2. 400038 重庆,第三军医大学西南医院临床血液学教研室
2. Department of Clinical Hematology, Faculty of Laboratory Medicine, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
白血病微小残留病 (minimal residual disease,MRD) 是白血病复发和治疗失败的根源[1],探索安全有效清除MRD的方法有助于提高白血病的治疗效果。造血微环境不仅对造血干细胞 (hematopoietic stem cells,HSCs) 功能维持和成熟分化有重要作用,同时也为白血病细胞提供了庇护场所。造血微环境与白血病细胞的相互作用促进了白血病的发生、发展和残留耐药[2]。间隙连接蛋白 (connexins,Cxs) 是形成间隙连接细胞间通讯 (gap junction intercellular communication,GJIC) 的主要蛋白。GJIC形成使得相邻细胞能够直接交换部分离子、第二信使、代谢物等小分子物质,进而调控细胞增殖、分化及凋亡[3-4]。间隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43) 广泛表达于人体组织[5],在造血组织中,造血微环境的重要功能组分骨髓基质细胞 (bone marrow stromal cells,BMSCs) 被证实存在大量Cx43表达[6]。我们在前期研究中发现,急性淋巴细胞白血病BMSCs中存在Cx43表达和GJIC功能缺失[7],通过上调BMSCs中Cx43表达恢复GJIC功能能够增加Jurkat细胞凋亡和对化疗药物的敏感性[8]。因此,调控微环境中Cx43表达可能有助于清除残留白血病细胞。人脐血源基质细胞 (human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs) 在造血功能重建、微环境损伤修复及促进造血干细胞归巢等方面有着重要作用[9-10]。因此,本研究拟通过Cx43过表达腺病毒修饰hUCBDSCs,在体内、外探讨其对L615白血病细胞的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本来源人脐血取自第三军医大学新桥医院足月健康孕妇脐带血,每份50~80 mL,肝素抗凝,放置于4 ℃,采集后6 h内进行分离培养,脐血收集获得知情同意并通过新桥医院伦理委员会审查 (2010年)。
1.1.2 实验动物和细胞L615小鼠60只 (雌性,6~8周龄,体质量18~22 g) 购自中国医学科学院医学实验动物研究所,L615细胞株购自中国医学科学院血液学研究所。
1.1.3 Cx43过表达腺病毒 (Ad-Cx43-GFP)由本室在前期实验中建立,参见文献[11]。
1.1.4 主要试剂DMEM培养基 (HyClone,美国),RPMI1640培养基、胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS)、马血清 (horse serum,HS) 购自美国Gibco公司,SCF (Sigma,美国),bFGF (Sigma,美国),Ficoll分离液 (密度1.077 g/mL,天津灏洋生物),MSC表型检测试剂盒 (130-095-198,Miltenyi Biotec,德国),兔抗Cx43抗体 (ab11370,Abcam,美国),小鼠抗β-actin抗体 (北京中杉),TRIzol试剂、RT-qPCR引物购自Invitrogen公司,第1链cDNA合成试剂盒 (Roche,美国),SYBR Green (Bio-Rad,美国),细胞凋亡检测试剂盒 (BD-Pharmingen,美国)。
1.1.5 主要仪器荧光倒置显微镜 (OLYMPUS),流式细胞仪 (BD Verse和BD Accuri C6),定量PCR仪 (CFX Connect Real-Time System,Bio-Rad,美国),化学发光成像系统 (Bio-Rad,美国),XS-800i型全血细胞分析仪 (Sysmex)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养L615细胞株用含10%FBS的RPMI1640培养基,在5%CO2、37 ℃培养箱中培养。
1.2.2 hUCBDSCs分离培养和表型检测hUCBDSCs分离培养采用本室已建立的方法[12]。hUCBDSCs表型检测采用第3代hUCBDSCs,参照MSC表型检测试剂盒说明书进行,使用FlowJo 7.6.1软件结果分析。
1.2.3 Ad-Cx43-GFP感染hUCBDSCs采用5代以内hUCBDSCs,向80%生长密度hUCBDSCs中加入Ad-Cx43-GPF,8 h后换液,48 h在倒置荧光显微镜下观察细胞,Cx43在hUCBDSCs中过表达通过Western blot和RT-qPCR证实。
1.2.4 RT-qPCR检测hUCBDSCs中Cx43相对表达具体方法参照文献[8],Cx43上游引物:GCCTACT-CAACTGCTGGAGG,下游引物:CCAGAAGCGCACATGAGAGA;GAPDH上游引物:GTCAAGGCTGAGAA-CGGGAA,下游引物:AAATGAGCCCCAGCCTTCTC。以GAPDH作为内参照进行数据分析。
1.2.5 Western blot检测hUCBDSCs中Cx43表达具体方法参照文献[8]。
1.2.6 细胞凋亡检测采用细胞凋亡试剂盒,按照说明书进行,使用FlowJo 7.6.1软件分析结果。
1.2.7 MRD模型建立将GFP标记的L615细胞 (GFP-L615,1×105个) 通过尾静脉注射入L615小鼠,当能够在外周血中检测到GFP-L615细胞之后3 d,通过腹腔注射环磷酰胺 (CTX,200 mg/kg),连续2周,抑制L615白血病细胞,建立白血病MRD模型 (骨髓中GFP-L615细胞约1%),具体方法参照文献[13]。
1.2.8 造血干细胞移植及分组按照完全随机设计,将L615小鼠分为对照组、BM移植组和Cx43+hUCBDSCs+BM移植组,每组20只。移植组小鼠按照上述方法构建MRD模型,建模成功后,受者MRD小鼠经60Co γ射线4.5 Gy全身照射后4 h内,BM移植组小鼠经尾静脉输入正常L615小鼠来源BM细胞悬液200 μL,其中BM细胞1×106个;Cx43+hUCBDSCs+ BM移植组小鼠经尾静脉输入Cx43-hUCBDSCs和正常L615小鼠来源BM细胞混悬液200 μL,其中Cx43-hUCBDSCs 1×106个,BM细胞1×106个;对照组小鼠经尾静脉输入200 μL生理盐水。分别观察以下指标,① 外周血象:分别在移植后2、5、8、11、14、17 d对小鼠断尾取血,采用全血细胞分析仪检测外周血象;② 骨髓象:移植后17 d,颈椎脱臼法处死小鼠取股骨,用PBS冲出骨髓,瑞氏染色后油镜下计数各细胞比例;③ 肝、脾、骨髓病理变化:移植后17 d,颈椎脱臼法处死小鼠取肝、脾、股骨,4%多聚甲醛固定,股骨用0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 脱钙2~3周,常规石蜡包埋切片后HE染色。
1.2.9 免疫组化染色检测L615小鼠骨髓Cx43表达颈椎脱臼法处死小鼠取股骨,4%多聚甲醛固定后,用0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 脱钙2~3周,股骨软化后,进行石蜡包埋切片。采用免疫组化S-P法检测各组样本Cx43表达。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件,数据以x±s表示,两组比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 hUCBDSCs分离培养及感染Ad-Cx43-GFP后Cx43表达变化细胞接种后约2 d可见有梭形细胞贴壁生长,随着培养时间延长,梭形贴壁细胞逐渐增多,7~10 d融合成片 (图 1)。取第3代对数生长期hUCBDSCs进行表面标志检测,结果显示,CD73、CD105、CD90阳性细胞比例均为100%,而CD14、CD20、CD34、CD45表达阴性。hUCBDSCs感染后48 h分别用RT-qPCR和Western blot检测hUCBDSCs中Cx43的mRNA和蛋白表达变化,以感染Ad-GFP作为对照组。RT-qPCR结果显示,Ad-Cx43-GFP感染组较对照组Cx43 mRNA上升约3倍 (P < 0.01,图 2A)。Western blot检测结果也显示,Ad-Cx43-GFP感染组较对照组Cx43蛋白表达显著升高 (图 2B)。
2.2 hUCBDSCs过表达Cx43对共培养L615细胞凋亡的影响
Ad-Cx43-GFP感染hUCBDSCs后48 h,将处于对数生长期的L615细胞 (5×105个/mL) 与hUCBDSCs共培养。实验分为L615组、L615+hUCBDSCs组、L615+ Cx43+hUCBDSCs组,培养24 h后,采用Annexin V和PI染色检测凋亡细胞比例 (图 3)。结果显示,L615组、L615+hUCBDSCs组、L615+Cx43+hUCBDSCs组L615细胞凋亡比例分别为 (3.53±0.13)%、(6.31±0.99)%、(8.93±1.24)%,L615+Cx43+hUCBDSCs组L615细胞凋亡比例显著增加 (P < 0.01)。
2.3 MRD小鼠移植后外周血象和骨髓象观察
结果显示,Cx43+hUCBDSCs+BM移植组WBC在移植后5 d开始回升,8 d时显著增加,而后逐渐恢复到接近正常水平,而BM移植组WBC回升时间延迟,速度明显减慢,至第17天时仍明显低于正常水平;PLT计数也同样显示,Cx43+hUCBDSCs+BM移植组PLT回升速度和水平都高于BM移植组 (P < 0.05, 图 4)。因Cx43+hUCBDSCs+BM移植组在17 d外周血WBC和PLT计数趋于正常,代表造血重建。因此,选取17 d作为观察点,对各组小鼠取样进行骨髓涂片检查。结果显示,Cx43+hUCBDSCs+BM移植组原始细胞比例为 (7.67±1.25)%,较BM移植组 (56.33±1.25)%显著降低 (P < 0.01),Cx43+hUCBDSCs+BM移植组骨髓细胞比例更加接近于对照组;BM移植组观察到 (11.00±0.82)%异常形态细胞,而在Cx43+hUCBDSCs+BM移植组没有观察到异常形态细胞 (表 1、图 5)。
组别 | 原始粒细胞 | 早幼粒细胞 | 晚幼粒细胞 | 成熟粒细胞 | 红细胞 | 淋巴细胞 | 单核细胞 | 异常细胞 |
对照组 | 15.33±1.89 | 20.00±0.82 | 16.00±2.16 | 17.33±1.70 | 3.67±0.94 | 27.00±1.63 | 0.66±0.47 | 0 |
Cx43+hUCBDSCs+BM移植组 | 7.67±1.25a | 17.67±0.94 | 17.00±2.16 | 15.67±0.94 | 16.00±2.16a | 21.33±2.05a | 4.67±2.05 | 0 |
BM移植组 | 56.33±1.25b | 1.00±0.82b | 5.00±0.82b | 1.33±0.47b | 5.67±0.94 | 17.67±1.89b | 2.00±0.82 | 11.00±0.82 |
a:P < 0.05,b:P < 0.01,与对照组比较 |
2.4 MRD小鼠移植后组织病理观察
移植后17 d,Cx43+hUCBDSCs+BM移植组肝窦内仅有少量白血病细胞浸润,浸润范围局限,而BM移植组白血病细胞浸润范围明显增加,肝窦内存在大量白血病细胞,肝脏正常结构破坏 (图 6A、B、C)。在脾脏病理切片中同样观察到Cx43+hUCBDSCs+BM移植组较BM移植组白血病细胞浸润减少,且显示轻微结构破坏,而BM移植组脾脏白髓和红髓等正常结构消失,出现大量白血病细胞 (图 6D、E、F)。骨髓病理切片显示,Cx43+hUCBDSCs+BM移植组骨髓增生较对照组活跃,而BM移植组则出现大量白血病细胞,增生极度活跃,提示BM移植组出现白血病复发 (图 6G、H、I)。
2.5 MRD小鼠移植后骨髓Cx43表达变化
Cx43+hUCBDSCs+BM移植组骨髓Cx43表达明显高于BM移植组,更加接近对照组水平 (图 7)。
3 讨论
白血病微小残留病难以彻底清除是白血病难以治愈的主要原因,积极探索清除残留白血病细胞的新方法对白血病治疗具有重要意义。造血微环境是支持正常造血功能的土壤,越来越多的研究表明造血微环境有助于庇护白血病细胞抵抗传统化学治疗[14-15],不仅如此,白血病细胞还可以通过主动重塑造血微环境进而影响正常造血和疾病进展[2, 16]。因此,靶向造血微环境联合传统治疗可能为清除残留白血病细胞提供新的策略。
Cxs是一类能够形成GJIC的跨膜蛋白,Cx43是Cxs家族中的成员,在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等实体肿瘤发生、发展过程中起到了重要作用[17-19],通过上调Cx43表达能够抑制肿瘤细胞增殖[20],并逆转肿瘤干细胞的恶性表型[4],表明Cx43可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。
在造血组织中,造血微环境的重要功能组分BMSCs中存在大量Cx43表达,而我们前期研究发现急性白血病造血微环境BMSCs中Cx43表达减少进而引起GJIC功能减低甚至缺失[7],上调急性白血病BMSCs中Cx43表达,恢复其介导的GJIC功能,能够在体外促进Jurkat细胞自发和药物诱导的凋亡[8],因此通过调控造血微环境中Cx43表达可能有助于清除残留白血病细胞延缓疾病复发。本研究在体外通过Cx43过表达腺病毒上调hUCBDSCs中Cx43表达,发现Cx43-hUCBDSCs能够增加共培养L615白血病细胞凋亡。随后,我们进一步在体内观察Cx43-hUCBDSCs对残留白血病细胞的作用。利用MRD小鼠模型模拟临床上白血病患者治疗后白血病细胞残留,通过BM单独移植或Cx43+hUCBDSCs+BM联合移植,发现Cx43+hUCBDSCs+BM联合移植相较于BM单独移植,能够更早、更快的使得MRD小鼠外周血WBC和PLT恢复,延缓MRD小鼠髓内复发,肝、脾、骨髓病理切片也同样提示,Cx43+hUCBDSCs+BM联合移植能够减轻MRD小鼠肝、脾、骨髓等器官病变,延缓疾病进展。我们前期研究已证实化疗后完全缓解的急性白血病低瘤荷患者其微环境中Cx43表达增加[7],通过免疫组化染色我们发现Cx43+hUCBDSCs+BM联合移植MRD小鼠骨髓中Cx43表达增加,这也说明Cx43-hUCBDSCs在体内有助于降低L615白血病细胞负荷,延缓MRD小鼠疾病进展,而骨髓中Cx43表达增加也可能进一步有助于清除残留白血病细胞。
既往研究表明,Cxs家族蛋白在白血病形成和耐药过程中可能扮演了重要角色。Cxs介导的GJIC构成了白血病细胞与造血微环境间交换、通讯的桥梁。Weber等[21]证实白血病细胞与BMSCs之间能够形成功能性间隙连接,通过GJIC形成BMSCs能够在体外抑制白血病细胞增殖并调节其细胞周期[22]。本研究通过上调hUCBDSCs中Cx43表达,证实Cx43-hUCBDSCs能够在体外增加L615细胞凋亡,在体内证实Cx43-hUCBDSCs联合造血干细胞移植能够阻抑MRD小鼠移植后复发。上调hUCBDSCs中Cx43表达促进L615细胞凋亡并阻抑MRD小鼠移植后复发的详细机制目前还不清楚,值得我们深入研究。
综上所述,提高白血病患者骨髓微环境基质细胞Cx43介导的GJIC,可能成为白血病传统治疗的辅助手段,改善白血病的治疗效果,特别是对MRD复发起到一定的控制作用,为清除残留白血病细胞提供了新思路和方法。在临床应用的药物,例如全反式维甲酸也能增加Cx43表达[23],是否可以通过增强GJIC功能发挥阻抑白血病复发的作用也需要进一步临床验证。
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