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孕期炎症刺激对子代大鼠心肌纤维化的影响
温燕, 刘雅     
400038 重庆,第三军医大学药学系药物研究所暨药剂学教研室
[摘要] 目的 探讨孕期炎症刺激对子代大鼠心肌纤维化的影响。 方法 8只SD孕鼠采用随机数字表法完全随机分为:对照组 (Con) 和脂多糖 (lipopolysaccharides,LPS) 刺激组,每组4只。分别在孕第8、10、12天腹腔注射0.5 mL生理盐水或LPS (0.79 mg/kg)。仔鼠6、8、10、12、16周龄测尾动脉血压;组织切片Masson染色观察心肌组织纤维化;透射电镜观察心肌显微结构;实时荧光定量PCR检测心肌组织缝隙连接蛋白 (Connexin, Cx) 43、微管相关蛋白1轻链3B (microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B)、DNA甲基转移酶-1 (DNA methyltransferase 1, DNMT-1) mRNA表达水平;Western blot检测Cx43、LC3B、DNMT-1蛋白表达。 结果 与Con组子代相比,LPS组子代大鼠6、8、10、12、16周龄时血压均明显升高 (P < 0.01);心肌组织胶原沉积增多,细胞间缝隙连接减少,自噬小体数量增加;Cx43和DNMT-1 mRNA表达水平显著增加 (P < 0.05),而LC3B的mRNA表达水平显著下降 (P < 0.05);Cx43蛋白表达水平较Con组子代明显降低 (P < 0.05),LC3BⅡ/LC3BⅠ和DNMT-1的蛋白表达水平均明显增加 (P < 0.05)。 结论 孕期炎症刺激可导致子代大鼠心肌纤维化。这可能与孕期炎症刺激子代大鼠心肌组织自噬活化及Cx43蛋白表达降低相关。
[关键词] 孕期炎症     心肌纤维化     缝隙连接蛋白43     自噬    
Maternal lipopolysaccharides exposure during pregnancy induces myocardiac fibrosis in offspring rats
Wen Yan , Liu Ya     
Institute of Materia Medica and Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81573440, 81373420)
Corresponding author: Liu Ya, Tel: 86-23-68753397, E-mail:liuya1979@hotmail.com
[Abstract] Objective To explore the effect of maternal exposure to lipopolysaccharides (LPS) during pregnancy on myocardial fibrosis in offspring rats. Methods Eight pregnant rats were randomized into 2 equal groups to receive intraperitoneal injections of saline (control) or LPS (0.79 mg/kg) at the 8th, 10th, and 12th days of gestation. The offspring rats were examined at 6, 8, 10, 12, and 16 weeks after birth for systolic blood pressure using the tail-cuff method, and the ventricular histopathology was observed with Masson staining and transmission electron microscopy. The left ventricular myocardial tissues of the offspring rats were sampled for detecting the mRNA and protein expression levels of connexin (Cx) 43, microtubule-associated protein 1 light chain 3B (LC3B) and DNA methyltransferase 1 (DNMT1) using real-time PCR and Western blotting. Results Compared with those in the control group, the offspring rats in LPS group showed significantly increased systolic blood pressure at 6, 8, 10, 12, and 16 weeks after birth (P < 0.01). No detectable pathological changes were observed in the offspring rats in the control group, whereas those with maternal LPS exposure presented with obvious myocardial pathologies in the left ventricle characterized by increased collagen deposition, disrupted myofibrils, decreased gap junctions, and an increased number of autophagosomes. The offspring rats with maternal LPS exposure showed significantly increased myocardial expression of Cx43 and DNMT-1 mRNA (P < 0.05) and decreased LC3B mRNA expression (P < 0.05) but with obviously decreased protein expression of Cx43 (P < 0.05) and increased expression of LC3BⅡ/LC3BⅠ and DNMT-1 proteins (P < 0.05). Conclusion Maternal LPS exposure during pregnancy can cause cardiac fibrosis in offspring rats possibly through a mechanism involving autophagy activation and Cx43 degradation.
[Key words] prenatal inflammation     myocardial fibrosis     connexinn 43     autophagy    

心血管疾病的高发病率和致死率造成沉重的经济和社会负担,成为全球关注的重大健康话题。心肌纤维化 (myocardial fibrosis,MF) 是多种心血管系统疾病终末期的共同病理表现,有效地抑制或逆转心肌纤维化是目前临床防止心力衰竭、心律失常及心源性猝死等严重不良事件的重要策略[1]。其形成机制复杂,目前并未完全阐明。因此从全新角度探索心肌纤维化潜在致病机制,寻找新的防治靶标,对有效降低心血管事件的发生具有重要意义。

本研究室前期研究发现,在大鼠孕期给予炎症刺激剂脂多糖 (lipopolysaccharides, LPS) 或酵母多糖,可导致子代大鼠较正常仔鼠血压明显升高,24周龄时达到高血压标准[2];随着血压的升高,仔鼠16周龄出现心室重构,32周龄时心室重构加剧并伴有心肌舒张功能障碍[3]。鉴于血压升高导致的心室后负荷持续加重是诱导心肌纤维化、心室重构乃至心力衰竭的主要因素之一[4],本研究拟对孕期炎症刺激子代大鼠心肌纤维化及其可能机制进行初步探讨。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

本实验已通过第三军医大学伦理委员会审查。清洁级SD孕鼠购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心。其中成年孕鼠周龄为12~16周,孕期为2~3 d,体质量为250~300 g。TRIzol (Thermo,美国),逆转录试剂盒及扩增试剂盒 (DBI,德国),脂多糖 (Sigma,美国),氯化钠注射液 (中国大冢制药有限公司),抗体:Cx43 (Abcam,英国),LC3B (CST,美国),DNMT-1 (NOVUS,美国),化学发光试剂 (Millipore,美国)。透射电子显微镜 (Philips,荷兰),荧光定量PCR仪/Realplex2 (Eppendorf,德国),低温离心机 (Eppendorf,德国),垂直电泳仪和湿相电转仪 (Bio-Rad,美国)。

1.2 动物模型的建立

将8只SD孕鼠采用随机数字表法完全随机分为对照组 (Con) 和LPS刺激组,每组4只。分别在孕第8、10、12天腹腔注射0.5 mL生理盐水或LPS (0.79 mg/kg)。各组子代大鼠4周龄时断乳,雌雄分笼予以正常饮食。16周龄时,各组随机选取6只雄性仔鼠进行后续实验。

1.3 子代大鼠血压测量

分别在子代大鼠6、8、10、12、16周龄应用尾套法测尾动脉血压。每只大鼠每隔3 min测1次,连续测3次,取平均值。

1.4 子代大鼠心肌组织Masson染色

取仔鼠心脏左心室组织经二甲苯溶液脱蜡,梯度酒精分化,水洗。苏木精染6 min,充分水洗,丽春红酸性复红液染6 min,0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻,1%磷钼酸水溶液分化4 min,蒸馏水洗,苯胺蓝5 min,0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻,梯度酒精分化、吹干,二甲苯透明,中性树胶封固。每组大鼠选取6张心肌切片,随机选取2个无血管视野 (×400),通过灰度调节区别胶原和非胶原成分,计算心肌胶原容积分数 (CVF)。CVF =胶原面积/全视野面积×100%。

1.5 透射电镜观察子代大鼠心肌组织结构

取仔鼠心脏左心室组织经3%戊二醛预固定24 h,冲洗,1%锇酸继续固定1 h,梯度丙酮脱水,环氧树脂渗透、包埋、半薄切片光学定位、超薄切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后在电镜下观察。

1.6 RT-PCR检测心肌组织

将50 mg左右心肌组织用匀浆研磨器充分研磨,总RNA提取、逆转录、实时荧光定量PCR操作遵守试剂盒说明书的规程。引物序列均由上海生工生物工程公司合成、纯化。反应条件:25 μL反应体系,预变性阶段95 ℃ 2 min,PCR反应阶段95 ℃变性10 s,60 ℃退火34 s,72 ℃延伸30 s,40个循环后增加融解曲线反应至终止。采用2-ΔΔCt法进行计算。引物序列见表 1

表 1 PCR引物序列产物长度
扩增基因 引物序列 产物长度 (bp)
β-actin 正向引物 5′-CCATTGAACACGGCATTG-3′ 217
反向引物 5′-TACGACCAGAGGCATACA-3′
Cx43 正向引物 5′-GACTTCAGCCTCCAAGGAGTT-3′ 197
反向引物 5′-ACCCCAAGCTGACTCAACAG-3′
LC3B 正向引物 5′-CCCTGCTAACCCCCAATGTT-3′ 62
反向引物 5′-GGGACATGACGACGTACACA-3′
DNMT-1 正向引物 5′-GCTGTTCCTTGTAGGCGAGT-3′ 182
反向引物 5′-GGGGACTCAAACCTTGCGTA-3′

1.7 Western blot检测心肌组织

50 mg左右心肌组织用匀浆研磨器充分研磨,提取总蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度,在10%多聚丙烯酰胺凝胶 (SDS/PAGE) 电泳,电泳结束后250 mA转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上,用5%脱脂牛奶在室温中封闭2 h,加入抗兔GAPDH、Cx43、LC3B抗体,工作液浓度均为1:1 000,抗鼠DNMT-1抗体,工作液浓度为1:500,在4 ℃冰箱中孵育过夜,洗膜后与辣根过氧化物酶标记过的抗兔IgG或抗鼠IgG二抗在室温中孵育1 h,洗膜后用化学发光试剂显色,进行胶片曝光。用Quantity One软件进行面积灰度扫描,以密度代表基因表达丰度并进行半定量分析,定量指标为目的蛋白丰度/GAPDH丰度。

1.8 统计学分析

采用SPSS 15.0统计软件进行分析,实验数据用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 孕期炎症刺激子代大鼠尾动脉血压比较

孕期炎症刺激仔鼠从6周龄起,LPS组的血压均明显高于Con组,且到16周龄时,血压升高更加明显 (P < 0.01,图 1)。

a: P < 0.01,与Con组比较 图 1 孕期炎症刺激两组仔鼠动脉收缩压的变化 (x±s, n=6)

2.2 子代大鼠心肌组织Masson染色及胶原容积分数计算

经Masson染色后,心肌纤维染成红色、胶原纤维染成蓝色 (图 2)。光镜下观察,Con组子代大鼠心肌纤维排列整齐,无明显断裂和重排,细胞间隙正常;LPS组心肌纤维排列紊乱,并且出现溶解断裂的现象,间隙明显增宽,胶原纤维沉积增多。LPS组 (26.08±2.87)%大鼠胶原容积分数CVF显著高于Con组[(19.10±1.42)%,P < 0.05]。

A:Con组;B:LPS组;黄框显示部分为病变显著区域的放大部分 图 2 Masson染色观察孕期炎症刺激两组子代大鼠左心室组织变化 (×400)

2.3 透射电镜观察16周龄子代大鼠左心室超微结构

Con组子代大鼠左心室的细胞排列紧密、整齐,细胞器完整,细胞间可见明显的缝隙连接 (图 3A~C)。LPS组子代大鼠左心室的肌成纤维细胞器较完整,细胞排列不整齐,细胞间隙变宽,可见自噬小体,缝隙连接数量减少 (图 3D~F)。

A~C:Con组;D~F:LPS组;A、D:细胞间缝隙连接;B、E:细胞间缝隙连接;C、F:自噬小体;GJ:缝隙连接;→:示自噬小体;黄框显示部分为病变显著区域的放大 图 3 超微结构观察孕期炎症刺激两组子代大鼠左心室组织变化

2.4 子代大鼠心肌组织Cx43、LC3B和DNMT-1 mRNA表达

与Con组子代大鼠相比,LPS组子代大鼠心肌组织Cx43和DNMT-1 mRNA表达均明显增加 (P < 0.05),而LC3B mRNA表达明显降低 (P < 0.05,图 4)。

a: P < 0.05,与Con组比较 图 4 孕期炎症刺激两组子代大鼠左心室Cx43、LC3B和DNMT-1 mRNA表达 (x±s, n=6)

2.5 子代大鼠心肌组织Cx43、LC3B和DNMT-1蛋白表达

16周龄LPS组子代大鼠左心室Cx43蛋白表达水平较对照组子代大鼠明显降低 (P < 0.05),而LC3B和DNMT-1蛋白表达水平则明显升高 (P < 0.05,图 5)。

1:con组;2:LPS组A:Western blot检测结果;B:半定量分析结果  a: P < 0.05,与Con组比较 图 5 孕期炎症刺激两组子代大鼠左心室Cx43、LC3B及DNMT-1蛋白表达 (x±s, n=6)

3 讨论

心脏中成纤维细胞增生并向肌成纤维细胞转化,从而使心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变即为心肌纤维化[5]。孕期LPS刺激16周龄子代大鼠血压显著升高,心肌组织胶原含量增多、排列紊乱。大量的研究表明血压升高与心肌纤维化相互影响,因此有理由推测孕期LPS刺激子代血压的升高导致心肌纤维化,同时心肌纤维化的发生会进一步加剧血压升高,形成恶性循环[6]

心脏缝隙连接 (gap junction,GJ) 是心脏组织不同细胞间进行电化学偶联及信息交换的重要途径,是介导心脏维持正常协调性和同步性功能的重要桥梁和特殊通道[7]。GJ主要由缝隙连接蛋白 (connexin, Cx) 组成,在心脏组织中主要有Cx40、43和45,其中Cx43广泛表达于心室肌细胞[8]。本室前期研究表明,孕期炎症刺激子代血管Cx表达格局的改变与血管损伤、功能失调及其血压升高密切相关[9]。在本实验中,孕期LPS刺激子代大鼠心肌组织缝隙连接减少,Cx43 mRNA表达水平升高而蛋白表达显著降低。已有研究指出心肌梗死后心肌细胞Cx43表达量的显著减少可引起心肌细胞电传导速度减慢而造成心律失常[10];在培养成年小鼠心脏成纤维细胞时Cx43表达的降低可以诱导成纤维细胞的显著增殖[11];临床研究表明心脏重构过程中心肌胶原纤维沉积伴随着Cx43表达减少[12-13]。因此,孕期LPS刺激子代大鼠心肌Cx43蛋白降解可能是诱发心肌纤维化的途径之一。

目前有研究已经证实诱导自噬可以使Cx43内化为自噬小体从而发生降解[14];心肌组织自噬上调导致的Cx43蛋白降解在触发心肌缺血及缺血再灌注中发挥重要作用[15];阿利吉仑 (Aliskiren) 通过抑制自噬、调节Cx43蛋白表达可以有效减轻自发性高血压大鼠心肌凋亡[16]。自噬是真核生物进化上高度保守的溶酶体依赖的分解代谢过程。通过自噬,细胞将胞内异常蛋白聚集物或受损细胞器运至溶酶体降解,以维持细胞内环境的稳定。自噬由一系列自噬相关蛋白调控,微管相关蛋白1轻链3B (microtubule-associated protein 1 light chain 3B, LC3B) 包括两种可相互转化的形式即LC3BⅠ和LC3BⅡ,参与了自噬体膜的形成。自噬小体形成时,胞质型LC3B (即LC3BⅠ) 会酶解掉一小段多肽,转变为 (自噬体) 膜型 (即LC3BⅡ),因此通过LC3BⅡ/LC3BⅠ即可反映自噬的水平[17]。本实验发现,孕期LPS刺激导致子代大鼠心肌组织自噬小体数量增加,LC3BⅡ/LC3BⅠ表达升高,因此推测孕期LPS刺激子代心肌组织自噬激活诱导Cx43蛋白发生降解,并在心肌纤维化过程中发挥重要作用。

表观遗传学 (epigenetics) 是研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时,基因功能可逆的、可遗传的改变。这些改变包括DNA的修饰 (如甲基化修饰)、组蛋白的修饰等,广义上还包括非编码RNA等[18]。在DNA的甲基化修饰中,目前已发现4种DNA甲基转移酶 (Dnmts),DNMT-1主要参与甲基化状态的维持,也是非CpG位点从头甲基化所必需,并与甲基化状态的延伸有关。本课题组前期研究发现孕期LPS刺激子代大鼠胸主动脉DNMT-1显著升高与核因子κB表达失衡及高血压发生密切相关,表明表观遗传能够调控自噬相关基因的表达[19];Dnmts上调参与了低氧诱导的心肌组织纤维化和肌成纤维细胞样表型的转变[20]。本研究发现孕期LPS刺激子代大鼠心肌组织DNMT-1表达升高,提示DNA甲基化调控心肌组织自噬可能是其参与心肌纤维化的途径之一,但具体机制尚需进一步研究。

综上所述,孕期LPS刺激导致的子代心肌组织DNA甲基化调控了自噬的活性,从而降解Cx43蛋白,与子代心肌纤维化的发生密切相关。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201610118
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

温燕, 刘雅.
Wen Yan, Liu Ya.
孕期炎症刺激对子代大鼠心肌纤维化的影响
Maternal lipopolysaccharides exposure during pregnancy induces myocardiac fibrosis in offspring rats
第三军医大学学报, 2017, 39(8): 718-723
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(8): 718-723
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201610118

文章历史

收稿: 2016-10-18
修回: 2016-12-07

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