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内皮素3基因对结直肠癌LoVo细胞迁移和侵袭能力的影响
向世莉1, 肖茜2, 向廷秀3, 罗涛1     
1. 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院:老年病科;
2. 400011 重庆,重庆市中医院乳腺甲状腺科;
3. 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院:分子肿瘤及表观遗传学重庆市重点实验室
[摘要] 目的 探讨内皮素3(endothelin 3,EDN3) 基因对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响及其相关机制。 方法 实时荧光定量PCR检测EDN3 mRNA在人结直肠癌组织及对应癌旁组织中的表达情况,半定量PCR检测EDN3及内皮素受体B (endothelin receptor B,EDNRB) mRNA在结直肠癌细胞 (CaCO2、LoVo、HT-29) 中的表达情况。将包装过载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-EDN3的病毒感染至结直肠癌细胞LoVo,MTS、克隆形成法、划痕法、Transwell检测EDN3对细胞增殖、克隆、迁移和侵袭能力的改变。Western blot检测LoVo中p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白改变。 结果 EDN3在人结直肠癌组织和细胞中表达降低。表达EDN3基因的重组载体成功感染至LoVo细胞。MTS和克隆实验结果显示,实验组和对照组细胞增殖和克隆形成差异无统计学意义 (P > 0.05),划痕实验和Transwell实验提示实验组细胞迁移和侵袭能力明显低于对照组 (P < 0.01)。Western blot检测结果显示磷酸化的ERK1/2蛋白表达下降 (P < 0.01)。 结论 EDN3在结直肠癌组织和细胞中表达降低,过表达EDN3能抑制结直肠癌LoVo细胞的迁移和侵袭能力, 其机制可能与ERK1/2信号通路有关。
[关键词] EDN3     结直肠癌     增殖     迁移     侵袭    
Over-expression of endothelin 3 suppresses migration and invasion in colorectal cancer LoVo cells
Xiang Shili1 , Xiao Qian2 , Xiang Tingxiu3 , Luo Tao1     
1. Department of Geriatrics, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016;
2. Department of Breast and Thyroid, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing, 400011, China;
3. Chongqing Key Laboratory of Molecular Oncology and Epigenetics, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016
Supported by the National Clinical Key-discipline Construction Program of China (2013-544)
Corresponding author: Luo Tao, E-mail: loto7869@aliyun.com
[Abstract] Objective To determine the effect of endothelin 3 (EDN3) on the proliferation, migration and invasion in colorectal cancer cell line LoVo and investigate the underlying mechanism. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression level of EDN3 in colorectal cancer tissues and para-cancerous tissues (n=15). Semi-quantitative PCR was adopted to detect the mRNA expression of EDN3 and endothelin receptor B (EDNRB) in the colorectal cancer cell lines CaCO2, LoVo and HT-29. The recombinant plasmid pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-EDN3 was packaged into lentivirus and then infected into the LoVo cells. MTS assay, colony formation assay, wound healing assay, Transwell migration and invasion assay were conducted to analyze the changes of cells in the proliferation, colony formation, migration and invasion. Western blotting was used to detect the protein expression changes of p-ERK1/2 and t-ERK1/2 in the LoVo cells. Results The expression of EDN3 were down-regulated in colorectal cancer tissues and cell lines. The recombinant lentiviral vectors which express EDN3 gene were successfully infected into LoVo cells. MTS assay and colony formation assay showed that there were no changes in the proliferation and colony formation between the LoVo cells with the lentiviral infection and those with blank vector (P > 0.05). Wound healing test and Transwell assay revealed that the migration and invasion ability were apparently reduced in the experimental cells compared to the control cells (P < 0.01). Western blot assay showed that the protein level of p-ERK1/2 was decreased after the infection (P < 0.01). Conclusion The expression of EDN3 gene is generally down-regulated in colorectal cancer tissues and cell lines. EDN3 over-expression inhibits the migration and invasion in colorectal cancer LoVo cells, which may be through ERK1/2 signaling pathway.
[Key words] endothelin 3     colorectal cancer     proliferation     migration     invasion    

结直肠癌 (colorectal cancer,CRC) 是一种常见的恶性肿瘤。一份全球最新数据显示,结直肠癌的发病率和死亡率在所有癌症中排名第3位[1]。在我国,结直肠癌的发病率和死亡率分别为8.7%和6.7%,且不断增加[2]。结直肠癌的发病率随年龄增加而提高,有研究报道显示79%的结直肠癌患者诊断时>60岁,34%的结直肠癌患者诊断时>80岁[3],可见结直肠癌好发于老年患者。虽然目前该疾病在诊断和治疗上已取得不小进步,但已有远处转移的患者预后仍然很差,故研究结直肠癌发生、发展过程和相关生物学特性,寻找有效治疗靶点非常重要。

内皮素 (endothelin,EDN) 主要由内皮细胞等释放,EDN系统包括3种EDN亚型:内皮素1(endothelin 1,EDN1)、内皮素2(endothelin 2,EDN2) 和内皮素3(endothelin 3,EDN3);2种受体亚型:内皮素受体A (endothelin receptor A,EDNRA) 和内皮素受体B (endothelin receptor B,EDNRB) 等[4-5]。EDN能与相应的内皮素受体结合,参与肿瘤细胞的增殖、分化及转移等[6],但是目前主要研究热点为EDN1和EDN2在肿瘤中的作用[7-9],EDN3在肿瘤中的研究较少。EDN3与EDNRA的亲和力低,主要与EDNRB结合发挥作用。有研究报道EDN3在甲状腺肿瘤中能抑制细胞迁移和侵袭[10],但对结直肠癌细胞生物学作用不明确。为了研究EDN3基因与结直肠癌发生、发展的关系,探讨其对结直肠癌细胞生长、迁移、侵袭等影响,本研究检测EDN3和EDNRB基因在结直肠癌细胞和癌旁组织中的表达情况,将表达EDN3基因和空载体的病毒液感染至表达ENDRB基因的结直肠癌细胞,并进行相关功能和机制检查。

1 材料与方法 1.1 细胞株及主要试剂

结直肠癌细胞CaCO2、LoVo、HT-29均购自中科院上海细胞生物学研究所细胞库。RPMI1640培养液、胎牛血清和嘌呤霉素购自美国Gibco公司,TRIzol RNA试剂盒、慢病毒购自美国Invitrogen公司,RT-PCR试剂盒和qPCR Master Mix试剂盒购自美国Promega公司,PCR引物由中国华大基因公司合成。重组质粒构建和慢病毒包装由本课题组前期研究完成[11]。蛋白裂解液、BCA蛋白检测试剂盒和MTS试剂盒购自碧云天,鼠抗人EDN3单克隆抗体购自英国Abcam公司,兔抗人ERK1/2抗体和p-ERK1/2抗体购自美国CST公司,鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG (二抗) 购自北京中杉金桥生物技术有限公司,化学发光显影剂ECL试剂盒购自美国Bio-Rad公司,Transwell小室 (8 μm孔径) 及Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养结直肠癌CaCO2、LoVo、HT-29细胞,在细胞培养箱内培养 (37 ℃,5% CO2,饱和湿度),每隔2天换1次培养基,当细胞密度达到70%~85%时用胰酶消化传代。

1.2.2 RT-PCR检测结直肠癌细胞及癌旁组织中EDN3和EDNRB mRNA的表达

-80℃冰箱中取出15例人结直肠癌组织及其对应的癌旁组织,研碎,利用TRIzol试剂盒提取CaCO2、LoVo、HT-29细胞和研磨成粉末的组织的RNA。组织来自重庆医科大学附属第一医院组织库。所提取的结直肠癌细胞和2例癌旁组织RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板扩增,检测出EDN3和EDNRB的mRNA表达。PCR扩增引物由参考文献[12]合成,具体引物序列和反应条件见表 1,PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,随后分子成像仪 (Bio-Rad) 进行图片采集。

表 1 RT-PCR反应所用序列及其反应条件
引物 引物序列 扩增条件
EDN3 上游:5′-ATTGCCACCTGGACATCATT-3′
下游:5′-GCAGGCCTTGTCATATCTCC-3′
95 ℃ 30 s;55 ℃
30 s;72 ℃ 30 s;
35个循环
EDNRB 上游:5′-ATTCGTCGCTCTGCATCTG-3′
下游:5′-GCGTCATTATCTCTGCGGTT-3′
95 ℃ 30 s;55 ℃
30 s;72 ℃ 30 s;
35个循环
β-actin 上游:5′-ATTGCCACCTGGACATCATT-3′
下游:5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′
95 ℃ 30 s;55 ℃
30 s;72 ℃ 30 s;
23个循环

1.2.3 实时荧光定量PCR检测人结直肠癌及对应癌旁组织中EDN3 mRNA的表达

15例人结直肠癌组织和对应的癌旁组织的RNA反转录成cDNA,稀释20倍,以稀释后的cDNA为模板进行PCR扩增,检测EDN3 mRNA在人结直肠癌及对应癌旁组织中表达情况。EDN3基因引物见表 1,按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书操作,反应条件:50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s,共40个循环。β-actin为内参基因,以2-ΔΔCt值表示EDN3 mRNA的表达水平。

1.2.4 构建稳定表达EDN3的细胞

将LoVo细胞接种于6孔板内贴壁12 h,用包装过pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-EDN3重组质粒 (实验组) 和空载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (对照组) 的慢病毒液感染细胞,每组重复3个孔,每孔加入病毒液均为100 μL/mL,病毒液作用于细胞48 h后,培养液中加入质量浓度为1 μg/mL嘌呤霉素,细胞培养1周后将嘌呤霉素终浓度改为0.5 μg/mL。最后在药物筛选下存活的细胞即为稳定株,代表目的质粒已感染入细胞。

1.2.5 RT-PCR检测过表达EDN3后LoVo细胞中EDN3 mRNA的表达

收集筛选出的稳定表达EDN3和空载体的LoVo细胞,采用TRIzol试剂盒方法提取总的RNA,RT-PCR扩增方法同1.2.2,检测实验组 (EDN3/LoVo) 和对照组 (pCDH/LoVo) 细胞中的EDN3基因表达。

1.2.6 Western blot检测感染EDN3后LoVo细胞的EDN3蛋白表达和对ERK表达水平的影响

收集处于对数生长期的实验组和对照组细胞,采用蛋白裂解液 (碧云天) 提取各组细胞总蛋白,用BCA检测所提蛋白浓度。以50 μg/孔蛋白质进行SDS-PAGE电泳,将分离后的蛋白质转移到浸泡过无水乙醇的PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的封闭液室温下封闭PVDF膜1 h,加入一抗稀释液 (稀释比例皆为1 :1 000)4 ℃过夜。次日以PBST液洗膜3次,每次10 min,接着室温下孵育二抗稀释液 (稀释比例均为1 :3 000) 1 h,然后以PBST液洗膜5次,每次10 min,最后ECL显影剂显影曝光并图像分析。

1.2.7 MTS检测细胞增殖情况

分别取对数生长期的实验组和对照组细胞种到96孔板中,每组细胞重复3个孔,每孔2 000个细胞。待细胞贴壁后0、24、48、72 h弃去原培养液,加入100 μL培养液 (含20 μL MTS试剂),继续在37 ℃孵箱中培养1.5 h。最后用酶联免疫检测仪检测细胞在490 nm波长处的光密度值[D(490)],根据时间和D(490) 值绘制细胞生长曲线。

1.2.8 克隆形成实验检测过表达EDN3对LoVo细胞增殖的影响

取对数生长期的实验组和对照组LoVo细胞,以细胞800个/孔加入到6孔板中,每组细胞重复3个孔。每隔2天换1次培养液,约13 d后出现肉眼可见的细胞克隆团,弃去培养液,4%多聚甲醛固定细胞30 min,0.1%结晶紫染色30 min,用清水缓慢清洗2次,待晾干后可扫描计数。

1.2.9 划痕愈合实验检测过表达EDN3对LoVo细胞迁移能力的作用

将实验组和对照组细胞接种到底部画有直线的6孔板中 (以3×105/孔为准),待细胞长满整个孔,用20 μL无菌枪头垂直于6孔板的底部画线划痕,脱落的细胞用PBS液洗去后,用不含胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养。选择0、24、48、72 h,高倍显微镜下拍照,测量各组细胞划痕宽度,计算各时间点宽度和初始划痕宽度差值,绘制出时间愈合能力曲线。

1.2.10 Transwell小室实验检测过表达EDN3对LoVo细胞迁移的作用

取孔径为8 μm的小室置于24孔板中,下室加入700 μL的含15%胎牛血清的RPMI1640培养液,收集饥饿过24 h的实验组和对照组细胞混合入无血清RPMI1640培养液,计数至2×105个/mL,取200 μL细胞悬液置于上室,继续孵箱培育细胞48 h后取出小室,弃上室液,4%多聚甲醛固定细胞20 min,0.1%结晶紫染色20 min,用清水清洗小室,未穿过室膜的细胞即用棉签拭去,光学显微镜 (×100) 下观察穿过小室的细胞情况并拍照,计算穿过小室膜的细胞数。

1.2.11 Matrigel侵袭实验检测过表达EDN3对LoVo细胞侵袭的作用

冻存在-30 ℃冰箱里的Matrigel胶取出后置于4 ℃冰箱过夜融化,将融化后的Matrigel胶稀释于无血清RPMI1640培养液中 (体积比为1 :7),然后取70 μL上述稀释后的Matrigel胶均匀铺在小室膜上,置于37 ℃孵箱中凝固后,分别加入同1.2.10处理并计算的实验组和对照组细胞,细胞穿过小室培养时间及固定染色等步骤同Transwell实验。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件。实验均重复3次,计量资料以x±s表示,MTS检测、克隆形成实验和划痕实验等对照组与实验组之间的比较采用配对t检验,多组间比较采用方差分析。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 结直肠癌组织中EDN3 mRNA的表达

实时荧光定量PCR检测15例结直肠癌组织和对应癌旁组织中的EDN3 mRNA表达水平,结果见图 1,EDN3 mRNA在80%(12/15) 的人结直肠癌组织表达水平明显低于对应癌旁组织 (P < 0.01)。

图 1 实时荧光定量PCR检测15例人结直肠癌组织及其癌旁组织中EDN3 mRNA的表达

2.2 结直肠癌细胞中EDN3和EDNRB mRNA的表达

采用半定量PCR (RT-PCR) 检测结直肠癌细胞CaCO2、LoVo、HT-29及结直肠癌癌旁组织中的EDN3和EDNRB mRNA的表达水平,结果见图 2。相对于结直肠癌癌旁组织,EDN3 mRNA在结直肠癌细胞中表达降低,EDNRB mRNA在LoVo细胞中可见表达。

1:CaCO2;2:LoVo;3:HT-29;4、5:癌旁组织 图 2 RT-PCR检测人结直肠癌细胞和癌旁组织中EDN3和EDNRB mRNA的表达

2.3 EDN3慢病毒感染后LoVo细胞中EDN3基因mRNA和蛋白的表达

3株结直肠癌细胞里仅LoVo细胞中有EDNRB表达,故空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和重组载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-EDN3经病毒包装后感染结直肠癌LoVo细胞。分别提取实验组和对照组LoVo细胞的总mRNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western blot检测,结果显示实验组细胞中EDN3 mRNA和蛋白水平明显高于对照组细胞 (图 3)。

A:RT-PCR检测结果;B:Western blot检测结果 图 3 EDN3慢病毒感染结直肠癌LoVo细胞后细胞中EDN3 mRNA和蛋白的表达

2.4 EDN3基因对结直肠癌LoVo细胞增殖的影响

MTS检测细胞贴壁后0、24、48、72 h增殖情况,实验组和对照组细胞的光密度值差异无统计学意义 (P > 0.05,图 4)。平板克隆形成实验结果显示实验组和对照组细胞克隆数分别为 (281.33±19.55)、(291.00±9.64),差异无统计学意义 (P > 0.05,图 5)。

图 4 MTS检测EDN3过表达对结直肠癌LoVo细胞增殖能力的影响

图 5 克隆形成实验检测EDN3对结直肠癌LoVo细胞增殖能力的影响

2.5 EDN3对结直肠癌LoVo细胞迁移的影响

应用划痕愈合实验检测实验组和对照组LoVo细胞划痕愈合能力,结果显示,实验组细胞划痕愈合能力显著低于对照组 (P < 0.01,图 6A);Transwell小室实验48 h后结果显示,实验组穿过小室膜的细胞数 (138.00±15.10) 少于对照组 (300.00±23.33),差异有统计学意义 (P < 0.01,图 6B),提示迁移能力降低。

A:划痕愈合实验 (×100);B:Transwell迁移实验 (结晶紫染色×100) 图 6 EDN3对结直肠癌LoVo细胞的迁移能力影响

2.6 EDN3对结直肠癌LoVo细胞侵袭的影响

48 h后对照组穿过小室膜的细胞数为 (526.00±69.23),实验组穿过小室膜的细胞数为 (299.00±61.43),实验组细胞数明显低于对照组 (P < 0.01,图 7),提示侵袭能力降低。

图 7 Transwell基质胶实验检测EDN3对结直肠癌LoVo细胞的侵袭能力影响 (结晶紫染色×100)

2.7 EDN3抑制结直肠癌LoVo细胞中ERK1/2蛋白磷酸化

通过Western blot检测ERK信号通路中ERK1/2蛋白表达水平,结果见图 8,在结直肠癌LoVo细胞中,相对于对照组,过表达EDN3能显著地抑制ERK1/2蛋白磷酸化。

A:Western blot检测结果1:对照组;2:实验组;B:半定量分析结果a: P < 0.05,与对照组比较 图 8 Western blot检测EDN3对结直肠癌LoVo细胞中磷酸化的ERK1/2和总的ERK1/2蛋白表达的影响

3 讨论

人类EDN3位于20q13,由内皮细胞、大脑神经细胞、肾小管上皮细胞、肠黏膜细胞、胰腺细胞、脾脏细胞和前列腺细胞等分泌[12-13],主要作用于细胞表面的EDNRB受体[14],影响细胞的增殖和迁移等生物功能[15]。有研究显示EDN3在乳腺癌中相对于正常乳腺组织中的表达降低[16-18],且在乳腺癌中EDN3基因受甲基化调控,高表达EDN3的患者较非高表达EDN3患者有更长的总生存期,提示EDN3可能发挥抑癌作用[12];也有研究报道EDN3在恶性胶质瘤细胞中能促进细胞凋亡和抑制细胞迁移侵袭[10];研究显示EDN3在结直肠癌中受甲基化调控且表达降低[19-20],猜测EDN3基因在结直肠癌中可能具有抑癌基因特性,但并没有深入研究其在结直肠癌中的生物学作用。

本研究结果显示,EDN3 mRNA在结直肠癌组织和细胞中表达降低,推测EDN3在结直肠癌中可能是抑癌基因。半定量PCR检测结果显示,EDNRB在癌细胞LoVo中可见表达。我们选取EDNRB表达的细胞株LoVo,构建稳定过表达EDN3的细胞。采用MTS检测、平板克隆形成实验、划痕愈合实验、Transwell小室迁移和侵袭实验进行生物学特征分析,结果显示,过表达EDN3对结直肠癌细胞的增殖能力无明显改变,但划痕愈合实验和Transwell小室实验表明过表达EDN3能显著降低结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力,说明EDN3可能在结直肠癌转移过程中发挥作用。这和EDN3在乳腺癌[11]及恶性胶质瘤细胞[10]中抑制癌细胞迁移能力是一致的。

有研究报道,在人黑色素细胞中EDN1的作用与ERK1/2磷酸化存在一定联系[21]。Rauh等[22]报道在人绒毛膜癌中,EDN3能在药物拮抗剂作用下通过信号调节激酶 (extracellular signal regulated protein kinase 1/2, ERK1/2) 等通路影响癌基因c-fos和c-jun的表达。故猜测内皮素类基因发挥作用可能与ERK1/2存在一定联系。ERK1/2信号通路是一条经典的丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK) 信号通路,可由Ras、PKC等激活,参与细胞的转移和侵袭。ERK1/2的激活能促进癌细胞迁移和侵袭能力。本研究Western blot检测结果显示,过表达EDN3组的p-ERK1/2蛋白表达明显低于对照组,提示ERK1/2可能参与EDN3作用于结直肠癌细胞的过程,为EDN3调控结直肠癌细胞的侵袭迁移提供了可能的理论依据。

本实验验证了EDN3基因在结直肠癌组织及结直肠癌细胞中表达降低,体外实验说明EDN3在有EDNRB表达的结直肠癌LoVo细胞中可通过ERK1/2信号通路影响细胞迁移和侵袭功能,为进一步探讨EDN3在结直肠癌中具体机制提供实验依据,希望能为寻找结直肠癌新的分子标志物和治疗靶点提供参考。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201610226
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

向世莉, 肖茜, 向廷秀, 罗涛.
Xiang Shili, Xiao Qian, Xiang Tingxiu, Luo Tao.
内皮素3基因对结直肠癌LoVo细胞迁移和侵袭能力的影响
Over-expression of endothelin 3 suppresses migration and invasion in colorectal cancer LoVo cells
第三军医大学学报, 2017, 39(7): 646-652
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(7): 646-652
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201610226

文章历史

收稿: 2016-10-31
修回: 2016-12-19

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