2. 400060 重庆,陆军重庆军事代表局门诊部
2. Out-patient Department, Military Representative Bureau of Army, Chongqing, 400060, China
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa,PA) 广泛存在于自然环境中,是战伤伤后感染的主要病原菌之一,也是引起住院患者感染的主要病原细菌之一[1]。近年来,由于多重耐药甚至泛耐药PA的不断出现为其治疗带来巨大的挑战,为此,迫切需要寻求新的靶点及治疗方案。随着对细菌群体感应 (quorum sensing,QS) 的深入研究,细菌群体感应淬灭成为抗菌研究的新方向[2-3]。QS主要影响PA毒力因子以及耐药性的产生,其对细菌耐药性的调控主要表现为调控生物被膜的形成[4-5]。生物被膜形成在PA持续感染及迁延成慢性感染中发挥重要作用,如何有效抑制生物被膜的形成对治疗PA感染起重要作用。现有的抗生素如阿奇霉素可干扰生物被膜的形成,反义技术包括小片段干扰RNA (siRNA)、反义寡核苷酸和反义肽核酸等可有效抑制生物被膜的形成[6]。与传统的反义寡核苷酸相比,肽核酸 (peptide nucleic acid,PNA) 具有较高的水溶性,不易被蛋白水解酶和核酸酶水解,与DNA或RNA的亲和性更强,没有整体毒性和非特异性蛋白结合作用等优势,使得PNA成为更理想的干扰措施[7]。有研究表明利用PNA靶向PA的生物被膜形成的重要基因motA可以显著抑制PA的生长及生物被膜的形成[8]。利用PNA抑制金黄色葡萄球菌生长的作用也在研究中被证实[9]。本研究旨在采用反义肽核酸技术通过靶向PA QS系统的lasR基因,干扰PA引起感染的生长及其生物被膜的形成,为治疗PA引起的感染和防治多重耐药PA的传播提供新思路。
1 材料与方法 1.1 实验菌株铜绿假单胞菌PAO1菌株由重庆市儿童医院景春梅老师惠赠。
1.2 反义寡核苷酸的设计与合成采用RNA structure 5.2软件分析预测lasR mRNA的二级结构图,通过自由能计算选择不稳定的膨胀环区域作为反义序列的靶点区域。设计4条反义寡核苷酸序列探针和1条正义序列作为对照,与目标lasR mRNA进行体外斑点杂交实验。根据lasR基因序列设计的4条反义寡核苷酸序列探针和1条正义序列见表 1。所有核苷酸序列的合成由上海生工生物工程有限公司合成。
序号 | 序列 (5′→3′) | 作用靶点 |
反义链1 | GCTTTCGCGTCTGGTAGATGGA | 271~292 bp |
反义链2 | CATATGGAAGTTCACATTGGCT | 615~637 bp |
反义链3 | CCAAATTAACGGCCATAATGGC | 682~704 bp |
反义链4 | AATAAGACCCAAATTAACGGCC | 690~712 bp |
阴性对照 | GGCCGTTAATTTGGGTCTTATT | 正义序列 |
1.3 目的基因lasR的克隆与转录 1.3.1 目的基因lasR的克隆
挑取单个PAO1菌落接种于LB液体培养基,37 ℃,200 r/min,12~16 h。取10 mL菌液进行DNA提取,提取步骤按照试剂盒进行 (上海生工生物工程有限公司,SK8225),提取DNA完成后进行目的基因lasR的PCR反应。引物:正义链,5′-ATGGCCTTGGTTGACGGT-3′,反义链,5′-TCAG-AGAGTAATAAGACCCAAATTAACG-3′,产物长度720 bp。产物用2%琼脂糖电泳检测。PCR反应中所用其他试剂如下:LA Taq DNA聚合酶 (5 U/mL, 日本TaKaRa公司,DRR002A);dNTP (10 mmol/L);10×TAE (400 mmol/L Tris-acetate,10 mmol/L EDTA,pH=8.0)。将目的基因lasR与质粒pGEM-T easy vector (美国Promega公司,A1360) 连接导入大肠埃希菌DH5α感受态以获得大量的质粒扩增,并将产物进行酶切和测序鉴定 (测序由深圳华大基因完成)。
1.3.2 目的基因lasR的转录用限制性内切酶SpeI(美国Promega公司) 将pGEM-T easy lasR线性化,T7聚合酶体外转录系统 (美国Thermo公司) 进行体外转录,转录过程中掺入地高辛 (digoxigenin, DIG) 标记的UTP (uridine-5’-triphos-phate,瑞士Roche公司),DIG-UTP加入体积与UTP体积比为13 :7,产物用2%琼脂糖电泳检测。
1.4 反义寡核苷酸的筛选取浓度为100 nmol/L反义寡核苷酸序列探针1 μL点样于带正电的尼龙膜,放入基因交联仪 (美国Bio-Rad公司) 中进行固定,设定参数为能量125 J,时间为5 min。将尼龙膜放入预杂交液中,42 ℃预杂交1 h,在杂交液中加入体外转录的产物 (浓度为10 ng/mL),42 ℃进行杂交4 h。杂交结束后取出尼龙膜,用2×SSC (含0.1%SDS) 溶液洗涤15 min,重复2次,再用预热至42 ℃的2×SSC (0.1%SDS) 溶液洗涤10 min,重复2次,Washing buffer洗涤2×10 min,Blocking buffer室温封闭30 min,Antibody buffer室温30 min,Washing buffer洗涤2×10 min,加入CSPD显色,37 ℃避光显色15 min,凝胶成像仪 (美国Bio-Rad公司) 成像。
1.5 反义肽核酸的设计与合成根据反义寡核苷酸序列与lasR mRNA体外斑点杂交结果,选择杂交效果最强的序列,分别合成PNA及与穿膜肽序列 (KFF)3K连接形成的肽-肽核酸 (peptide-PNA,PPNA,北京思尔成生物技术有限公司)。
1.6 光密度值[D(600)]测定和菌落计数检测反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1的生长抑制作用实验分组为空白对照组、穿膜肽组和PPNA组 (20、40、60、80 μmol/L)。取对数生长期的细菌,用LB液体培养基将铜绿假单胞菌PAO1稀释至107 CFU/mL,取96孔板,每孔加入10 μL菌液,同时加入200 μmol/L的PPNA使其终浓度为20、40、60、80 μmol/L,空白对照组以LB培养液替代PPNA,穿膜肽组以穿膜肽替代PPNA,穿膜肽浓度为40 μmol/L。LB液体培养基补足至100 μL,重复3孔,将96孔板放入恒温摇床孵育 (上海世平公司),设定参数为4 ℃,4 h,37 ℃,24 h。在0、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24 h测定细菌光密度[D(600)]值,同时每孔取1 μL;菌液经过LB液体培养基稀释至适当倍数做平板菌落计数。
1.7 qPCR检测反义肽核酸对目的基因lasR mRNA表达的影响PAO1经不同浓度的PPNA作用24 h后,采用TRIzol法 (TRIzol Reagent,美国Life公司) 提取细菌总RNA作为模板,进行逆转录PCR (PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser,日本TaKaRa公司) 和qPCR (PowerUp SYBR Green Master Mix,美国Life公司) 检测lasR mRNA表达。qPCR引物为正义链5′-CTGTTGCCTAAGGACAGCCA-3′,反义链5′-TGGACGGTTCCCAGTC-3′;反应条件:50 ℃ 2 min,95 ℃预变性2 min,然后95 ℃变性15 s,60 ℃退火及延伸1 min,进行39个循环,在循环结束后加入溶解曲线,参数设定为60~95 ℃,5 s。
1.8 反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的抑制作用 1.8.1 铜绿假单胞菌PAO1生物被膜模型建立在24孔板中放入10 mm×10 mm的玻片,每孔加入40 μL菌液,空白对照组加入360 μL LB液体培养基,穿膜肽组加入40 μL穿膜肽 (KFF)3K和320 μL LB液体培养基,PNA组加入40 μL PNA和320 μL LB液体培养基,PPNA组加入40 μL PPNA和320 μL LB液体培养基。每组重复3孔,加样完成后放入恒温摇床孵育 (上海世平),设定参数为4 ℃,4 h,37 ℃,48 h。于37 ℃孵育48 h后进行结晶紫染色和扫描电镜观察生物被膜的形成情况。
1.8.2 结晶紫染色检测生物被膜将1.8.1中孵育48 h成熟的生物被膜用生理盐水清洗3次,过程中尽量轻柔,避免被膜从玻片上脱落,加入结晶紫溶液染色20 min,生理盐水清洗3次,尽量吸干水分,自然干燥15 min,再加入95%酒精脱色15 min,生理盐水清洗3次后将玻片自然晾干后放入显微镜下观察。
1.8.3 扫描电镜观察生物被膜将1.8.1中孵育成熟的生物被膜用生理盐水清洗3次,过程中尽量轻柔,避免被膜从玻片上脱落,加入戊二醛固定1 h,分别用不同的浓度乙醇及丙酮进行脱水处理 (浓度为30%、50%、70%、95%和99.99%),然后进行真空干燥及样本表面镀金膜处理,放入扫描电镜 (美国Thermo fisher 900) 进行观察。
1.9 统计学分析采用GraphPad Prizm 5.0统计软件,计量资料用x±s表示,采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 反义寡核苷酸的筛选 2.1.1 lasR基因的克隆和转录测序鉴定结果显示:目的基因lasR插入方向和位置正确,可用于后续实验。克隆产物电泳结果见图 1。重组质粒pGEM-T-lasR基因经限制性内切酶SpeⅠ线性化,采用T7聚合酶体外转录体系获得lasR mRNA,转录产物电泳结果见图 2。
2.1.2 斑点杂交实验
2和4号序列显示出较弱的杂交信号,3号序列几乎没有杂交信号的产生,1号序列的杂交信号最强,其序列为:5′-GCTTTCGCGTCTGGTAGATGGA-3′,作用于lasR基因的271~292 bp (图 3)。
2.2 反义肽-肽核酸的设计
以反义寡核苷酸序列1的序列为基础合成PPNA,PPNA序列为KFFKFFKFFK-OO-GCTTTCGCGTCT,作用于lasR基因的271~292 bp。
2.3 反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1的生长抑制作用根据测定的D(600) 值绘制经不同浓度PPNA处理细菌的生长曲线 (图 4)。体外杂交信号强的PPNA序列显示出对铜绿假单胞菌PAO1的生长抑制作用,且具有浓度依赖性,在20 μmol/L时显示出微弱的抑制效果,当浓度达到40 μmol/L及以上时则显示出杀灭铜绿假单胞菌PAO1的作用。以细菌菌落计数10的对数值为纵坐标绘制出折线图,结果 (图 5) 显示:PPNA在剂量为40 μmol/L及以上浓度时显示出抑菌效果,PPNA作用14 h内均可抑制细菌的生长,细菌菌落计数维持在1×101~1×103CFU/mL,14~24 h呈现部分抑制细菌生长的结果,菌落数维持在1×103~1×106CFU/mL。
2.4 反义肽核酸对目的基因lasR mRNA表达的抑制作用
空白对照组、穿膜肽组和PPNA 20 μmol/L组之间lasR mRNA表达差异无统计学意义 (P>0.05),PPNA 40、60 μmol/L和80 μmol/L组与其他组之间lasR mRNA表达差异有统计学意义 (P < 0.05)。lasR mRNA表达随着PPNA浓度增加而减少 (图 6)。
2.5 反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的抑制作用 2.5.1 结晶紫染色光学显微镜观察
空白对照组、穿膜肽组和PNA组间的生物被膜形成无明显差异,PPNA组的生物被膜形成明显受到抑制 (图 7)。
2.5.2 扫描电镜观察
PPNA组与其他组比较,生物被膜的形成明显受到抑制,细菌生长也明显受到抑制 (图 8)。
3 讨论
PA广泛分布于自然界及正常人体,是引起严重医院内获得性感染和交叉感染最常见的条件致病菌之一,其含有的多种毒力因子,在人体抵抗力低下时能引起皮肤感染、呼吸道感染等,亦可引起菌血症、心内膜炎、囊性纤维化 (cystic fibrosis,CF) 等[1]。PA具有多重耐药的特征,对多种抗生素天然耐药,其中生物被膜的形成对介导耐药起着重要作用,生物被膜是以藻酸盐为主要成分的黏液性脂多糖基质,是细菌针对抗生素的有力的物理屏障[10]。随着PA多重耐药及泛耐药菌株的出现,导致其治疗的困难,因此,迫切需要寻找新的治疗方法和药物靶点。研究发现QS在PA致病性中有重要作用,功能性调节子las系统对细菌生物被膜的结构形成具有重要作用,其合成的信号分子N-酰基-高丝氨酸内酯类 (AHL) 在可逆黏附期调控细菌的黏附、游动、细菌生物被膜丛的形成,这些信号分子调控着不同毒力因子的合成[11-14]。周俊立等[15]研究表明干扰铜绿假单胞菌las系统可以明显抑制相关毒力因子的表达。干扰QS的方法主要有:QS信号分子AHL的抑制物、AHL的降解酶、抑制las系统相关蛋白如lasR或者lasI基因的合成[16-18]。已有的研究主要集中利用PNA技术靶向细菌生长过程细胞分化的必需基因如ftsZ、编码细菌拓扑异构酶基因gryA和脂肪酸合成基因acpP等[9, 19-20]。而这些基因不具种属特异性,存在于多种细菌中。本研究中利用反义肽核酸技术干扰铜绿假单胞菌las系统基因lasR达到抑制PA生长的目的。PNA是一种寡核苷酸的类似物,与核酸及其他核酸类似物相比,PNA拥有更好的热稳定性,以及耐核酸酶和蛋白酶的降解等特性[21]。这些特性使得PNA不仅用于反义和反基因治疗,更是可用于抗生素、基因激活物和分子探针。我们利用体外斑点杂交实验进行反义寡核苷酸序列的筛选,以达到和目的基因高效结合。以高效结合的反义寡核苷酸为基础,设计PNA的序列, 这样可以减少随机合成反义肽核酸的盲目性,能够最大程度地模拟体内反义核酸与mRNA杂交的环境。同时由于PNA不带电荷的特性,如何有效进入细菌内成为PNA发挥作用的关键。在已有的研究中,常用的穿膜肽主要有 (RXR)4、H (RX)6和 (KFF)3K等,其中穿膜肽 (KFF)3K广泛用于革兰阴性杆菌,效果显著[21]。本研究中将PNA和穿膜肽 (KFF)3K连接形成PPNA,使得PNA进入细菌内的能力得到增强[7]。
为了验证抑制细菌生长作用不是由于穿膜肽 (KFF)3K本身的毒性引起,本研究设置了穿膜肽 (KFF)3K组,结果表明穿膜肽 (KFF)3K组并未明显抑制细菌生长,而PPNA对铜绿假单胞菌PAO1的生长呈明显的剂量依赖,在PPNA浓度达到40 μmol/L及以上时完全抑制了PAO1的生长。表明靶向目的基因lasR mRNA表达量随着PPNA浓度的增加而减少,这证实lasR基因在PAO1的生长过程中起重要作用,干扰lasR基因的表达可以干扰细菌的生长。在生物被膜检测实验中,本研究设置了PNA组和穿膜肽 (KFF)3K组,结果显示PNA组和穿膜肽 (KFF)3K组对生物被膜的形成均无明显的抑制作用,说明不论是单独的穿膜肽 (KFF)3K还是不与穿膜肽 (KFF)3K连接的PNA对细菌本身都不具毒性作用。而与穿膜肽 (KFF)3K连接的PPNA则可以明显抑制PAO1生物被膜的形成,证实了针对las系统的反义肽核酸对生物被膜形成的调控作用,具体的调控机制有待进一步研究。基于针对lasR基因筛选并合成的PPNA发挥了以上作用,下一步研究将针对铜绿假单胞菌的多种耐药和泛耐药菌株进行研究,观察反义肽核酸是否发挥同样的抑菌作用。
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