2. 710032 西安，第四军医大学口腔医学院牙周科
2. Department of Periodontology, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xi'an, Shaanxi Province, 710032, China
我国高原地域辽阔，各海拔高度均有人居住。研究报道，高原环境人群牙周炎患病率明显高于平原地区，而且随着移居时间的延长，其牙周炎患病率逐渐增高，说明高原低氧可能是引起牙周炎患病率增加的重要原因[1]。低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α) 作为低氧重要的转录因子，通过调节多个下游基因的表达，维持组织和细胞的氧稳态，对低氧应答过程有重要作用[2]。牙周炎症时，激活宿主免疫反应，产生的基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs)，参与牙周组织破坏、降解过程，在牙周炎的发生、发展过程中起重要作用[3]。文献[4]报道，炎症条件下，细胞对氧的适应性调节主要通过调控HIF-1α进而影响MMP2和MMP9的表达，从而影响炎症的发展和转归。另有研究表明，低氧可以改变MMP及其抑制剂 (tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP) 的表达，引起MMP及TIMP表达失衡，在牙周炎的发展过程中起重要作用[5]。而目前关于低氧是如何调控MMP的表达尚不清楚。低氧是否可以通过调控HIF-1α进而影响MMP2的表达，对牙周炎的发生、发展产生影响是目前研究的难点。本研究在低氧条件下，检测牙周炎牙周组织中HIF-1α及MMP2的表达，探究牙周炎与HIF-1α和MMP2表达之间的关系，初步探索HIF-1α对MMP2表达的调控作用，为将来制定高原牙周病的防治策略奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物选择健康成年SD大鼠40只 (由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供)，牙周健康、无龋齿，体质量 (200±20) g，雌雄各半，分笼饲养。
1.1.2 主要仪器及试剂低压氧舱 (中国贵航集团风雷军械厂)，光学显微镜 (Olympus公司)，体视显微镜 (Olympus公司)，戊巴比妥钠 (中国医药上海化学试剂公司)，醋酸泼尼松龙 (浙江仙琚制药股份有限公司)，0.20号正畸结扎丝 (长沙市天天齿科器材有限公司)，SDS-PAGE配制试剂盒 (碧云天生物技术研究所)，PVDF膜 (Roche，美国)，牛血清白蛋白 (碧云天生物技术研究所)，5×蛋白上样缓冲液 (碧云天生物技术研究所)，HIF-1α、MMP2一抗抗体 (Abcam，美国)，山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗抗体 (碧云天生物技术研究所)。
1.2 方法 1.2.1 牙周炎动物模型的建立将40只SD大鼠采用简单随机化分组法分为4组：常氧组 (A组)、常氧牙周炎组 (B组)、低氧组 (C组)、低氧牙周炎组 (D组)，每组10只，雌雄分笼饲养。采用Fischer等[6]方法建立牙周炎动物模型：3%戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 经腹腔注射麻醉，麻醉起效后采用0.20号正畸结扎丝结扎B、D组大鼠右上颌第一磨牙牙颈部，使结扎丝尽量下压于龈沟内，结扎后连续8 d使用醋酸泼尼松龙1.25 mg/(kg·d) 注射大鼠股四头肌，根据牙周炎高糖饮食喂养，对照组不处理。A、B组于平均海拔308 m饲养；C、D组于低压氧舱模拟海拔5 000 m饲养，23 h/d，1 h开舱予以补充饲料及更换垫料。在造模及饲养过程中各组大鼠状态良好，未发现明显异常。
1.2.2 牙周临床指标的检测建模8周后检测大鼠牙龈指数 (gingival index，GI)：采用文献[7]的方法分为4度；菌斑指数 (plaque index，PLI)：采用Sillness和Loe法1964[7]分为4度；牙周探诊深度 (probing depth，PD)：采用Williama牙周探针测量牙周袋底至龈缘的距离；牙槽骨吸收度 (alveolar bone loss，ABL)：采用文献[8]的方法测量釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离。
1.2.3 Western blot建模8周后采用Western blot检测大鼠右上颌第一磨牙牙周组织HIF-1α、MMP2蛋白表达。切取大鼠右上颌第一磨牙牙周组织，常规蛋白提取、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后孵育HIF-1α、MMP2一抗抗体，辣根过氧化物酶标记二抗，ECL化学显色，Bio-Rad凝胶成像系统成像。HIF-1α、MMP2图像经Quantity One软件计算灰度值，与内参灰度值比较后进行统计分析。
1.2.4 组织学表现和免疫组化建模8周后处死大鼠，截取右上颌第一磨牙区段，放入4%多聚甲醛中固定24 h，EDTA脱钙液脱钙后，常规脱水、包埋、切片，HE染色；免疫组化 (S-P) 法检测大鼠牙周组织中HIF-1α、MMP2的表达。
1.3 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，等级资料GI、PLI采用有序Logistic回归分析，计量资料PD、ABL及HIF-1α、MMP2蛋白表达水平进行两因素方差分析，数据以x±s表示，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 牙周临床指标情况 2.1.1 牙龈指数、菌斑指数频数分布比较4组大鼠的牙龈指数及菌斑指数，发现低氧牙周炎组其牙龈指数菌斑指数值最高，表明低氧牙周炎组大鼠的牙龈炎症程度最重，菌斑量最多，差异有统计学意义 (P < 0.05，表 1)。
| 指数分级 | 牙龈指数 | 菌斑指数 | |||||||
| 常氧组 | 常氧牙周炎组 | 低氧组 | 低氧牙周炎组 | 常氧组 | 常氧牙周炎组 | 低氧组 | 低氧牙周炎组 | ||
| 0 | 6 | 0 | 3 | 0 | 7 | 0 | 3 | 0 | |
| 1 | 4 | 2a | 6 | 0 | 3 | 2a | 5 | 1 | |
| 2 | 0 | 6 | 1 | 3 | 0 | 5 | 2 | 1 | |
| 3 | 0 | 2 | 0 | 7bc | 0 | 3 | 0 | 8bc | |
| a：P < 0.05，与常氧组比较；b:P < 0.05，与低氧组比较；c：P < 0.05，与常氧牙周炎组比较 | |||||||||
2.1.2 各组探诊深度和牙槽骨吸收度比较
与其他组比较，低氧牙周炎组探诊深度和牙槽骨吸收度数值最高，差异有统计学意义 (P < 0.05，图 1)。
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| 1：常氧组；2：常氧牙周炎组；3：低氧组；4：低氧牙周炎组a：P < 0.05，与常氧组比较；b：P < 0.05，与低氧组比较；c：P < 0.05，与常氧牙周炎组比较 图 1 4组大鼠牙周探诊深度 (A) 及牙槽骨吸收度 (B) 比较 |
2.2 牙周组织学特征 2.2.1 牙周组织肉眼观察
造模8周后肉眼观常氧组、低氧组大鼠牙周组织无明显改变，常氧牙周炎组、低氧牙周炎组大鼠牙周组织糜烂、大量食糜附着，触之明显出血、溢脓 (图 2)。
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| A：常氧组；B：常氧牙周炎组；C：低氧组；D：低氧牙周炎组 图 2 各组大鼠牙周组织肉眼观察 |
2.2.2 牙周组织HE染色结果
HE染色结果显示，常氧组牙周组织未见明显组织病理学改变；常氧牙周炎组可见沟内上皮糜烂，牙周纤维排列紊乱，牙槽骨轻度吸收；低氧组少量炎细胞浸润；低氧牙周炎组大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，胶原水肿、变性，牙周纤维紊乱、断裂 (图 3)。
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| A：常氧组；B：常氧牙周炎组；C：低氧组；D：低氧牙周炎组 图 3 各组大鼠牙周组织HE染色观察 |
2.3 牙周组织中HIF-1α、MMP2的表达 2.3.1 免疫组化检测各组大鼠牙周组织HIF-1α、MMP2的表达
低氧条件下，HIF-1α、MMP2的表达明显增加；牙周炎症时, HIF-1α、MMP2的表达增加。显微镜下观察大鼠牙周组织中HIF-1α、MMP2的表达阳性染色呈棕黄色。低氧牙周炎组大鼠牙周组织中HIF-1α、MMP2表达量最高，切片组织中可观察到明显的棕黄色颗粒 (图 4)。
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| 图 4 免疫组化检测各组大鼠牙周组织中HIF-1α、MMP2的表达 (S-P) |
2.3.2 Western blot检测各组大鼠牙周组织HIF-1α、MMP2蛋白的表达
低氧条件下，HIF-1α、MMP2的表达明显增加；牙周炎症时, HIF-1α、MMP2的表达增加。低氧牙周炎组HIF-1α、MMP2表达量最高 (P < 0.05，图 5)。
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| A：Western blot检测结果1：常氧组；2：常氧牙周炎组；3：低氧组；4：低氧牙周炎组; B：半定量分析结果a：P < 0.05，与常氧组比较；b：P < 0.05，与低氧组比较；c：P < 0.05，与常氧牙周炎组比较 图 5 HIF-1α、MMP2蛋白表达水平 |
3 讨论
牙周病是发生在牙周支持组织的一种复杂的炎症感染性疾病，主要由革兰阴性菌堆积在牙齿表面，激活宿主的促炎介质，导致牙周组织的破坏，最终导致失牙[9]。目前牙周炎的治疗方法局限，牙周炎失牙率高，促使我们探索新的治疗方法，为牙周炎的治疗提供新思路。研究表明，厌氧菌、牙合创伤、吸烟以及不良口腔卫生习惯均可加重牙周炎的发展进程，而牙周炎不仅对口腔健康有严重的影响，同时影响许多系统性疾病的发生和发展[10]。
本研究利用低氧Fisher等[6]的方法建立牙周炎动物模型，检测低氧及炎症条件下，牙周组织的病理改变及HIF-1α、MMP2的表达情况，发现低氧牙周炎组大鼠牙周炎症程度最重，牙周组织明显充血水肿，大量浆细胞、淋巴细胞浸润，牙周纤维变性、断裂；此外，低氧及炎症均促进了HIF-1α、MMP2的表达，且在低氧合并牙周炎条件下，HIF-1α、MMP2表达量最高，提示低氧可能通过HIF-1α通路调控MMP2的表达，从而加重牙周炎症程度；在常氧条件下，牙周炎组HIF-1α、MMP2表达量也增加，说明牙周炎症同时也可增加HIF-1α、MMP2表达。
HIF-1是低氧重要的转录调控因子，由α和β两个亚基组成，其中β亚基为结构亚基，在常氧及低氧条件下均稳定表达，而α亚基为功能亚基，在常氧条件下其通过泛素化，被蛋白酶水解；而在低氧条件下，这一进程被抑制，α亚基与β亚基结合，进而发挥功能作用[11-12]。Li等[13]研究发现，慢性牙周炎可能使牙周成纤维细胞中HIF-1α转录激活，进一步加重牙周炎的发展。此外，HIF-1α可诱导牙周膜细胞的凋亡和自噬性细胞死亡[14]。这提示通过调控HIF-1α的表达，可能对牙周炎发生、发展有重要作用，为牙周炎的治疗提供新的思路。
炎症细胞因子如MMP在维持细胞炎症状态有重要作用，对于炎症相关的增殖及组织破坏性疾病有重要意义[15]。MMP2作为基质金属蛋白酶家族的重要成员，是一种锌依赖的蛋白酶类，是胚胎发育、组织重建等过程的关键作用因子，其对于细胞外基质的合成和降解发挥重要作用。牙周炎症时，其合成和降解紊乱可能是导致牙周炎症程度加重的重要原因[3, 16]。文献[17]报道，MMP2的表达可能与牙周炎症程度呈正相关。研究发现，低氧时细胞可能通过HIF-1α调控MMP2表达，在血管生成、细胞迁移及伤口愈合等多种病理生理过程中发挥重要作用[18]。尽管目前对于HIF-1α、MMP2的研究较多，而对于低氧、炎症共同作用下牙周组织发生的病理改变仍不清楚，低氧是否通过HIF-1α影响MMP2的表达，炎症是否可以引起局部组织处于低氧状态，进而调控MMP2，加重牙周炎症程度，仍是目前研究的重点及难点。
本研究利用大鼠低氧牙周炎动物模型，研究低氧及炎症对牙周组织的影响，发现低氧及炎症均可促进HIF-1α、MMP2的表达，且HIF-1α与MMP2的表达呈一致性，说明低氧可能通过HIF-1α信号通路促进MMP2的表达，从而加重牙周炎症程度；另一方面，炎症可能使牙周组织局部处于低氧状态，并激活HIF-1α信号通路，影响下游靶基因的表达，进而加重牙周炎症程度。然而，目前关于HIF-1α及MMP2的关系仍不清楚，促使我们进一步探讨HIF-1α与MMP2之间的关系，为将来制定高原牙周病的防治策略奠定理论基础。
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