炎症性肠病 (inflammatory bowel disease, IBD) 是免疫系统异常引起的宿主免疫炎症损伤性肠道疾病,包括溃疡性结肠炎和克罗恩病,显著增加了患结肠癌的风险,严重危害人类的健康[1-3]。现有的研究表明,CD4+ T细胞作为机体免疫系统的重要组成部分,在IBD的发生、发展过程中具有重要作用,然而其功能调控机制仍待深入阐明。新近研究表明,微小RNA-126(microRNA-126,miR-126) 作为miRNAs家族重要成员之一,参与了机体多种免疫细胞发育和功能的调控,以及相关临床疾病的发生过程[4-9]。然而,miR-126是否可通过调控CD4+ T细胞功能,参与IBD的发生仍不清楚。本研究利用前期构建的miR-126敲减 (knock down,KD) 小鼠模型[10-11],观察miR-126基因敲减后对葡聚糖硫酸钠 (dextran sulphate sodium,DSS) 诱导的小鼠自身免疫性肠炎损伤以及CD4+ T细胞活化的影响,为后续进一步探讨miR-126对CD4+ T细胞功能调控作用和IBD的发生机制提供新的实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物FVB野生型小鼠做对照组南京生物公司构建的FVB/miR-126基因敲减小鼠作为实验组,分别取6只第3代8-10同龄、80~100 mg雌性小鼠进行实验。
1.2 主要试剂和仪器4%多聚甲醛购自重庆川东化工公司;HE染色液 (泰康医疗);Mouse CD4+ CD62L+ T Cell Iso Kit Ⅱ分选试剂 (德国Miltenyi Biotec公司);抗小鼠CD4、CD8、CD62L、CD44流式抗体 (美国eBiosicence公司);羧基荧光素双乙酸盐 (carboxyfluorescein diacetate, succinimidy1 ester, CFSE) (上海浩然生物技术有限公司);SW-CJ-2FD型超净工作台 (苏州净化设备厂);Ⅸ-51倒置显微镜、Ⅸ-71倒置荧光显微镜 (日本Olympus公司);低温高速离心机 (美国Thermo公司);流式细胞仪 (美国eBioscience公司)。
1.3 自身免疫性肠炎模型的建立用3% DSS蒸馏水溶液分别喂养8~10周龄的WT和miR-126KD小鼠 (n=6),第3~5天小鼠出现稀便、血便等大便性状改变现象,且活动明显减少,精神状态较差。自由饮用7 d后替换成正常饮用水继续喂养,第14天后处死小鼠作为实验组。未饮用DSS蒸馏水溶液的小鼠作为健康对照组 (n=6)。
1.4 HE染色检测小鼠大肠组织病理变化断颈法处死1.3中造模成功的WT和miR-126KD小鼠以及健康对照组小鼠,分别取出所要观察的结肠组织,4%甲醛固定24 h后,石蜡包埋,切片成5 μm厚度,苏木精-伊红 (HE) 染色,显微镜下观察其病理结构变化。
1.5 脾脏组织单细胞悬液的制备断颈法处死待检测小鼠,75%的酒精内浸泡5 min,超净台中分别取出小鼠脾脏组织后置于加有10 mL PBS缓冲液的平皿中,然后于200目无菌细胞筛上研磨组织,过滤2次;将细胞悬液转移至15 mL离心管中,1 200 r/min离心10 min;弃上清,弹匀剩余液体和细胞,加入3 mL红细胞裂解液,置于冰上15 min;加入10mL PBS缓冲液重悬细胞,1 200 r/min离心10 min,弃上清,弹匀剩余液体和细胞后,然后加入PBS缓冲液于200目筛网再次过滤,重复洗涤2次,将细胞液收集于新的15 mL离心管中,即得到脾脏组织单细胞悬液。
1.6 淋巴细胞膜分子检测取制备好的待测单细胞悬液 (106~107个),用100 μL PBS缓冲液重悬细胞,转移至专用流式管中,分别加入流式抗体:抗小鼠CD4-Percp-Cy5.5、CD8-Percp-Cy7、CD62L-PE、CD44-APC各1 μL,混匀,置于冰上避光孵育30 min,然后用PBS液洗涤2遍,1 200 r/min离心10 min;弃上清,弹匀细胞后,加入300 μL PBS重悬细胞,上流式细胞仪检测。
1.7 MACS分选小鼠CD4+ CD62L+ T细胞取1.5中获得的小鼠脾脏组织单细胞悬液,计数,按照10 μL/107的比例,避光加入CD4+ T细胞Biontin-Antibody Cocktail Ⅱ,混匀,4 ℃,15 min;加入30 mL PBE,按照20 μL/107细胞的比例,避光加入Anti-Biotin MicroBeads,混匀,4 ℃,20 min;加入PBE至15 mL,1 200 r/min离心10 min,弃上清,弹匀剩余液体和细胞,加入2 mL PBE液;将带有抗体的细胞液转移至LS柱,收集于新的15 mL离心管中,计数,1 200 r/min离心10 min,弃上清,加入800 μL PBE重悬细胞,按照10 μL/107细胞的比例,避光加入CD62L (L-selectin) MicroBeads,混匀,4 ℃,20 min;1 200 r/min离心10 min,弃上清,弹匀剩余液体和细胞,加入2 mL PBE液;然后将带有抗体的细胞液转移至LD柱,收集CD4+ CD62L- T细胞和CD4+ CD62L+ T细胞备用。
1.8 过继转输模型的建立取MACS分选获得的WT和miR-126KD小鼠CD4+ CD62L+ T细胞,使细胞重悬于1640培养基中,浓度为1×106/mL,每毫升细胞液中加入2 μL CFSE,再用2 mL PBS缓冲液稀释,37 ℃孵育30 min后,加入5倍体积的含2%胎牛血清的PBS,轻轻吹匀细胞,终止染色。分别按照每只小鼠1×107个细胞经尾部静脉注射给同周龄WT小鼠,然后用3% DSS蒸馏水溶液喂养,第14天后处死小鼠 (n=6)。
1.9 统计学分析实验数据以x±s表示。采用SPSS 16.0统计软件和Graph Pad PrismTM (Graphpad Software Inc.) 软件,组间比较采用两独立样本t检验,检验水准:α=0.05。所有实验均重复3次。
2 结果 2.1 DSS肠炎模型小鼠肠组织病理损伤加重HE染色结果显示,与健康对照组相比,实验组WT小鼠肠绒毛缺失不完整,黏膜上皮出现溃疡,炎性细胞浸润增加;然而,模型组miR-126KD小鼠肠绒毛脱落更为显著,出现较大溃疡,且炎细胞浸润非常明显 (图 1)。
2.2 miR-126基因敲减DSS肠炎模型中CD4+ T细胞比例显著增加
FACS分别检测各组小鼠脾脏中CD4+ T细胞的比例变化。结果显示,与WT对照小鼠相比,miR-126基因敲减后,小鼠脾脏中CD4+ T细胞比例明显增加 (图 2)。
2.3 miR-126基因敲减DSS肠炎模型中CD62L和CD44的表达
流式细胞术检测各组小鼠脾脏组织中CD4+ T细胞表面活化分子CD62L和CD44的比例变化。结果显示,与WT对照小鼠相比,miR-126基因敲减后,小鼠脾脏中CD4+ T细胞表面活化分子CD62L的比例明显减少,而CD44的比例显著增加 (图 3)。
2.4 miR-126基因敲减过继转输小鼠肠组织损伤加重
HE染色结果显示,与对照WT小鼠CD4+ CD62L+ T细胞转输组相比,miR-126KD小鼠CD4+ CD62L+ T细胞过继转输组小鼠的结肠组织炎性细胞浸润明显增加 (图 4)。
2.5 过继转输实验中CD4+ T细胞CD62L和CD44的表达
流式细胞术检测结果显示,与对照转输组相比,miR-126KD小鼠CD4+ CD62L+ T细胞转输组小鼠的脾脏中,CFSE+细胞表达表面活化分子CD62L的比例明显减少,而CD44的比例显著增加 (图 5)。
3 讨论
近来研究表明,微小RNAs在IBD的发生中发挥了关键作用[12]。如Maoa等[13]研究发现,下调的miR-139-5-p通过PI3K/AKT/Wnt信号通路,促进结肠炎及相关肿瘤的发生。Runtsch等[14]还发现,miR-146a在肠道屏障功能中扮演着重要角色,促进小鼠DSS结肠炎的病理损伤。对于miR-126而言,Paraskevi等[15]报道,在IBD患者外周血中,循环的miR-126水平明显增加。Chen等[16]进一步通过系统评价分析发现,作为IBD发生中关键信号途径——NF-κB途径的调节分子之一——miR-126水平变化与IBD密切相关。这些研究表明miR-126参与了IBD的发生过程。本研究我们利用前期构建的miR-126KD小鼠模型[10-11],观察发现miR-126基因敲减后,小鼠肠组织损伤明显加重,且炎症细胞浸润显著增加,提示miR-126敲减后可显著促进DSS诱导肠炎的发生。He等[17]报道miR-301a基因敲减后,其靶分子SNIP1显著上调,抑制Th17细胞的分化,对IBD的发生具有重要意义。Feng等[18]发现miR-126在临床IBD患者肠组织中表达明显上调,且与其靶分子I (IκBα) 的表达呈负相关。然而,本研究发现,在miR-126基因敲减小鼠模型体内通过DSS介导自身免疫性肠炎的发生过程中,肠损伤明显增加,且该损伤与CD4+ T细胞活化功能增强相关。结合到当前的实验结果,我们推测miR-126可能作为一个新的负性调控分子,参与IBD的发生过程。然而,鉴于IBD发生机制的复杂性和实验模型的局限性,miR-126在IBD发生中的确切调控效应及机制,包括对CD4+ T细胞亚群分化和其他免疫细胞功能的调控作用等,仍有待后续深入研究阐明。
CD4+辅助性T细胞的生物学功能异常与IBD的发生密切相关[19-20]。Dotan等[21]报道IBD患者肠上皮细胞损伤中CD4+ T细胞增殖能力增强,且IFN-γ分泌增加。Holmkvist等[22]研究发现,CD4+ T细胞可介导过继转输肠炎的发生,且该效应与其活化和功能变化密切相关。然而,miR-126对于CD4+ T细胞功能的调控及相关机制仍待阐明。我们前期研究发现miR-126敲减后CD4+ T细胞体内、外活化能力明显增强[23]。Hosokawa等[24]发现miR-126可通过靶向调控磷脂酰基醇3激酶调节亚基2(phosphoinositide-3-kinase,regulatory subunit2,PIK3R2) 的表达,促进CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的活化。本研究发现,miR-126敲减后,IBD模型小鼠体内CD4+ T细胞高表达CD44分子,而低表达CD62L分子,显示活化能力明显增加。过继转输实验结果显示,miR-126敲减后的CD4+ T细胞不仅介导了更明显的肠组织损伤,同时也高表达CD44分子、低表达CD62L分子,提示miR-126敲减后导致的IBD病理损伤加重,与CD4+ T细胞活化功能增强密切相关。Mattes等[25]发现下调miR-126的表达可改变CD4+ T细胞向Th2亚群分化,对气道炎性疾病的发生具有一定的调控作用。我们前期研究发现miR-126通过PI3K/AKT信号通路诱导CD4+ Foxp3+调节性T细胞的分化[26]。这些研究表明miR-126作为miRNAs家族重要成员之一,不仅对于CD4+ T细胞的功能,且对于其亚群分化均具有重要调控作用,并参与相关临床疾病的发生过程。然而,其相关机制有待后续研究进一步阐明。
综上所述,本研究我们发现miR-126基因敲减可显著影响自身免疫性结肠炎模型的发生,且与CD4+ T细胞活化改变有关,为后续深入探讨miR-126分子对CD4+ T细胞功能的调控作用和IBD的发生机制提供新的实验依据。
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