心血管疾病是慢性肾脏病 (chronic kidney disease,CKD) 患者最主要的并发症以及首要的死亡原因。血管钙化是CKD患者心血管疾病发生的重要因素[1-2]。研究表明,CKD患者常常伴发高磷血症,而高磷血症是导致CKD患者血管钙化及心血管疾病的重要因素[3]。高磷血症在CKD患者血管钙化中如何发挥作用,其机制尚未明确。因此探索高磷血症诱导CKD状态下血管钙化的发生机制,并提出相应的防治措施显得十分重要。目前研究证实,在高磷诱导下,体外培养的血管平滑肌细胞可以向成骨样细胞表型转换,并且还可以诱导血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells,VSMCs) 凋亡并促进其释放基质小泡等方式直接导致血管钙化[4]。VSMCs是血管中膜最重要的组成部分,而高磷可诱导CKD患者的血管钙化,尤其是中膜钙化,因此高磷诱导VSMCs向成骨样细胞表型转换是CKD患者血管钙化的关键环节[5]。既往研究表明,炎症不仅在慢性肾脏病的发生、发展中起到重要的作用[6],在CKD患者血管钙化中也发挥着重要的作用[7]。核转录因子-κB (nuclear transcription factor κB,NF-κB) 与血管钙化密切相关[8],而Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4) 是激活NF-κB的重要跨膜蛋白[9],TLR4/NF-κB这一经典的炎症信号通路也参与了血管钙化过程。那么TLR4/NF-κB信号通路是否在高磷诱导血管平滑肌细胞成骨样分化及钙化的过程中发挥作用?本研究通过细胞转染、茜素红S等方法拟明确TLR4/NF-κB在高磷诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转换的作用,并进一步观察抑制TLR4/NF-κB信号通路是否可以抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞向成骨样分化及血管钙化,以期为CKD患者心血管并发症的治疗提供新靶点和新思路。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂VSMCs细胞株购自美国ATCC细胞库,DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司,胰酶购自美国HyClone公司,胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司,NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯及β-actin、NF-κB、p-NF-κB抗体购自北京碧云天生物技术研究所,其余抗体购自Abcam公司,TLR4-siRNA购自美国Santa Cruz公司。
1.2 细胞培养及分组将冻存的VSMCs细胞株复苏,置于37 ℃,5% CO2的恒温培养箱中用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养。当细胞融合率达到80% ~90%时用0.25%胰酶进行消化传代。
实验先分为2组:① 正常对照组,使用正常含10%胎牛血清的培养基;② 高磷组,使用培养基含有2.6 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4。其次使用PDTC,观察抑制NF-κB活化对高磷诱导VSMCs向成骨样细胞表型转换的影响,分为4组:① 正常对照组,使用正常含10%胎牛血清的培养基;② 高磷组,使用培养基含有2.6 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4;③ PDTC组,使用培养基含20 μmol/L PDTC;④ 高磷+PDTC组,使用培养基含2.6 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4和20 μmol/L PDTC。最后使用TLR的小分子干扰RNA,观察抑制TLR的表达,对高磷诱导VSMCs向成骨样细胞表型转换的影响,分为6组:① 正常对照组,使用正常含10%胎牛血清的培养基;② 正常对照+control siRNA组,使用正常含10%胎牛血清的培养基并转染control siRNA;③ 正常对照+TLR4siRNA组,使用正常含10%胎牛血清的培养基并转染TLR4 siRNA;④ 高磷组 (HP),使用培养基含2.6 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4;⑤ 高磷+control siRNA组 (HP+control siRNA),使用培养基含2.6 mmol/L Na2HPO4/ NaH2PO4并转染control siRNA;⑥ 高磷+TLR4 siRNA组。
1.3 细胞爬片茜素红S染色及钙含量测定细胞爬片的制备及染色:① 细胞爬片的处理:将盖玻片用超声清洗仪清洗1.5 h左右,清洗干净后用冰醋酸浸泡12 h,取出用双蒸水清洗3次,晾干放入75%酒精备用;② 细胞爬片的制备:将玻片烤干后放入细胞培养板中,用胰酶消化收集处于对数生长期的VSMCs,并将细胞数调至1×105~2×105/mL,将细胞悬液滴至细胞培养板中,每孔1 mL,放置于CO2培养箱中培养24~48 h;③ 茜素红S染色:细胞爬片用预冷的4%多聚甲醛固定15 min,PBS冲洗3次,1%茜素红S (pH 4.3),37 ℃染色30 min后用PBS漂洗3遍至背景干净,然后在倒置显微镜下观察钙化灶呈深红色;观察完毕后加入10%氯化十六烷基吡啶溶解固定的钙化灶,于540 nm波长测定光密度值[D (540)],进行统计学分析。
1.4 Western blot检测VSMCs按4×105/mL接种于6孔板中,按1.2中分组条件培养5d后收集细胞,提取蛋白并用BCA法进行蛋白定量,加入蛋白上样Loading Buffer后99 ℃变性10 min。制备SDS-PAGE凝胶,进行SDS-PAGE电泳、转印。5%脱脂奶粉封闭,加入一抗 (NF-κB 1:250、p-NF-κB 1:250、TLR4 1 :250、Runx2 1:500、BMP2 1:500、SM22α 1:1000、β-actin 1:1 000),4 ℃孵育过夜。加入HRP标记的二抗 (1:3 000)37 ℃孵育1 h,于Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像系统显影成像。用Image J软件扫描灰度值,以β-actin为内参,计算两者比值分析蛋白质相对表达量,进行统计学分析。
1.5 统计学分析每个实验重复3次,采用SPSS 22.0统计软件,数据以x±s表示,两组间比较用t检验,多组间比较用单因素方差分析。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 高磷对VSMCs钙盐沉积的影响在倒置显微镜下观察VSMCs细胞爬片的茜素红染色情况,正常对照组的VSMCs细胞未见红色钙化斑块,而高磷组钙化斑数量显著增加 (图 1)。半定量检测结果显示高磷组光密度值明显高于正常对照组[(0.079 ±0.011) vs (0.193 ±0.017),P < 0.01]。
2.2 高磷对VSMCs表型蛋白表达的影响
Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高磷孵育后,高磷组的TLR4、p-NF-κB表达明显升高 (P < 0.01),与成骨样分化及钙化相关的BMP2、Runx2蛋白表达明显上调 (P < 0.01),而平滑肌细胞标志物SM22α表达则明显减少 (P < 0.01,图 2)。表明高磷可诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转换,同时高磷也上调了TLR4和p-NF-κB蛋白的表达。
2.3 NF-κB抑制剂PDTC对高磷诱导VSMCs钙盐沉积的影响
为进一步研究NF-κB在高磷诱导血管平滑肌细胞钙化中的作用,使用NF-κB抑制剂PDTC处理血管平滑肌细胞。VSMCs细胞爬片的茜素红S染色结果显示,与高磷组相比,经过NF-κB抑制剂PDTC预孵育组的VSMCs钙盐沉积明显减轻 (图 3)。半定量检测结果显示,高磷+PDTC组光密度值明显低于高磷组[(0.121 ±0.013) vs (0.217 ±0.031),P < 0.01]。
2.4 NF-κB抑制剂PDTC对高磷诱导的VSMCs表型蛋白表达的影响
Western blot检测结果显示,与高磷组相比,NF-κB抑制剂PDTC预孵育后,高磷+PDTC组的p-NF-κB表达明显下调 (P < 0.01)。与成骨样分化及钙化相关的BMP2和RUNX2蛋白的表达也相应下降 (P < 0.01),而平滑肌细胞标志物SM22α的表达则显著上升 (P < 0.01)。提示在使用了NF-κB抑制剂PDTC预孵育后,p-NF-κB的表达明显减少,同时抑制了高磷诱导VSMCs成骨样分化和钙化 (图 4)。表明NF-κB参与高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化。
2.5 转染TLR4小分子干扰RNA对高磷诱导VSMCs表型蛋白表达的影响
Western blot检测结果显示,与高磷组相比,转染TLR4小分子干扰RNA后,VSMCs的TLR4[(0.117±0.047) vs (0.377±0.012),P < 0.01]表达明显受到抑制,与此同时,p-NF-κB[(0.264±0.013) vs (0.601± 0.027),P < 0.01]的表达也相应下降。与成骨样分化及钙化相关的BMP2和RUNX2蛋白的表达下调 (P < 0.01),平滑肌细胞标志物SM22α的表达则显著上升 (P < 0.01,图 5)。表明转染TLR4 siRNA后,TLR4表达量下调的同时,p-NF-κB的表达也相应下降,从而抑制了高磷诱导的血管平滑肌钙化。
3 讨论
血管钙化是心血管疾病发生和发展的重要病理基础,而中膜钙化是CKD患者血管钙化的特征,CKD患者血管钙化可促进心血管事件的发生和发展,从而影响CKD患者生存率。因此明确CKD患者血管钙化的机制对于控制CKD心血管疾病的发生发展以及死亡率有着非常重要的意义。
目前的临床研究证据显示,高磷血症是CKD患者常见的临床特征之一,且高磷血症是导致血管钙化以及心血管疾病的重要因素[3],降低血磷水平可明显减轻血管钙化[11]。然而高磷血症在CKD患者血管钙化及心血管疾病的发生、发展中如何发挥关键作用,其机制尚未明确。本研究以小鼠VSMCs细胞株为研究对象,证实VSMCs在高磷环境的诱导下会逐渐失去平滑肌细胞的表型,而向成骨样细胞表型转换。茜素红S染色也同时观察到了VSMCs发生钙化,这与文献[12]报道的结果一致。既往研究表明,CKD大鼠模型在发生血管钙化的同时往往伴随着各类炎性因子释放的增多,动脉 (尤其是大中动脉) 的动脉壁炎症细胞浸润及炎性因子 (IL-6、TNF-α等) 释放所引发的级联反应,可使血管平滑肌逐渐失去平滑肌细胞的表型,而向成骨样细胞表型转换,最终导致并加速动脉钙化[7,13]。Toll样受体家族是参与天然免疫 (非特异性免疫) 的一类重要的蛋白质家族,也与慢性炎症反应密切相关, 在缺血再灌注肾损伤、急性肾损伤、慢性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、糖尿病肾病等急慢性肾脏病中均发挥着重要作用。TLR4是最早发现的TLR亚型,其与配体结合后通过跨膜结构将病原相关信号传导至细胞内,启动髓样分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88, MyD88) 依赖性以及非MyD88依赖性信号转导途径,磷酸化NF-κB使其激活[9,14]。NF-κB是由p50和p65组成的异源二聚体的形式存在的重要的转录因子,在多种炎性因子转录过程中发挥了关键作用。在静息状态下,NF-κB二聚体与抑制单位IκB (inhibitor of NF-κB, IκB) 结合,存在于胞质中;当受到信号刺激时,IκB发生磷酸化并降解,解离后的NF-κB二聚体进入细胞核内,与特定的DNA序列相结合,激活相关基因的转录,使细胞开始合成各类炎性因子[15-16]。因此,TLR4/NF-κB信号通路在CKD炎症反应中发挥着重要的作用,但是它在高磷血症诱导VSMCs成骨样表型转换中的作用还有待进一步阐明。本研究发现,在体外培养VSMCs,高磷诱导其向成骨样表型转换的同时,TLR4和p-NF-κB的表达也明显增高,结果显示TLR4/NF-κB信号通路在高磷诱导VSMCs成骨样表型转换中可能起到了重要作用。为了进一步明确TLR4/NF-κB信号通路在高磷诱导VSMCs向成骨样表型转换中的作用,我们使用NF-κB的抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯预孵育VSMCs,结果显示PDTC处理组和高磷组相比,VSMCs的p-NF-κB表达量明显降低,与成骨样表型相关的BMP2和RUNX2的表达量都有不同程度的降低,茜素红染色也发现细胞的钙盐沉积都得到了明显的改善。结果提示高磷可通过诱导NF-κB的活化使VSMCs向成骨样表型转换和钙化,而NF-κB的抑制剂PDTC处理组VSMCs钙化则明显减轻。最后我们向VSMCs转染TLR的小分子干扰RNA,观察到VSMCs的TLR4蛋白表达量减少的同时,p-NF-κB表达量也相应降低,BMP2和RUNX2的表达量也明显下降,而平滑肌细胞标志物SM22α的表达则显著上升。提示高磷可能通过TLR4/NF-κB信号通路诱导VSMCs向成骨样表型转换和钙化。
综上所述,本实验验证高磷可以诱导血管平滑肌细胞向成骨样表型转换,进一步对VSMCs向成骨样表型转换和钙化的机制进行探讨,发现高磷诱导TLR4/NF-κB信号通路的激活可能是VSMCs向成骨样表型转换及钙化的重要机制之一,但在CKD患者血管钙化中是否发挥着关键作用还有待更深入的体内研究。
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