显示,EDN3 mRNA在结直肠癌组织和细胞中表达降低,推测EDN3在结直肠癌中可能是抑癌基因。半定量PCR检测结果显示,EDNRB在癌细胞LoVo中可见表达。我们选取EDNRB表达的细胞株LoVo,构建稳定过表达EDN3的细胞。采用MTS检测、平板克隆形成实验、划痕愈合实验、Transwell小室迁移和侵袭实验进行生物学特征分析,结果显示,过表达EDN3对结直肠癌细胞的增殖能力无明显改变,但划痕愈合实验和Transwell小室实验表明过表达EDN3能显著降低结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力,说明EDN3可能在结直肠癌转移过程中发挥作用。这和EDN3在乳腺癌[11]及恶性胶质瘤细胞[10]中抑制癌细胞迁移能力是一致的。
有研究报道,在人黑色素细胞中EDN1的作用与ERK1/2磷酸化存在一定联系[21]。Rauh等[22]报道在人绒毛膜癌中,EDN3能在药物拮抗剂作用下通过信号调节激酶 (extracellular signal regulated protein kinase 1/2, ERK1/2) 等通路影响癌基因c-fos和c-jun的表达。故猜测内皮素类基因发挥作用可能与ERK1/2存在一定联系。ERK1/2信号通路是一条经典的丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK) 信号通路,可由Ras、PKC等激活,参与细胞的转移和侵袭。ERK1/2的激活能促进癌细胞迁移和侵袭能力。本研究Western blot检测结果显示,过表达EDN3组的p-ERK1/2蛋白表达明显低于对照组,提示ERK1/2可能参与EDN3作用于结直肠癌细胞的过程,为EDN3调控结直肠癌细胞的侵袭迁移提供了可能的理论依据。
本实验验证了EDN3基因在结直肠癌组织及结直肠癌细胞中表达降低,体外实验说明EDN3在有EDNRB表达的结直肠癌LoVo细胞中可通过ERK1/2信号通路影响细胞迁移和侵袭功能,为进一步探讨EDN3在结直肠癌中具体机制提供实验依据,希望能为寻找结直肠癌新的分子标志物和治疗靶点提供参考。
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