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铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究
张峰领1, 安琳2, 李进1, 李发科1, 徐欢1, 罗杰1, 杨成1, 蒋文斌1, 雷国勤1, 汪超1, 周琳1, 鲁卫平1     
1. 400042 重庆,第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科;
2. 400060 重庆,陆军重庆军事代表局门诊部
[摘要] 目的 筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响。 方法 针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列。分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用。利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况。qPCR方法检测lasR mRNA表达。 结果 斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸。不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强。 结论 有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达。
[关键词] 铜绿假单胞菌     lasR基因     反义肽核酸     生物被膜    
Screening of antisense peptide nucleic acid sequence targeting lasR gene of Pseudomonas aeruginosa and its inhibition on biofilm formation
Zhang Fengling1 , An Lin2 , Li Jin1 , Li Fake1 , Xu Huan1 , Luo Jie1 , Yang Cheng1 , Jiang Wenbin1 , Lei Guoqin1 , Wang Chao1 , Zhou Lin1 , Lu Weiping1     
1. Department of Clinical Laboratory, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400042;
2. Out-patient Department, Military Representative Bureau of Army, Chongqing, 400060, China
Supported by the General Program of the"Twelfth Five-year Plan"for Medical Development of PLA (CWS13J039)
Corresponding author: Lu Weiping, E-mail: ronnylu@126.com
[Abstract] Objective To screen antisense peptide nucleic acid sequence targeting lasR gene of Pseudomonas aeruginosa (PA) and investigate its inhibitory effect on biofilm formation. Methods Based on the sequence of lasR gene of PA, 4 types of antisense nucleic acid sequences were designed, and based on the principle of dot blot, 1 antisense nucleic acid sequence which could well bind with lasR gene was screened. Subsequently, peptide-peptide nucleic acids were synthesized and bound with penetrating peptides. Different concentrations of peptide-peptide nucleic acids were introduced into PAO1 (biofilm model strain of PA), D(600) value and plate count were measured for the inhibitory eftect of the peptide-peptide nuclear acids on the growth of PA. The biofilm formation was observed by light microscopy and scanning electron microscopy. LasR mRNA expression was detected with quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). Results Three types of the 4 antisense oligonucleotides showed binding affinity to lasR mRNA at dot spot hybridization experiment. The first strip antisense oligonucleotide presented strongest singal, and an antisense nucleic acid sequence was synthesized based on the result. The antimicrobial activity was enhanced with increase of the concentration of peptide-peptide nucleic acids. Conclusion The antisense peptide nucleic acid sequence targeting lasR gene of PA has significant inhibitory effect on the growth and biofilm formation of PA, and suppresses the expression of lasR mRNA.
[Key words] Pseudomonas aeruginosa     lasR gene     antisense peptide nucleic acids     biofilm    

铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa,PA) 广泛存在于自然环境中,是战伤伤后感染的主要病原菌之一,也是引起住院患者感染的主要病原细菌之一[1]。近年来,由于多重耐药甚至泛耐药PA的不断出现为其治疗带来巨大的挑战,为此,迫切需要寻求新的靶点及治疗方案。随着对细菌群体感应 (quorum sensing,QS) 的深入研究,细菌群体感应淬灭成为抗菌研究的新方向[2-3]。QS主要影响PA毒力因子以及耐药性的产生,其对细菌耐药性的调控主要表现为调控生物被膜的形成[4-5]。生物被膜形成在PA持续感染及迁延成慢性感染中发挥重要作用,如何有效抑制生物被膜的形成对治疗PA感染起重要作用。现有的抗生素如阿奇霉素可干扰生物被膜的形成,反义技术包括小片段干扰RNA (siRNA)、反义寡核苷酸和反义肽核酸等可有效抑制生物被膜的形成[6]。与传统的反义寡核苷酸相比,肽核酸 (peptide nucleic acid,PNA) 具有较高的水溶性,不易被蛋白水解酶和核酸酶水解,与DNA或RNA的亲和性更强,没有整体毒性和非特异性蛋白结合作用等优势,使得PNA成为更理想的干扰措施[7]。有研究表明利用PNA靶向PA的生物被膜形成的重要基因motA可以显著抑制PA的生长及生物被膜的形成[8]。利用PNA抑制金黄色葡萄球菌生长的作用也在研究中被证实[9]。本研究旨在采用反义肽核酸技术通过靶向PA QS系统的lasR基因,干扰PA引起感染的生长及其生物被膜的形成,为治疗PA引起的感染和防治多重耐药PA的传播提供新思路。

1 材料与方法 1.1 实验菌株

铜绿假单胞菌PAO1菌株由重庆市儿童医院景春梅老师惠赠。

1.2 反义寡核苷酸的设计与合成

采用RNA structure 5.2软件分析预测lasR mRNA的二级结构图,通过自由能计算选择不稳定的膨胀环区域作为反义序列的靶点区域。设计4条反义寡核苷酸序列探针和1条正义序列作为对照,与目标lasR mRNA进行体外斑点杂交实验。根据lasR基因序列设计的4条反义寡核苷酸序列探针和1条正义序列见表 1。所有核苷酸序列的合成由上海生工生物工程有限公司合成。

表 1 靶向LasR基因mRNA反义寡核苷酸序列
序号 序列 (5′→3′) 作用靶点
反义链1 GCTTTCGCGTCTGGTAGATGGA 271~292 bp
反义链2 CATATGGAAGTTCACATTGGCT 615~637 bp
反义链3 CCAAATTAACGGCCATAATGGC 682~704 bp
反义链4 AATAAGACCCAAATTAACGGCC 690~712 bp
阴性对照 GGCCGTTAATTTGGGTCTTATT 正义序列

1.3 目的基因lasR的克隆与转录

1.3.1 目的基因lasR的克隆

挑取单个PAO1菌落接种于LB液体培养基,37 ℃,200 r/min,12~16 h。取10 mL菌液进行DNA提取,提取步骤按照试剂盒进行 (上海生工生物工程有限公司,SK8225),提取DNA完成后进行目的基因lasR的PCR反应。引物:正义链,5′-ATGGCCTTGGTTGACGGT-3′,反义链,5′-TCAG-AGAGTAATAAGACCCAAATTAACG-3′,产物长度720 bp。产物用2%琼脂糖电泳检测。PCR反应中所用其他试剂如下:LA Taq DNA聚合酶 (5 U/mL, 日本TaKaRa公司,DRR002A);dNTP (10 mmol/L);10×TAE (400 mmol/L Tris-acetate,10 mmol/L EDTA,pH=8.0)。将目的基因lasR与质粒pGEM-T easy vector (美国Promega公司,A1360) 连接导入大肠埃希菌DH5α感受态以获得大量的质粒扩增,并将产物进行酶切和测序鉴定 (测序由深圳华大基因完成)。

1.3.2 目的基因lasR的转录

用限制性内切酶SpeI(美国Promega公司) 将pGEM-T easy lasR线性化,T7聚合酶体外转录系统 (美国Thermo公司) 进行体外转录,转录过程中掺入地高辛 (digoxigenin, DIG) 标记的UTP (uridine-5’-triphos-phate,瑞士Roche公司),DIG-UTP加入体积与UTP体积比为13 :7,产物用2%琼脂糖电泳检测。

1.4 反义寡核苷酸的筛选

取浓度为100 nmol/L反义寡核苷酸序列探针1 μL点样于带正电的尼龙膜,放入基因交联仪 (美国Bio-Rad公司) 中进行固定,设定参数为能量125 J,时间为5 min。将尼龙膜放入预杂交液中,42 ℃预杂交1 h,在杂交液中加入体外转录的产物 (浓度为10 ng/mL),42 ℃进行杂交4 h。杂交结束后取出尼龙膜,用2×SSC (含0.1%SDS) 溶液洗涤15 min,重复2次,再用预热至42 ℃的2×SSC (0.1%SDS) 溶液洗涤10 min,重复2次,Washing buffer洗涤2×10 min,Blocking buffer室温封闭30 min,Antibody buffer室温30 min,Washing buffer洗涤2×10 min,加入CSPD显色,37 ℃避光显色15 min,凝胶成像仪 (美国Bio-Rad公司) 成像。

1.5 反义肽核酸的设计与合成

根据反义寡核苷酸序列与lasR mRNA体外斑点杂交结果,选择杂交效果最强的序列,分别合成PNA及与穿膜肽序列 (KFF)3K连接形成的肽-肽核酸 (peptide-PNA,PPNA,北京思尔成生物技术有限公司)。

1.6 光密度值[D(600)]测定和菌落计数检测反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1的生长抑制作用

实验分组为空白对照组、穿膜肽组和PPNA组 (20、40、60、80 μmol/L)。取对数生长期的细菌,用LB液体培养基将铜绿假单胞菌PAO1稀释至107 CFU/mL,取96孔板,每孔加入10 μL菌液,同时加入200 μmol/L的PPNA使其终浓度为20、40、60、80 μmol/L,空白对照组以LB培养液替代PPNA,穿膜肽组以穿膜肽替代PPNA,穿膜肽浓度为40 μmol/L。LB液体培养基补足至100 μL,重复3孔,将96孔板放入恒温摇床孵育 (上海世平公司),设定参数为4 ℃,4 h,37 ℃,24 h。在0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24 h测定细菌光密度[D(600)]值,同时每孔取1 μL;菌液经过LB液体培养基稀释至适当倍数做平板菌落计数。

1.7 qPCR检测反义肽核酸对目的基因lasR mRNA表达的影响

PAO1经不同浓度的PPNA作用24 h后,采用TRIzol法 (TRIzol Reagent,美国Life公司) 提取细菌总RNA作为模板,进行逆转录PCR (PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser,日本TaKaRa公司) 和qPCR (PowerUp SYBR Green Master Mix,美国Life公司) 检测lasR mRNA表达。qPCR引物为正义链5′-CTGTTGCCTAAGGACAGCCA-3′,反义链5′-TGGACGGTTCCCAGTC-3′;反应条件:50 ℃ 2 min,95 ℃预变性2 min,然后95 ℃变性15 s,60 ℃退火及延伸1 min,进行39个循环,在循环结束后加入溶解曲线,参数设定为60~95 ℃,5 s。

1.8 反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的抑制作用

1.8.1 铜绿假单胞菌PAO1生物被膜模型建立

在24孔板中放入10 mm×10 mm的玻片,每孔加入40 μL菌液,空白对照组加入360 μL LB液体培养基,穿膜肽组加入40 μL穿膜肽 (KFF)3K和320 μL LB液体培养基,PNA组加入40 μL PNA和320 μL LB液体培养基,PPNA组加入40 μL PPNA和320 μL LB液体培养基。每组重复3孔,加样完成后放入恒温摇床孵育 (上海世平),设定参数为4 ℃,4 h,37 ℃,48 h。于37 ℃孵育48 h后进行结晶紫染色和扫描电镜观察生物被膜的形成情况。

1.8.2 结晶紫染色检测生物被膜

将1.8.1中孵育48 h成熟的生物被膜用生理盐水清洗3次,过程中尽量轻柔,避免被膜从玻片上脱落,加入结晶紫溶液染色20 min,生理盐水清洗3次,尽量吸干水分,自然干燥15 min,再加入95%酒精脱色15 min,生理盐水清洗3次后将玻片自然晾干后放入显微镜下观察。

1.8.3 扫描电镜观察生物被膜

将1.8.1中孵育成熟的生物被膜用生理盐水清洗3次,过程中尽量轻柔,避免被膜从玻片上脱落,加入戊二醛固定1 h,分别用不同的浓度乙醇及丙酮进行脱水处理 (浓度为30%、50%、70%、95%和99.99%),然后进行真空干燥及样本表面镀金膜处理,放入扫描电镜 (美国Thermo fisher 900) 进行观察。

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prizm 5.0统计软件,计量资料用x±s表示,采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 反义寡核苷酸的筛选

2.1.1 lasR基因的克隆和转录

测序鉴定结果显示:目的基因lasR插入方向和位置正确,可用于后续实验。克隆产物电泳结果见图 1。重组质粒pGEM-T-lasR基因经限制性内切酶SpeⅠ线性化,采用T7聚合酶体外转录体系获得lasR mRNA,转录产物电泳结果见图 2

M:DL 2 000标准;1:基因LasR克隆产物 图 1 lasR基因克隆产物质粒酶切电泳结果

1:基因LasR转录产物;M:DL 5 000标准 图 2 lasR基因体外转录产物电泳结果

2.1.2 斑点杂交实验

2和4号序列显示出较弱的杂交信号,3号序列几乎没有杂交信号的产生,1号序列的杂交信号最强,其序列为:5′-GCTTTCGCGTCTGGTAGATGGA-3′,作用于lasR基因的271~292 bp (图 3)。

1~4:反义链1~4号与lasR mRNA的杂交结果;P:阳性对照;N:阴性对照 图 3 反义序列与lasR mRNA斑点杂交结果

2.2 反义肽-肽核酸的设计

以反义寡核苷酸序列1的序列为基础合成PPNA,PPNA序列为KFFKFFKFFK-OO-GCTTTCGCGTCT,作用于lasR基因的271~292 bp。

2.3 反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1的生长抑制作用

根据测定的D(600) 值绘制经不同浓度PPNA处理细菌的生长曲线 (图 4)。体外杂交信号强的PPNA序列显示出对铜绿假单胞菌PAO1的生长抑制作用,且具有浓度依赖性,在20 μmol/L时显示出微弱的抑制效果,当浓度达到40 μmol/L及以上时则显示出杀灭铜绿假单胞菌PAO1的作用。以细菌菌落计数10的对数值为纵坐标绘制出折线图,结果 (图 5) 显示:PPNA在剂量为40 μmol/L及以上浓度时显示出抑菌效果,PPNA作用14 h内均可抑制细菌的生长,细菌菌落计数维持在1×101~1×103CFU/mL,14~24 h呈现部分抑制细菌生长的结果,菌落数维持在1×103~1×106CFU/mL。

图 4 不同浓度的PPNA对细菌PAO1的生长抑制作用

图 5 不同浓度PPNA对细菌PAO1的生长抑制菌落计数结果

2.4 反义肽核酸对目的基因lasR mRNA表达的抑制作用

空白对照组、穿膜肽组和PPNA 20 μmol/L组之间lasR mRNA表达差异无统计学意义 (P>0.05),PPNA 40、60 μmol/L和80 μmol/L组与其他组之间lasR mRNA表达差异有统计学意义 (P < 0.05)。lasR mRNA表达随着PPNA浓度增加而减少 (图 6)。

1:空白对照组;2:穿膜肽组;3~6:分别为PPNA 20~80 μmol/L组;a: P < 0.05, 与空白对照组、穿膜肽组和PPNA 20 μmol/L组比较 图 6 qPCR检测目的基因lasR mRNA的表达

2.5 反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的抑制作用

2.5.1 结晶紫染色光学显微镜观察

空白对照组、穿膜肽组和PNA组间的生物被膜形成无明显差异,PPNA组的生物被膜形成明显受到抑制 (图 7)。

A:空白对照组;B:穿膜肽组;C:PNA组;D:PPNA组 图 7 反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的抑制作用 (结晶紫染色×1 000)

2.5.2 扫描电镜观察

PPNA组与其他组比较,生物被膜的形成明显受到抑制,细菌生长也明显受到抑制 (图 8)。

A:空白对照组;B:穿膜肽组;C:PNA组;D:PPNA组 图 8 反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的抑制作用 (扫描电镜×3 000)

3 讨论

PA广泛分布于自然界及正常人体,是引起严重医院内获得性感染和交叉感染最常见的条件致病菌之一,其含有的多种毒力因子,在人体抵抗力低下时能引起皮肤感染、呼吸道感染等,亦可引起菌血症、心内膜炎、囊性纤维化 (cystic fibrosis,CF) 等[1]。PA具有多重耐药的特征,对多种抗生素天然耐药,其中生物被膜的形成对介导耐药起着重要作用,生物被膜是以藻酸盐为主要成分的黏液性脂多糖基质,是细菌针对抗生素的有力的物理屏障[10]。随着PA多重耐药及泛耐药菌株的出现,导致其治疗的困难,因此,迫切需要寻找新的治疗方法和药物靶点。研究发现QS在PA致病性中有重要作用,功能性调节子las系统对细菌生物被膜的结构形成具有重要作用,其合成的信号分子N-酰基-高丝氨酸内酯类 (AHL) 在可逆黏附期调控细菌的黏附、游动、细菌生物被膜丛的形成,这些信号分子调控着不同毒力因子的合成[11-14]。周俊立等[15]研究表明干扰铜绿假单胞菌las系统可以明显抑制相关毒力因子的表达。干扰QS的方法主要有:QS信号分子AHL的抑制物、AHL的降解酶、抑制las系统相关蛋白如lasR或者lasI基因的合成[16-18]。已有的研究主要集中利用PNA技术靶向细菌生长过程细胞分化的必需基因如ftsZ、编码细菌拓扑异构酶基因gryA和脂肪酸合成基因acpP等[9, 19-20]。而这些基因不具种属特异性,存在于多种细菌中。本研究中利用反义肽核酸技术干扰铜绿假单胞菌las系统基因lasR达到抑制PA生长的目的。PNA是一种寡核苷酸的类似物,与核酸及其他核酸类似物相比,PNA拥有更好的热稳定性,以及耐核酸酶和蛋白酶的降解等特性[21]。这些特性使得PNA不仅用于反义和反基因治疗,更是可用于抗生素、基因激活物和分子探针。我们利用体外斑点杂交实验进行反义寡核苷酸序列的筛选,以达到和目的基因高效结合。以高效结合的反义寡核苷酸为基础,设计PNA的序列, 这样可以减少随机合成反义肽核酸的盲目性,能够最大程度地模拟体内反义核酸与mRNA杂交的环境。同时由于PNA不带电荷的特性,如何有效进入细菌内成为PNA发挥作用的关键。在已有的研究中,常用的穿膜肽主要有 (RXR)4、H (RX)6和 (KFF)3K等,其中穿膜肽 (KFF)3K广泛用于革兰阴性杆菌,效果显著[21]。本研究中将PNA和穿膜肽 (KFF)3K连接形成PPNA,使得PNA进入细菌内的能力得到增强[7]

为了验证抑制细菌生长作用不是由于穿膜肽 (KFF)3K本身的毒性引起,本研究设置了穿膜肽 (KFF)3K组,结果表明穿膜肽 (KFF)3K组并未明显抑制细菌生长,而PPNA对铜绿假单胞菌PAO1的生长呈明显的剂量依赖,在PPNA浓度达到40 μmol/L及以上时完全抑制了PAO1的生长。表明靶向目的基因lasR mRNA表达量随着PPNA浓度的增加而减少,这证实lasR基因在PAO1的生长过程中起重要作用,干扰lasR基因的表达可以干扰细菌的生长。在生物被膜检测实验中,本研究设置了PNA组和穿膜肽 (KFF)3K组,结果显示PNA组和穿膜肽 (KFF)3K组对生物被膜的形成均无明显的抑制作用,说明不论是单独的穿膜肽 (KFF)3K还是不与穿膜肽 (KFF)3K连接的PNA对细菌本身都不具毒性作用。而与穿膜肽 (KFF)3K连接的PPNA则可以明显抑制PAO1生物被膜的形成,证实了针对las系统的反义肽核酸对生物被膜形成的调控作用,具体的调控机制有待进一步研究。基于针对lasR基因筛选并合成的PPNA发挥了以上作用,下一步研究将针对铜绿假单胞菌的多种耐药和泛耐药菌株进行研究,观察反义肽核酸是否发挥同样的抑菌作用。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201609200
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张峰领, 安琳, 李进, 李发科, 徐欢, 罗杰, 杨成, 蒋文斌, 雷国勤, 汪超, 周琳, 鲁卫平.
Zhang Fengling, An Lin, Li Jin, Li Fake, Xu Huan, Luo Jie, Yang Cheng, Jiang Wenbin, Lei Guoqin, Wang Chao, Zhou Lin, Lu Weiping.
铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究
Screening of antisense peptide nucleic acid sequence targeting lasR gene of Pseudomonas aeruginosa and its inhibition on biofilm formation
第三军医大学学报, 2017, 39(6): 529-535
Journal of Third Military Medical University, 2017, 39(6): 529-535
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201609200

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收稿: 2016-09-30
修回: 2016-11-08

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