临床上,高强度聚焦超声 (high-intensity focused ultrasound,HIFU) 治疗肿瘤常采取“点-线-面-体”全覆盖完全消融的模式, 但HIFU单点辐照形成的生物学焦域常为毫米级,消融大体积肿瘤时仍存在较大局限[1]。肿瘤边缘血供丰富,是其生长转移的关键[2],基于此特点有研究者[3-4]提出了表面或周边消融模式:仅在靶组织周边投放能量,利用HIFU形成的“壳”样凝固性坏死,阻断肿瘤的营养供应及转移途径。目前,此法阻断靶区灌注的可行性已在离体实验中得到证实,其消融效率较传统模式有显著提高。但前期关于表面消融的研究采用的均为连续高强度聚焦超声 (continuous high-intensity focused ultrasound,CHIFU) 辐照,其主要的弊端为:CHIFU主要产生热效应,持续辐照时焦域温度骤升产生的大量微泡会形成“声屏障”,易使焦点位置偏移,导致靶区毗邻组织器官的损伤[5-6]。而研究发现脉冲高强度聚焦超声 (pulsed high-intensity focused ultrasound,PHIFU) 在不同占空比条件下会产生不同的生物学效应,利用其非热效应更有利于减少靶区气泡的影响,增加治疗的可控性[7-9]。因此,本研究探讨PHIFU与CHIFU表面消融的特点、优势、不足及可能的成因,为该领域的深入研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料及主要设备取屠宰后5 h以内的新鲜离体牛肝,选择血管较少的部分切块,取40块组织按辐照方式不同分为A组 (PHIFU表面消融组,30块) 和B组 (CHIFU表面消融组,10块)。A组再按占空比均分为A1 (10%)、A2 (30%)、A3 (50%) 3个亚组,每个亚组10块。将组织块以2XZ-2型真空泵 (浙江黄岩求精真空泵厂) 脱气40 min后置于26 ℃生理盐水中复温备用。
海扶刀 ® JC200型聚焦超声肿瘤治疗系统 (重庆海扶医疗科技股份有限公司):换能器直径220 mm,焦距200 mm,频率1.0 MHz;Olympus BX51光学显微镜 (日本);FLE5008热电偶温度巡检仪 (杭州奋乐电子有限公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 辐照参数及扫描路径各组靶区均为预设体积30 mm×30 mm×15 mm的立方体,整个靶区在z轴方向上按35、30、25、20 mm的深度分为互相平行的4层,各层对应功率依次为200、180、180、160 W。机载超声引导下,根据线→面组合原则,采用连续直线扫描的方式对靶区周边进行辐照 (图 1)。换能器移动速度为6 mm/s,单条扫描线长30 mm,相邻两条线间隔时间为10 s,顶层和底层的线间距为3 mm。周边完整消融1次后停止辐照,总辐照时间均为340 s,消融过程总时间为670 s,脉冲重复频率为100 Hz。
1.2.2 测温
B超引导下,将热电偶探针沿声束长轴插入牛肝,将针尖固定于靶区中央 (ROI内部几何中心点),初始温度 (T0) 稳定至26 ℃后开始辐照,同时连续采集整个消融过程的温度。绘制温度-时间曲线并比较各组参数:消融顶面过程的峰值温度 (Tmax1)、温升时间 (t1) 及温升斜率 (K1);消融底面的初始温度 (T2)、峰值温度 (Tmax2)、温升时间 (t2) 及温升斜率 (K2)。K1=(Tmax1-T0)/t1,K2=(Tmax2-T2)/t2。
1.2.3 肉眼及光镜观察辐照结束后沿z轴以3 mm厚度依次切开牛肝,TTC染色界定损伤范围 (凝固性坏死组织不着色呈灰白,未凝固性坏死组织着色呈鲜红),肉眼观察靶区边缘、内部及外部损伤情况。取内部未辐照区、辐照区与外部未辐照区交界组织进行HE染色光镜观察。
1.2.4 坏死体积及能效因子测算每片牛肝拍照,用割补法将不规则区域转化为规则形,用HifuJupiterF图像软件测出每片牛肝坏死带外缘长、宽,以长×宽×厚度计算坏死带外缘以内的体积,累加得到ROI实际总体积 (V1),采用同样的方法测算出内部红染区总体积 (V2),总坏死体积 (V)=V1-V2;计算能效因子EEF=ηPt/V,EEF指损伤单位体积组织所需能量,η为HIFU换能器聚焦系数,P为声功率,t为有效辐照时间=实际辐照时间×占空比,V为坏死体积。
1.3 统计学处理使用SPSS 22.0统计软件,计量资料以x±s表示。各组行单因素方差分析,组间比较采用配对t检验,检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 肉眼及光镜观察肉眼观察 (图 2),A、B两组靶组织周边均能形成完整封闭的隔离带,但B组靶区外部出现明显热损伤,各组隔离带及内部未辐照区损伤情况不同。光镜观察 (图 3),除A1组,其余组靶区中央组织出现不同程度损伤,损伤程度随占空比增大而加重,各组隔离带外缘处细胞均出现损伤,但损伤表现不同。
2.2 坏死体积及能效因子 (energy efficiency factor, EEF)
坏死体积:A1组 (7 568.95±174.36) mm3,A2组 (13 789.60±270.11) mm3,A3组 (23 016.41±119.73) mm3,B组 (27 232.88±251.92) mm3,坏死体积随占空比增大而增大,各组两两比较差异有统计学意义 (P < 0.05)。EEF:A1组 (0.81±0.05) J/mm3,A2组 (1.34± 0.02) J/mm3,A3组 (1.36±0.05) J/mm3,B组 (2.25±0.13) J/mm3,A2、A3组EEF比较差异无统计学意义 (P > 0.05),EEF随占空比增大而减小。PHIFU组EEF均小于CHIFU组 (P < 0.05),即PHIFU表面消融模式治疗效率更高。
2.3 温度时间曲线各组温度时间曲线呈“双峰-谷”的形态 (图 4):顶面和底面消融过程,焦点位置距测温点越近, 靶区中央温度上升越明显, 当焦点移动到距测温点最近时温度出现峰值,温升时间t1=t2=89 s;各组在消融靶区周边平行于声束方向4个面时,温度没有明显改变。温度时间参数比较 (表 1):A、B组各参数比较,B组各参数均大于A组 (P < 0.05);A组各亚组间参数比较,Tmax1、Tmax2、K1、K2均随占空比增大而增大,其中A2、A3组Tmax2、K1、K2分别比较,差异无统计学意义 (P > 0.05),即占空比越高,靶区内部温升越快。此外,A组整个消融过程靶区中央温度低于60 ℃,其余组在消融顶面和底面过程温度均高于60 ℃。
组别 | 消融顶面时峰值温度 (℃) | 消融底面时峰值温度 (℃) | 消融底面时初始温度 (℃) | 消融顶面时温升斜率 (℃/s) | 消融底面时温升斜率 (℃/s) |
A1组 | 42.40±1.51bc | 48.10±2.33bc | 32.09±0.77bc | 0.19±0.05bc | 0.18±0.01bc |
A2组 | 68.90±4.91ac | 89.60±4.40a | 42.72±0.83ac | 0.51±0.04a | 0.47±0.02a |
A3组 | 79.10±3.32ab | 94.40±3.41a | 51.64±2.37ab | 0.60±0.03a | 0.48±0.06a |
B组 | 95.20±6.23abc | 104.90±4.48abc | 59.89±4.62abc | 0.78±0.07abc | 0.56±0.01abc |
a:P < 0.05,与A1组比较;b:P < 0.05,与A2组比较;c:P < 0.05,与A3组比较 |
3 讨论
恶性肿瘤的周边血供丰富,增殖、侵袭能力强,对患者生命威胁最大[10-13]。就HIFU治疗肿瘤而言,要实现周边的完整消融及滋养血管的破坏,就必须探究其辐照条件、方法和剂量,了解其内在的变化特点及相互之间的关系。
PHIFU与CHIFU的消融效果:表面消融模式有效的关键是在靶组织周边形成封闭的隔离带。本实验结果显示,PHIFU与CHIFU表面消融均能达到隔离靶组织的目的,但隔离带的损伤性质不同。PHIFU表面消融时,占空比30%和50%组与CHIFU组损伤效果类似,均产生凝固性坏死;而占空比10%组,隔离带组织呈匀浆状。已有研究证实PHIFU的生物学效应主要与占空比有关,高占空比时主要发生热效应,组织产生凝固性坏死;而低占空比时主要以非热效应为主,组织直接变成无定形浆液物质,与本实验结果一致[14-15]。Zhou等[16]发现,产生上述现象的机制可能与水力空化有关。HIFU辐照后焦域产生气泡,高占空比时,气泡受介质压缩的程度相对较大,焦域密集的小气泡对声波产生遮挡,减少了水利空化的发生;低占空比时,由于气泡在脉冲间歇时间迅速膨胀破裂,剧烈的水力空化使组织产生机械损伤。值得注意的是,本研究发现PHIFU组各亚组隔离带与外周组织交界边缘的细胞也呈现不同的损伤表现,可能与不同占空比条件下水力空化的剧烈程度有关。就HIFU表面消融的推广而言,保证治疗的安全是其应用的前提。本实验结果显示低占空比PHIFU辐照,组织产生液化坏死,可能使组织吸收、转归时间缩短,但其也可能增加组织塌陷、继发出血等并发症的风险;而高占空比PHIFU与CHIFU均形成凝固性坏死,但前者能量投放少,治疗时可能副作用更少。
能量投放方式:温度的变化与能量大小有关,了解靶区周边不同方位能量投放对靶组织温度的影响,有助于解决能量过度投放的问题。本研究发现,虽然靶组织中央区没有直接投放能量,但在消融其顶面 (深部) 和底面 (浅部) 时,靶区内部温度出现明显上升过程,而消融靶区周边其他方位时,内部温度没有明显改变。可能的原因为,消融靶区顶面时焦域近场能量叠加较多,而消融z轴方向4个面时,焦域近场能量叠加较少,不足以引起温度的明显改变。值得注意的是,消融靶区底面时靶区内部并没有声能经过,但其内部温度也出现了上升,说明焦域向远场扩散的热量也存在相互叠加。同时,在CHIFU表面消融时,靶区外有明显组织损伤,说明CHIFU辐照时焦域间近远场能量叠加更多。以上结果提示,靶区顶面和底面的能量投放是控制靶组织温度和过度治疗的关键,PHIFU表面消融更有利于减少焦域近远场能量的过度叠加。
温度与组织损伤:就肿瘤治疗而言,表面消融时靶区中央并未直接给予能量,该处组织细胞是否发生坏死,关系到这种新的消融模式的应用价值,在离体实验中观察不同条件下靶组织内部损伤情况,可为进一步的活体实验奠定基础。实验结果显示,靶区中央未给能量区域温度均有不同程度升高,两者之间存在一定关系。在PHIFU辐照条件下,占空比为10%时,内部最高温度为 (48.10±2.33) ℃,靶区中央细胞未见明显损伤,而其余组内部最高温度均在60 ℃以上,且占空比越大,温度越高,靶组织内部细胞损伤越重。提示高占空比PHIFU与CHIFU表面消融时,可利用高温直接使内部细胞发生坏死。靶区中央未直接投放能量区域温度升高的原因可能是由于超声焦域沿声轴置于深面辐照时,尽管焦域不在中央区,但确有一定声强的超声波通过,导致了靶组织中央温度升高,提示在临床上可利用此效应减少能量投放。
总之,与CHIFU表面消融模式相比,PHIFU表面消融模式能有效提高HIFU消融效率,利用PHIFU在不同占空比条件下的消融特点及优势,对于优化肿瘤治疗方案具有潜在的应用价值。
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