2. 430037 重庆,第三军医大学新桥医院急救部
2. Department of Emergency, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China
Zhou Renjie, Tel:86-23-68755653, E-mail:zhou_rj@aliyun.com
生物被膜 (biofilm,BF) 是指附着在有生命体或无生命体表面的由细菌自身产生的胞外多聚基质包裹的多细胞聚合膜样物。生物被膜的形成显著增强了细菌对各种抗菌药物的耐受能力 (成熟生物被膜包裹的细菌对各种抗菌药物的敏感性为浮游状态细菌的1/10~ 1/1000)[1],耐热性也相应增加,成为细菌抵御外界不良环境的一种重要形式。同时,细菌生物被膜可为细菌提供一个保护性的环境,使得细菌在该环境中可以继续生长繁殖并免受宿主免疫攻击。
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus,简称金葡菌) 耐药性备受关注[2-3],生物被膜的形成是重要机制之一。金葡菌生物被膜形成受多种基因调控,其中sigB处于生物被膜调控网络的上游位置[4]。sigB编码的Sigma因子SigB (σB) 可通过与RNA聚合酶结合来调控多种基因的表达。我们前期从脓毒症患者中分离获得1株spa t159、agrⅣ、PVL+、ST121型高毒力金葡菌,命名为XQ株[5]。在体外进行连续培养过程中,发现1株颜色变白的新菌株,命名为XQW。经全基因组测序发现,SigB蛋白第225位谷氨酰胺突变为脯氨酸 (Q225P)。文献[6-7]报道,SigB在金葡菌中具有控制毒力因子表达、促进生物被膜形成、调节耐药性、影响色素形成等多种功能。SigB突变可使金葡菌色素合成受阻,菌落常常呈白色[8],生物被膜形成下降[9]。SigB (Q225P) 突变的XQW在液体培养中呈絮状生长,推测其生物被膜形成能力强于XQ野生株。为深入探讨SigB (Q225P) 突变对金葡菌生物被膜形成能力的影响,本研究在利用结晶紫染色及激光共聚焦显微镜检测比较XQW和XQ生物被膜形成的基础上,进一步通过同源重组技术构建了金葡菌Newman-sigB (Q225P) 基因替换突变株及Newman-△sigB敲除株,并通过表达载体pLI50构建回补菌株Newman-△sigB/sigB及Newman-△sigB/sigB (Q225P),检测各株菌生物被膜形成能力的变化,证实SigB (Q225P) 突变对金葡菌生物被膜的形成具有促进作用,为深入探讨SigB调控金葡菌生物被膜形成的机制奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒金葡菌XQ株分离自我校某附属医院1例脓毒症住院患者,XQW为XQ株在体外培养时菌落颜色变白的突变菌;金葡菌Newman由吉林大学于录教授惠赠。金葡菌RN4220为限制性修饰系统部分缺陷菌株,可接受并修饰来自大肠埃希菌的穿梭质粒,由中国科学技术大学孙宝林教授惠赠。大肠埃希菌JM109购自天根生化公司。pBT2为温度敏感型穿梭质粒, 可在大肠埃希菌和金葡菌中复制;pLI50为金葡菌表达质粒,均由中国科学技术大学孙宝林教授惠赠。
1.1.2 酶及主要试剂Prime STAR HS DNA聚合酶购自TaKaRa公司; 2×ES Taq Master Mix DNA聚合酶购自康为世纪公司;限制性内切酶、DNA连接酶以及DNA分子量标准购自Thermo Scientific公司; 氨苄西林 (ampicillin,Amp) 和氯霉素 (chloramphenicol,Cm) 购自上海生工生物工程技术服务有限公司; 琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Promega公司; 胰蛋白胨大豆肉汤培养基 (tryptone soya broth,TSB)、胰蛋白胨 (Tryptone)、酵母提取物 (Yeast Extract) 等购自英国Oxiod公司; 溶葡萄球菌素、FITC标记的刀豆蛋白A (FITC-Concanavalin A,FITC-ConA)、碘化丙啶 (propidium iodide,PI) 均购自Sigma公司;96孔培养板以及6孔培养板均购自康宁公司;His-Tag mAb及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自ABMART公司。
1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成根据GenBank中金葡菌Newman基因组序列,利用Primer Premier 5.0软件设计引物。引物序列见表 1。所设计的引物由北京华大基因科技有限公司合成。
引物 | 序列 (5′→3′) | 片段大小 (bp) | 用途 |
up-sigB-5′上游 | CCGGAATTCCTTCAACACGTTGTAATTTG | 734 | 扩增sigB上游序列, 构建同源重组质粒pBT2-sigB (Q225P) 及pBT2-△sigB |
up-sigB-3′下游 | CGGGGTACCAATTTGTTTATTAATGATACGT | ||
sigB (Q225P)-5′上游 | GGGGTACCCTATTTATGTGCTGCTTCTT | 738 | 扩增sigB (Q225P),构建同源重组质粒pBT2-sigB (Q225P) |
sigB (Q225P)-3′下游 | GCTCTAGATCACCTGAGCAAATTAACCA | ||
down-sigB-5′上游 | CGGGGTACCTTAGCTGATTTCGACTCTTT | 781 | 扩增sigB下游序列,构建同源重组质粒pBT2-△sigB |
down-sigB-3′下游 | CCCAAGCTTCAAGATAAATTTTACGAAGTTA | ||
sigB promoter-5′上游 | CGGAATTCGATGATATGACTATTTTG | 161 | 扩增sigB启动子,构建回补质粒pLI50-sigB,pLI50-sigB (Q225P) |
sigB promoter-3′下游 | GGGGTACCCATTTCATTACACTCCTACT | ||
sigB-C-5′上游 | GGGGTACCATGGCGAAAGAGTCGAAATC | 789 | 扩增含有his的sigB及sigB (Q225P),构建回补质粒pLI50-sigB,pLI50-sigB (Q225P) |
sigB-C-3′下游 | CCAAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGATGTGCTGCTTCTTGTA |
1.2.2 细菌培养与传代
金葡菌XQ株接种于2 mL新鲜无菌的LB培养基中,37 ℃振荡培养过夜,次日以1:100稀释接种至2 mL新鲜无菌LB培养基,37 ℃振荡培养,重复上述操作传代10次,分别保存每代细菌,并将每代细菌三线接种于无抗LB平板,37 ℃过夜培养。
1.2.3 全基因组测序与比较用TSB培养XQ株与XQW菌株,制备基因组,送军事医学科学院五所生物信息研究室用Ion Torrent PGM测序仪进行全基因组测序,所获片段用Roche 454 Newbler 2.5 assembler进行组装,XQ株基因组中的gap通过构建大片段文库测序,用GapFiller version 1.11软件进行补缺,完成的全基因组经注释后递交GenBank。利用BLAST对XQ与XQW的相关编码基因进行比较分析,寻找突变位点。
1.2.4 生物被膜形成能力测定 1.2.4.1 结晶紫染色主要参照文献[10]并作适当改进:取金葡菌单菌落接种于TSB培养液中200 r/min培养16 h,离心收集菌体,以TSB (含1% glucose和2% NaCl) 稀释至约1.0×1010 CFU/L,以每孔200 μL加入无菌的96孔板,37 ℃孵育24 h,结晶紫溶液染色后每孔加入200 μL 30%冰醋酸溶解,并测量492 nm波长处的光密度值[d (492)]。
1.2.4.2 激光共聚焦显微镜观察参照文献[11]进行:将洁净的盖玻片置于无菌6孔培养板底部,每孔各加入稀释好的菌液5 mL (1.0×1010 CFU/L),37 ℃培养24 h。盖玻片经2.5%的戊二醛固定,PBS洗片后用50 mg/L FITC标记的刀豆蛋白A避光染色30 min;PBS洗片后用5 mg/L的碘化丙啶避光染色8min封片;以激光共聚焦显微镜 (1000倍) 观察标记为绿色荧光的多糖和标记为红色荧光的细菌细胞核。
1.2.5 同源重组质粒pBT2-sigB (Q225P) 和pBT2-△sigB的构建以金葡菌Newman基因组DNA为模板,用up-sigB-5′上游/up-sigB-3′下游引物扩增sigB基因上游片段,以down-sigB-5′上游/ down-sigB-3′下游引物扩增sigB基因下游片段;以XQW基因组DNA为模板,用sigB (Q225P)-5′上游/sigB (Q225P)-3′下游引物扩增sigB (Q225P) 基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认条带大小正确后,胶回收纯化备用。pBT2质粒和上游片段分别经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切,胶回收纯化,再用T4连接酶连接后转化大肠埃希菌JM109,涂布Amp (100 μg/mL) LB平板,37 ℃培养,次日挑取抗性菌落,抽提质粒,进行EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切电泳鉴定条带大小正确者进一步行DNA测序鉴定,最终构建序列正确的pBT2-up质粒。以此方法再将sigB (Q225P) 基因或sigB基因下游片段分别插入pBT2-up质粒的sigB基因上游片段后,构建pBT2-sigB (Q225P) 和pBT2-△sigB质粒并验证。
1.2.6 质粒转化参照文献[12]进行,将pBT2-sigB (Q225P)、pBT2-△sigB分别电转化金葡菌RN4220,电转化条件为:电压2.5 kV,电容25 μF,电阻200 Ω。电转后的菌液涂布于含氯霉素 (Cm,20 μg/mL) 的TSB平板,30 ℃培养,2 d后挑取转化子接种于含Cm的TSB液体培养基中,抽提质粒进行酶切鉴定。将经RN4220修饰的pBT2-sigB (Q225P)、pBT2-△sigB分别再电转化金葡菌Newman,条件同上。
1.2.7 Newman-sigB (Q225P) 突变菌株及Newman-△sigB敲除株的筛选与鉴定参照文献[13]并作适当改进。pBT2是温度敏感型质粒,25 ℃时此质粒可以在革兰阳性菌中稳定存在,当温度≥42 ℃时质粒容易丢失。根据质粒特性进行筛选,即将成功转入质粒的Newman株接种于2 mL含Cm的TSB培养基中,42 ℃过夜培养,以获得质粒与基因组发生同源重组的菌株。这些菌株包括左臂重组和右臂重组两种可能,再挑取这种菌落于25 ℃培养,重组的质粒可因同源臂的存在发生二次重组而丢失,取菌液划线接种于普通TSB平板 (无抗生素),37 ℃培养过夜,挑取单个菌落分别接种于含Cm和普通的TSB平板上,分别培养,在Cm平板上不生长,而在普通平板上生长的菌落为可疑的同源重组株;提取其基因组,用up-sigB-5′上游/sigB (Q225P)-3′下游引物对可疑的同源重组株基因组进行PCR扩增,将扩增产物进行DNA测序鉴定以确认发生正确的同源重组。
1.2.8 回补菌株的构建以Newman菌株基因组DNA为模板,用sigB promoter-5′上游/sigB promoter-3′下游引物成功扩增约160 bp的sigB启动子区;分别以Newman、Newman-sigB (Q225P) 菌株基因组DNA为模板,用sigB-C-5′上游/sigB-C-3′下游引物扩增sigB基因及sigB (Q225P) 基因。pLI50质粒和sigB启动子区片段分别经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切,胶回收纯化,再用T4连接酶连接后转化大肠埃希菌JM109,涂布Amp (100 μg/mL) LB平板,37 ℃培养,次日挑取抗性菌落,抽提质粒,进行酶切鉴定,酶切正确者命名为pLI50-sigB promoter。再依据上述方法,将质粒pLI50-sigB promoter和sigB/sigB(Q225P) 基因片段分别经KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切,胶回收纯化,再用T4连接酶连接后转化大肠埃希菌JM109,涂布Amp (100 μg/mL) LB平板,37 ℃培养,次日挑取转化子,抽提质粒,进行酶切和DNA测序鉴定,序列正确者分别命名为pLI50-sigB, pLI50-sigB (Q225P)。将pLI50-sigB, pLI50-sigB (Q225P) 经RN4220修饰后,提取质粒进行酶切鉴定,正确的质粒再转化金葡菌Newman-△sigB突变株,获得回补菌株Newman-△sigB/sigB以及Newman-△sigB/sigB(Q225P)。
1.2.9 Western blot验证回补菌株中SigB及SigB (Q225P) 的表达Newman-△sigB/pLI50(空质粒对照) 及回补菌株Newman-△sigB/sigB和Newman-△sigB/sigB (Q225P) 分别以1 :100接种至含Cm的TSB过夜振荡培养。各取200 μL菌液,离心收集菌体。60 μL PBS重悬菌体,并加入5 μL溶葡萄球菌素 (1 mg/mL), 37 ℃水浴溶菌约0.5 h,至重悬液变澄清。加入15 μL 5×SDS上样缓冲液,100 ℃加热10 min。离心收集上清。进行SDS-PAGE电泳,转膜,经His-Tag mAb及HRP-conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody进行孵育洗涤后,用化学发光成像仪进行检测、成像。
1.3 统计学处理应用SPSS 11.0软件,结晶紫染色法检测XQ、XQW、Newman-△sigB (Q225P)、Newman-△sigB、Newman-△sigB/PLI50、Newman-△sigB/sigB、Newman-△sigB/sigB (Q225P) 生物被膜的数据以x±s表示,样本之间的差异性采用t检验分析。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 XQ与XQW的表型金葡菌XQ株为ST121型高毒力菌株[5],该菌在TSB培养平板上经37 ℃ 24 h培养能长出圆形、凸起、边缘整齐、金黄色菌落,在液体TSB培养基中呈均匀混浊生长。当将该菌培养于普通LB培养基中,传至第5代时,在LB平板上出现颜色变白的菌落 (图 1A),随着传代增加,白色菌落不断增多;若再将该白色菌落接种于液体TSB培养基中,发现其呈明显絮状沉淀生长,表现出与XQ株不一样的生长特性 (图 1B)。
2.2 基因组测序与相关基因比较
对XQ与XQW进行了全基因组测序,结果表明XQ的基因组大小为2 803 594 bp (GenBank登录号:NZ_CP013137)。XQW为XQ的突变株,其基因组大小与XQ株一致。XQW的菌落颜色变白,利用BLAST比较了金葡菌的色素合成途径及其调控的相关基因,发现XQW的sigB发生了点突变,使得SigB蛋白第225位谷氨酰胺突变为脯氨酸 (Q225P)。以XQW基因组为模板的PCR扩增产物测序证实SigB (Q225P) 存在。
2.3 XQ与XQW株生物被膜形成能力检测微孔板结晶紫染色法观察结果显示XQW的生物被膜形成能力显著增强 (P < 0.01, 图 2A);激光共聚焦显微镜观察结果显示XQW的生物被膜较XQ株厚而致密 (图 2B)。
2.4 金葡菌Newman-sigB (Q225P) 突变菌、Newman-△sigB及回复菌株的构建
因XQ株为临床金葡菌分离株,遗传操作难以进行。为深入证实金葡菌SigB (Q225P) 突变对其生物被膜形成的影响,我们构建金葡菌Newman-sigB (Q225P) 基因替换突变菌。2个在无抗生素平板上正常生长,而在Cm平板上不生长的菌落,PCR扩增产物DNA测序证实sigB (Q225P) 的存在,表明Newman中sigB基因被sigB (Q225P) 成功替换,获得了金葡菌Newman-sigB (Q225P) 突变菌。
同理,利用构建的pBT2-△sigB质粒转化并筛选Newman-△sigB敲除株。以敲除株基因组DNA为模板,PCR扩增产物较野生株小 (图 3),相差约为sigB基因片段大小;将产物进行DNA测序,进一步证实sigB已被敲除,Newman-△sigB敲除株构建成功。
以Newman菌株基因组DNA为模板,成功构建pLI50-sigB promoter。再分别以Newman、Newman-sigB (Q225P) 菌株基因组DNA为模板,成功构建pLI50-sigB及pLI50-sigB (Q225P)(图 4)。将上述质粒经RN4220修饰后,分别转化金葡菌Newman-△sigB敲除株中,获得回补菌株Newman-△sigB/sigB及Newman-△sigB/sigB (Q225P)。
2.5 Western blot验证回补菌株中SigB及SigB (Q225P) 的表达
在蛋白水平对回补菌株进行验证。因在设计sigB-C引物时在sigB-C-3′下游上引入6×His标签,故对其蛋白水平的检测可用His单克隆抗体进行。结果发现Newman-△sigB/sigB及Newman-△sigB/sigB (Q225P) 中均有相应蛋白的表达,而pLI50空质粒对照却无相应印迹条带 (图 5),表明回补菌株构建成功。
2.6 突变/回补菌株生物被膜形成能力检测
Newman-sigB (Q225P) 的菌落颜色也变白,但未发现絮状生长现象。通过结晶紫染色法及激光共聚焦检测Newman、Newman-sigB (Q225P)、Newman-△sigB、Newman-△sigB/pLI50、Newman-△sigB/sigB、Newman-△sigB/sigB (Q225P) 等突变/回补菌株的生物被膜形成能力。结果如图 6所示,与Newman野生株相比,Newman-sigB (Q225P) 的生物被膜形成能力明显升高 (P < 0.01);Newman-△sigB的生物被膜形成能力明显下降 (P < 0.05);Newman-△sigB/sigB的生物被膜形成能力能恢复至野生型水平 (P > 0.05),且Newman-△sigB/sigB (Q225P) 的生物被膜形成能力明显高于Newman-△sigB/sigB (P < 0.01)。上述结果表明,sigB (Q225P) 是XQW以及Newman-sigB (Q225P) 生物被膜形成能力升高的关键因素。
3 讨论
金葡菌是一种重要的人畜共患病原菌,引起的临床感染占第2位,仅次于大肠埃希菌。金葡菌具有多种毒力因子,其中生物被膜的形成被认为是引发慢性感染的主要原因[14]。细菌生物被膜是细菌利用自身分泌的含水聚合物黏附成团,附着于固体物质表面的具有特殊微结构的细菌群落,可引起一系列病理改变。临床上特别是ICU病房常见的致病菌包括铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠杆菌、真菌等均易产生生物被膜,使细菌抵御抗菌药物的杀伤和逃逸宿主的免疫攻击,从而导致临床相关感染的治疗困难。
前期研究表明XQ株在体外传至第5代时,出现颜色变白,在液体培养基中呈絮状生长的突变株,将其命名为XQW。经全基因组测序和比较发现XQW的sigB第674位碱基由A突变为C,使得第225位的谷氨酰胺突变为脯氨酸 (Q225P),该位点突变尚少见相关报道。SigB在金葡菌中主要发挥4种功能[17]:控制多种毒力因子的表达、促进生物被膜的形成、调节耐药性、影响色素的形成。文献[9, 15-18]报道,SigB具有促进金葡菌生物被膜形成的能力,SigB缺失突变会显著降低金葡菌生物被膜形成能力[9]。目前尚少见SigB特定位点突变与金葡菌生物被膜形成变化的研究,本研究发现XQW株发生SigB (Q225P) 突变后,其生物被膜形成能力反而是增强的。SigB可分为4个功能域:R1、R2、R3以及R4。R2能与RNA聚合酶的β′亚基结合;R3主要与RNA聚合酶的核心结合;R4则可与靶基因的启动子结合[19]。R4包括SigB的208~ 247位氨基酸,因此SigB (Q225P) 突变位点位于SigB与靶基因启动子结合的区域,即R4区。为此,我们推测:SigB (Q225P) 突变可能影响了SigB与一些靶基因启动子的结合能力,从而改变了相应基因的表达水平,最终导致金葡菌生物被膜形成能力增强。由于XQ以及XQW难以进行遗传操作,为证实SigB (Q225P) 突变具有促进金葡菌生物被膜形成的作用,我们以标准金葡菌Newman株为宿主,构建了Newman-sigB (Q225P) 替换株,发现该Newman替换株的菌落颜色也是白色,但未发生絮状生长现象,这可能是Newman和XQ菌株的遗传背景不同导致的。通过结晶紫染色法以及激光共聚焦显微镜检测发现Newman-sigB (Q225P) 的生物被膜形成能力明显高于Newman。通过构建sigB缺失突变株和回补菌株,发现Newman-△sigB的生物被膜形成能力明显降低,与文献[9]报道的结果一致;回补菌株的生物被膜形成能力也回复至野生株水平,且Newman-△sigB/sigB (Q225P) 的生物被膜形成能力也明显高于Newman-△sigB/sigB,表明SigB (Q225P) 突变的确具有促进金葡菌生物被膜形成的作用。
我们下一步拟通过qRT-PCR检测这些基因的表达水平,研究SigB (Q225P) 对目标基因的调控功能,深入阐明SigB (Q225P) 突变上调金葡菌生物被膜形成能力的机制。
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