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LncRNA RNU12上调热休克蛋白72抑制重组人TRAIL蛋白诱导肝癌细胞凋亡
陈施翰, 邓青松, 蒋家云, 邹孟达, 谭运华, 马宽生     
400038 重庆,第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所
[摘要] 目的 探讨46~50 ℃时抑制重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL) 蛋白促肝癌细胞凋亡相关分子机制。 方法 建立肝癌细胞亚致死性热温度模型,在不同温度 (43、46、50 ℃) 条件下分别处理10 min,Annexin-V/PI染色检测重组人TRAIL蛋白对肝癌细胞凋亡率的影响,以常温37 ℃作为对照组。根据前期肝癌细胞Agilent Human lncRNA+mRNA Array V4.0芯片表达谱数据,选定50 ℃时特异性高表达的LncRNA RNU12作为研究对象。构建LncRNA RNU12-shRNA慢病毒干扰载体,转染MHCC97-H细胞。qRT-PCR及Western blot检测感染前后不同温度组中热休克蛋白72(heat shock protein 72,HSP72) mRNA和蛋白的表达变化。利用流式细胞技术检测LncRNA RNU12慢病毒干扰载体对TRAIL蛋白诱导细胞凋亡的影响。采用荧光原位杂交 (FISH) 技术检测LncRNA RNU12亚细胞定位情况。 结果 温度在43 ℃时促进重组人TRAIL蛋白诱导肝癌细胞凋亡的功能,46~50 ℃时抑制重组人TRAIL蛋白诱导肝癌细胞凋亡的功能。HSP72 mRNA在4个温度组中的表达均较干扰前明显降低 (P < 0.01);在蛋白水平,37、46、50 ℃组较干扰前显著降低 (P < 0.05)。转染后,46、50 ℃条件下TRAIL蛋白诱导MHCC97-H细胞凋亡分别上升7.36%、8.84%(P < 0.01)。利用RNA-FISH技术确定50 ℃时LncRNA RNU12主要在MHCC97-H细胞细胞核中表达。 结论 LncRNA RNU12在转录水平上调HSP72表达可能是46~50 ℃时抑制重组人TRAIL蛋白促肝癌细胞凋亡分子机制之一。
[关键词] 肝癌细胞凋亡     长链非编码RNA     亚致死性热温度     HSP72    
LncRNA RNU12 inhibits apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by recombinant human TRAIL protein through up-regulating heat shock protein 72
Chen Shihan , Deng Qingsong , Jiang Jiayun , Zou Mengda , Tan Yunhua , Ma Kuansheng     
Institute of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
Supported by the General Program of National Nature Science Foundation of China (81272688)
Corresponding author: Ma Kuansheng, E-mail:makuansheng@vip.sina.com
[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of inhibiting the apoptosis of hepatocellular carcinoma (HCC) cells induced by recombinant human tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) protein at 46~50 ℃. Methods A sub-lethal heat treatment model of HCC cells was established. The Annexin-V/PI staining was used to detect the effect of treatment of recombinant human TRAIL on the apoptotic rate of HCC cells under different temperatures (43, 46 and 50 ℃, and 37 ℃ as control temperature) for 10 min. According to the expression profile from the Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0 microarray data in HCC cells in our previous study, 50 ℃ specific highly expressed LncRNA RNU12 was selected as the research object. Lentiviral vector LncRNA RNU12 was constructed, and then transfected into MHCC97-H cells. The expression of heat shock protein 72 (HSP72) at mRNA and protein levels were measured in different temperature treatment groups before and after transfection by qRT-PCR and Western blotting. Meanwhile, flow cytometry was used to detect the effect of lentiviral vector LncRNA RNU12 on the apoptosis of MHCC97-H cells induced by TRAIL protein. The fluorescence in situ hybridization (FISH) was used to detect the sub-cellular localization of LncRNA RNU12 in HCC cells. Results Temperature at 43 ℃ promoted recombinant human TRAIL protein to induce the apoptosis in HCC cells, but it exerted opposite effect at 46~50 ℃. The mRNA level of HSP72 was significantly decreased in all 4 treatment groups after lentiviral vector infection (P < 0.01). And TRAIL protein levels were obviously lower at the 37, 46 and 50 ℃ groups than before lentivirus-mediated interference (P < 0.05). After the lentiviral vector infection, the apoptosis of MHCC97-H cells induced by TRAIL protein were increased by 7.36% (P < 0.01) and 8.84% (P < 0.01), respectively at the 46℃ and 50℃ groups. RNA-FISH showed that LncRNA RNU12 was mainly expressed in the nucleus of MHCC97-H cells at 50℃. Conclusion LncRNA RNU12 up-regulating HSP72 at transcriptional level may be one of the molecular mechanisms of inhibiting the apoptosis of HCC cells induced by recombinant human TRAIL protein at 46~50℃.
[Key words] apoptosis of hepatocellular carcinoma cells     long non-coding RNA     sub-lethal heat temperature     HSP72    

肝癌是发病率和死亡率都极高的恶性肿瘤[1-2],严重威胁人类生命健康。射频消融 (radio frequency ablation, RFA) 是治疗肝癌的常见方法之一。根据射频消融治疗时温度分布及组织病理学变化,将治疗部位由电极中心向周边分为应用区、中心区、过渡区、参照区[3]。过渡区内温度在42~60 ℃,该温度范围 (称为亚致死性热温度) 不足以“杀死”肝癌细胞,导致病灶残留,即残癌的发生。因此,如何提高对过渡区残癌组织的杀伤,抑制残癌细胞复活是提高肝癌射频消融疗效的关键。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL) 是肿瘤坏死因子超家族的重要成员,具有独特的肿瘤细胞选择性[4]。国外学者在研究结肠癌肝转移的离体肝灌注 (isolated hepatic perfusion,IHP) 治疗时,发现“温度双重效应”现象,即温度范围在42~43 ℃时能够有效促进重组人TRAIL蛋白诱导结肠癌细胞凋亡,凋亡通路中相关酶激活,如聚ADP核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase,PARP]的剪切及Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3的激活[5-7];相反,46 ℃时抑制重组人TRAIL蛋白诱导结肠癌细胞凋亡[8],但具体机制不清。长链非编码RNA (long non-coding RNA, LncRNA) 是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,参与细胞内多种生物学过程[9-10],而温度对LncRNA调控网络的影响目前少有研究[11]。当细胞受到外界环境理化因素刺激时,表达迅速增加的热休克蛋白 (heat shock protein,HSP) 可以通过多种途径抑制凋亡,增强细胞热耐受,发挥细胞保护作用[12-13]。LncRNA和HSP在“温度双重效应”中是否发挥作用还不清楚。因此,本研究拟建立肝癌细胞亚致死热温度模型,观察不同温度条件下LncRNA RNU12和HSP72在重组人TRAIL蛋白诱导肝癌细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法 1.1 材料

人肝癌细胞MHCC97-H、HepG2和SMMC-7721为本实验室保存,高糖培养基DMEM、胎牛血清FBS、青-链霉素双抗、胰酶购自Gibco公司,重组人TRAIL蛋白购自上海钰博生物科技有限公司,LncRNA RNU12-shRNA干扰慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建包装,Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自凯基公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司,HSP72抗体购自Cell signal technologies公司,HRP标记的山羊抗鼠及抗兔抗体、鼠抗人β-actin抗体购自北京中杉金桥公司,RNA提取试剂、反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司,引物设计与合成由上海生物工程公司提供,lncRNA FISH Probe Mix (Red) 及其配套试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人肝癌MHCC97-H细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37 ℃、5%CO2培养箱,隔日换液,待细胞生长至90%左右时用0.25%胰酶消化离心 (2 500 r/min,3 min) 后传代。取对数期细胞进行实验。

1.2.2 实验分组及亚致死性热温度模型建立

将实验分成8组,分别为37 ℃组、37 ℃+TRAIL组、43 ℃组、43 ℃+TRAIL组、46 ℃组、46 ℃+TRAIL组、50 ℃组、50 ℃+TRAIL组。先将8组细胞换液,而后向需要加重组人TRAIL蛋白组中加入150 ng TRAIL蛋白,使终浓度为50 ng/mL,再将8组细胞放入培养箱中。1 h后取出,在预先设定好温度的水浴锅中热处理10 min,再放入培养箱中继续培养。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡

于热处理后24 h收集细胞,用4 ℃预冷的PBS洗细胞2次,以1 mL结合缓冲液重悬细胞,调整细胞至1×105/mL,Annexin Ⅴ和碘化丙啶 (PI) 双染15 min后流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.2.4 LncRNA RNU12干扰慢病毒载体构建与包装

根据GenBank人LncRNA RNU12序列信息,以RNAi在线软件设计3条RNA干扰靶点序列及1条无关序列作为阴性对照 (表 1),并设置空白组。后续构建与包装由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。

表 1 设计的3条干扰序列
序列名称 靶序列 (5′→3′) GC含量 (%)
GIDL82974-RNAi (47082-1) GGGACCCACGAAACTGGCAAT 42.86
GIDL82974-RNAi(47082-1) GGGACCCACGAAACTGGCAAT 57.14
GIDL82974-RNAi (47083-1) GGGAGAGTTAAAGAGACTAAT 38.10
NC-siRNA TTCTCCGAACGTGTCACGT 52.63

1.2.5 LncRNA RNU12干扰慢病毒载体感染MHCC97-H细胞

MHCC97-H细胞按5×104/孔接种于6孔板,培养24 h。将LncRNA RNU12-shRNA及NC-shRNA慢病毒以感染复数 (MOI) 值为100分别感染干扰组及阴性对照组细胞,每组均加入终浓度为5 μg/mL的polybrene。培养箱内孵育10 h后更换新鲜培养液,感染慢病毒载体后第5天,荧光显微镜下观察表达情况。

1.2.6 qRT-PCR检测LncRNA RNU12的干扰效果

感染后第6天分别收集3个干扰组、阴性对照组及空白组MHCC97-H细胞,RNAiso Plus试剂提取总RNA,按逆转录试剂盒说明书将其反转录为cDNA,利用特异性引物进行定量PCR扩增反应,每组设定3个复孔。LncRNA RNU12引物上游:5′-TGCGGCCTTACCCAGTTCTC-3′,下游:5′-CATGCTGGAGGCTGGGGTTATATC-3′,扩增片段长度229 bp;β-actin引物上游:5′-GTTTTGTTTTGGCGCTTTTGAC-3′,下游5′-CGCG-ACCATCCTCCTCTTAG-3′,扩增片段长度249 bp。扩增条件:96 ℃预温5 min,随后进行96 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s的扩增,共40个循环,最后72 ℃延伸10 min。

1.2.7 qRT-PCR和Western blot检测HSP72 mRNA和蛋白

收集实验处理细胞,将实验分为8组,分别为37 ℃组、37 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组、43 ℃组、43 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组、46 ℃组、46 ℃+ LncRNA RNU12-shRNA3组、50 ℃组、50 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组,按照1.2.2方法进行亚致死性热温度处理。按1.2.6方法进行qRT-PCR检测。HSP72 mRNA引物上游:5′-CCCTGACCATTCCATTATTGAG-AC-3′,下游:5′-GTGGCATTTCTTCAGTTACAGCAG-3′,扩增片段长度224 bp。提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度。电泳,转膜,室温封闭1 h,分别加入HSP72多克隆抗体 (1:1 000)、内参β-actin (1:2 000),4 ℃孵育过夜,洗膜3次,加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h,洗膜3次后使用凝胶成像分析系统扫描结果。

1.2.8 流式细胞术检测慢病毒干扰载体对细胞凋亡的影响

将实验分为8组,分别为37 ℃+TRAIL组、37 ℃+TRAIL+LncRNA RNU12-shRNA3组、43 ℃+TRAIL组、43 ℃+TRAIL+LncRNA RNU12-shRNA3组、46 ℃+TRAIL组、46 ℃+TRAIL+LncRNA RNU12-shRNA3组、50 ℃+TRAIL组、50 ℃+TRAIL+LncRNA RNU12-shRNA3组。细胞处理方法同1.2.2,凋亡检测方法同1.2.3。

1.2.9 FISH检测LncRNA RNU12在细胞中的表达分布

将细胞爬片置于24孔板底,5×103/孔,培养24 h后去除上清,1×PBS清洗细胞,待4%多聚甲醛固定后,加入含0.5% Triton X-100的PBS,预杂交液37 ℃封闭,LncRNA RNU12探针37 ℃杂交过夜,避光42 ℃杂交洗液清洗细胞,DAPI染色切片杂交区域,避光条件下用封片剂固定爬片于载玻片上。实验标本在激光共聚焦显微镜检测下观察。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件, 计量资料数据以x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05(双侧)。

2 结果 2.1 温度对TRAIL蛋白促肝癌细胞早期凋亡的影响

流式细胞术检测显示 (表 2),37~50 ℃范围内,肝癌细胞早期凋亡率随温度的升高而增加 (F=676.617,P < 0.01),呈剂量-效应依赖性现象,轻度高温促进肝癌细胞早期凋亡;43 ℃+TRAIL组早期细胞的凋亡最显著,而46 ℃+TRAIL组和50 ℃+TRAIL组却比43 ℃+ TRAIL组分别降低11.83%(P < 0.01)、9.69%(P < 0.01),即加TRAIL蛋白的4个组肝癌细胞早期细胞的凋亡并未出现剂量-效应依赖性现象。说明43 ℃能促进TRAIL蛋白诱导肝癌细胞早期凋亡,46~50 ℃却抑制TRAIL蛋白诱导肝癌细胞早期凋亡。

表 2 流式细胞术检测不同处理24 h后对MHCC97-H肝癌细胞凋亡率的影响[n=3, (x±s)%]
组别 早期凋亡率 晚期凋亡率 总凋亡率
37 ℃组 3.75±0.11 2.02±0.04 5.77±0.08
37 ℃+TRAIL组 8.56±0.03 3.49±0.01 12.05±0.03
43 ℃组 5.62±0.34a 6.50±0.14 12.12±0.49
43 ℃+TRAIL组 21.65±0.54 8.53±0.25 30.18±0.78
46 ℃组 8.86±0.20a 5.86±0.10 14.72±0.25
46 ℃+TRAIL组 9.82±0.00b 8.31±0.01 18.13±0.01
50 ℃组 10.64±0.03a 20.08±0.36 30.72±0.39
50 ℃+TRAIL组 11.96±0.14b 21.83±0.56 33.80±0.70
  a:P < 0.05, 与37 ℃组比较,b:P < 0.01,与43 ℃+TRAIL组比较

2.2 HSP72表达随温度升高而增强

Western blot检测结果显示,在未加TRAIL蛋白的4组中,HSP72蛋白表达水平随温度的升高而增加[37 ℃组 (0.56±0.12)、43 ℃组 (0.93±0.12)、46 ℃组 (1.11±0.08)、50 ℃组 (1.41±0.18),P < 0.01];加TRAIL蛋白的4组中,46 ℃+TRAIL组 (1.13±0.16)、50 ℃+TRAIL组 (1.43±0.14) 的HSP72蛋白表达水平均明显高于43 ℃+TRAIL组 (P < 0.01),虽然43 ℃+TRAIL组 (0.86±0.16) 与37 ℃+TRAIL组 (0.63±0.03) 差异没有统计学意义 (P>0.05),但43 ℃+TRAIL组HSP72表达高于37 ℃+TRAIL组 (图 1)。表明,亚致死性热温度能够刺激肝癌细胞HSP72蛋白使其表达增高,且随温度的升高而增加。

1: 37 ℃组;2: 37 ℃+TRAIL组;3: 43 ℃组;4: 43 ℃+TRAIL组;5: 46 ℃组;6: 46 ℃+TRAIL组;7: 50 ℃组;8: 50 ℃+TRAIL组 图 1 4个温度条件下加与未加TRAIL蛋白对MHCC97-H细胞HSP72蛋白表达的影响

2.3 LncRNA RNU12在不同肝癌细胞株和不同温度条件下的表达

qRT-PCR检测结果显示,与正常温度 (37 ℃) 相比,50 ℃刺激MHCC97-H、HepG2、SMMC-7721细胞后LncRNA RNU12表达增加 (P < 0.01,图 2A)。与37 ℃组相比,43 ℃组LncRNA RNU12表达仅上调2.36倍;而46 ℃组和50 ℃组分别上调31.90、42.77倍。进一步说明,LncRNA RNU12与温度刺激相关,表达水平随温度升高而显著增加 (P < 0.01,图 2B)。

A:3株肝癌细胞系中LncRNA RNU12的表达1~3:分别为MHCC97-H、HepG2、SMMC-7721;a:P < 0.01,与对照组比较;B:4种温度处理MHCC97-H细胞后LncRNA RNU12的表达1~4:分别为37、43、46、50 ℃组;a:P < 0.01,与37 ℃组比较 图 2 不同肝癌细胞株和不同温度条件下LncRNA RNU12的表达水平

2.4 慢病毒载体对MHCC97-H细胞的干扰效果

将慢病毒载体转入MHCC97-H细胞5 d后,荧光显微镜下观察可见大量表达绿色荧光细胞,生长良好;阴性对照组可见大量绿色荧光蛋白的表达,而空白组未见绿色荧光。表明慢病毒载体成功转染了MHCC97-H细胞。

qRT-PCR检测结果显示,LncRNA RNU12-shRNA1及LncRNA RNU12-shRNA3慢病毒载体干扰效率分别为47.53%和77.76%(图 3),其中LncRNA RNU12-shRNA3干扰效率最高,确定为最佳干扰靶点。

1:阴性对照组;2:空白组;3:LncRNA RNU12-shRNA1干扰组;4:LncRNA RNU12-shRNA2干扰组;5:LncRNA RNU12-shRNA3干扰组 图 3 qRT-PCR检测细胞转染慢病毒载体后LncRNA RNU12的表达

2.5 qRT-PCR和Western blot检测各组细胞转染慢病毒载体前后HSP72 mRNA和蛋白表达

qRT-PCR检测结果显示,转染LncRNA RNU12-shRNA3慢病毒载体后,各组HSP72 mRNA表达较转染前显著下调 (P < 0.01,图 4)。

1: 37 ℃组;2: 37 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组;3: 43 ℃组;4: 43 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组;5: 46 ℃组;6: 46 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组;7: 50 ℃组;8: 50 ℃+ LncRNA RNU12-shRNA3组a:P < 0.01,与温度未干扰组比较 图 4 qRT-PCR检测各组细胞转染慢病毒载体前后HSP72 mRNA表达

Western blot检测结果显示,37、46、50 ℃组HSP72蛋白水平较转染前显著下调 (P < 0.05)。虽然43 ℃组转染前后差异没有统计学意义 (P>0.05),但转染组HSP72蛋白水平仍低于未转染组。进一步提示干扰LncRNA RNU12后,HSP72的蛋白含量被下调 (图 5)。

1: 37 ℃组;2: 37 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组;3: 43 ℃组;4: 43 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组;5: 46 ℃组;6: 46 ℃+LncRNA RNU12-shRNA3组;7: 50 ℃组;8: 50 ℃+ LncRNA RNU12-shRNA3组A:Western blot检测;B:半定量分析a:P < 0.05,与同温度未干扰比较 图 5 Western blot检测各组细胞转染慢病毒载体前后HSP72蛋白的表达

2.6 转染慢病毒干扰载体促进46、50 ℃时TRAIL诱导MHCC97-H细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示,46 ℃+TRAIL+LncRNA RNU12-shRNA3组、50 ℃+TRAIL+LncRNA RNU12-shRNA3组细胞早期凋亡率较转染前明显上升 (P < 0.01),而37 ℃+TRAIL+LncRNA RNU12-shRNA3组、43 ℃+TRAIL+LncRNA RNU12-shRNA3组细胞早期凋亡率与转染前比较差异无统计学意义 (P>0.05,表 3)。

表 3 流式细胞术检测LncRNA RNU12-shRNA3慢病毒干扰前后各组MHCC97-H细胞凋亡率[n=3,(x±s)%]
组别 早期凋亡率 晚期凋亡率 总凋亡率
37 ℃+TRAIL组 8.11±0.21 6.93±0.52 15.04±0.56
37 ℃+TRAIL+LncRNARNU12-shRNA3组 8.21±0.36 6.24±0.52 14.45±0.53
43 ℃+TRAIL组 20.52±0.89 8.62±0.33 29.14±0.95
43 ℃+TRAIL+LncRNARNU12-shRNA3组 20.62±0.29 8.39±0.16 29.0±0.13
46 ℃+TRAIL组 11.15±0.59 10.95±0.51 22.09±0.24
46 ℃+TRAIL+LncRNARNU12-shRNA3组 18.51±0.53a 29.77±1.71 48.28±2.17
50 ℃+TRAIL组 11.70±1.40 23.93±0.68 35.62±2.07
50 ℃+TRAIL+LncRNARNU12-shRNA3组 20.54±0.42b 30.41±2.18 50.96±1.90
  a:P < 0.01, 与46 ℃+TRAIL组比较;b:P < 0.01, 与50 ℃+ TRAIL组比较

当转染慢病毒载体后,46、50 ℃条件下TRAIL蛋白诱导MHCC97-H细胞早期凋亡分别上升7.36%、8.84%(P < 0.01),表明HSP72蛋白的表达受到抑制,细胞失去了HSP72的细胞保护作用,减弱了其对热刺激的耐受能力;而在37、43 ℃条件下,细胞表达的HSP72蛋白量较少,干扰载体的下调作用受到一定限制,转染后对TRAIL蛋白诱导的肝癌细胞凋亡功能的影响差异无统计学意义 (P>0.05,表 3)。

2.7 激光共聚焦显微镜检测LncRNA RNU12在MHCC97-H细胞中的表达分布

RNA-FISH分析发现,正常对照组中,LncRNA RNU12在MHCC97-H细胞核和细胞质中均有表达,且细胞质表达量多于细胞核;而在50 ℃时则主要表达于细胞核且表达水平明显升高。提示当受到外界高温刺激时,LncRNA RNU12可能主要在细胞核中发挥功能,参与基因转录水平调控可能性较大。U6和18S为内参,分别位于细胞核和细胞质 (图 6)。

图 6 激光共聚焦显微镜观察37 ℃和50 ℃时LncRNA RNU12在MHCC97-H细胞中的表达分布  (×100)

3 讨论

目前,关于细胞所处环境温度动态改变对长链非编码RNA谱影响的机制研究较少。为此,本课题组前期通过水浴加热法建立肝癌细胞亚致死热温度模型模拟RFA过渡区不全消融范围,利用博奥最新的安捷伦lncRNA+mRNA V4.0芯片检测结合后续细胞实验验证,筛选出差异表达的LncRNA RNU12,并重点探究其在亚致死热温度过程中可能发挥的作用。

HSP蛋白是一类在应激原 (高温、射线、机械损伤、氧化剂等) 刺激下诱导产生的具有细胞保护功能的蛋白。HSP种类繁多,按分子量分类,包括HSP60、HSP70家族 (66×103~75×103)、HSP90家族 (83×103~100×103) 和小分子HSP家族 (15×103~30×103)[14]。HSP72(HSPA1A) 是HSP70的一种亚型,其基因结构高度保守,属于诱导型HSP70[15]。研究表明HSP72通过作用于Caspase依赖途径以及拮抗凋亡诱导因子来抑制凋亡。它能够通过结合凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic protease activating factor 1, Apaf-1) 直接影响Caspase依赖的凋亡通路,抑制procaspase-9的活化和细胞色素C的释放。另一方面,HSP72通过阻止SMAC/Diablo的释放和结合X连锁凋亡抑制蛋白 (X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP) 并增强其稳定性,避免XIAP降解来抑制凋亡[16-18]

本研究结果表明,43 ℃能促进TRAIL蛋白诱导肝癌细胞早期凋亡,46~50 ℃却抑制TRAIL蛋白诱导肝癌细胞早期凋亡。当MHCC97-H细胞转染LncRNA RNU12干扰病毒后受热处理,HSP72的mRNA和蛋白表达水平较干扰前显著下调,说明LncRNA RNU12可能参与了HSP72的表达调控。其中,HSP72蛋白水平在43 ℃组干扰前后差异虽然不显著 (P>0.05),但仍低于未转染组。推测可能与慢病毒不能达到完全干扰效果有关,因而剩余部分LncRNA RNU12基因在受热刺激之后转录增强;也可能在43 ℃条件下还有其他调控机制参与了HSP72的表达,如热休克转录因子 (heat shock transcription factor,HSF)。HSF是否在其中发挥作用,以及其与LncRNA RNU12之间的调控关系,将在下一步研究中加以明确。同时,转染慢病毒载体后,46、50 ℃时TRAIL蛋白诱导细胞凋亡比例显著增加 (P < 0.01),进一步证实下调LncRNA RNU12水平后,抑制下游HSP72表达增加,解除了HSP72的细胞保护作用,细胞对热刺激耐受减弱,凋亡比例升高。最后,RNA-FISH实验证实,当肝癌细胞受热刺激后,LncRNA RNU12在细胞核中大量表达,进一步说明这种调控可能存在于转录水平。

综上所述,当肝癌细胞受亚致死热温度 (46~50 ℃) 处理后,LncRNA RNU12表达增加,增强HSP72的转录活性,进而促进HSP72蛋白的释放,增强细胞对外界温度变化的应对能力,减弱了TRAIL蛋白促肝癌细胞凋亡作用。然而LncRNA RNU12对HSP72具体调控机制尚需进一步研究。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201610224
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

陈施翰, 邓青松, 蒋家云, 邹孟达, 谭运华, 马宽生.
Chen Shihan, Deng Qingsong, Jiang Jiayun, Zou Mengda, Tan Yunhua, Ma Kuansheng.
LncRNA RNU12上调热休克蛋白72抑制重组人TRAIL蛋白诱导肝癌细胞凋亡
LncRNA RNU12 inhibits apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by recombinant human TRAIL protein through up-regulating heat shock protein 72
第三军医大学学报, 2017, 39(9): 833-839
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(9): 833-839
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201610224

文章历史

收稿: 2016-10-31
修回: 2016-01-28

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