肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤,在全球范围内以及西方国家的发病率逐年上升[1]。在过去的十年中,肝癌分期主要根据巴塞罗那(BCLC)标准进行临床分期,依赖于成像技术和肝细胞癌肿瘤大小以及结节的数量定义肝癌的进展情况[2]。根据目前欧洲肝脏研究协会(EASL)和美国肝病研究协会(AASLD) 的指南,现有的治疗方法仅局限于针对早期肝癌患者[3]。经过这些治疗包括 肝切除或移植以及局部 的射频消融术(RFA)后患者5年 生存率高达70%[4]。然而,大多数诊断为HCC晚期的患者预后较差,化疗、放疗、分子靶向治疗效果有限,主要以姑息治疗为主,导致中位生存时间<1年[5-6]。因此,早期阶段更准确的检测肝细胞癌,了解肝癌的易感基因,尤其是高危人群,如肝硬化、肝炎患者是非常重要的。
免疫治疗在肝癌的治疗过程中崭露头角,程序性死亡配体-1(programmed death-ligand 1,PD-L1)也成为重要的免疫治疗新靶点,但是目前针对肝癌患者免疫治疗效果,仍然缺乏精准预测及分层指标。PD-L1作为共刺激分子B7家族的一个成员,是由抗原呈递细胞表达,其功能是抑制T淋巴细胞的激活。研究显示,PD-L1通过与其受体结合,诱导T淋巴细胞无反应性和/或凋亡[7-11]。研究表明PD-L1能增加人抗原特异性T细胞克隆的凋亡并抑制CD4和CD8 T细胞的体外活化[7, 12]。最新研究表明,PD-1或PD-L1的抗体可缓解PD-L1对细胞毒性T细胞的抑制作用,从而促进与激活细胞毒性T细胞消灭肿瘤细胞的能力[13-14]。PD-L1的抑制剂是有效的黑色素瘤免疫治疗方法[15]。
因此,为了探索预测针对肝癌免疫治疗效果的指标,结合近期国内外对PD-L1 多态性的研究成果;本研究选取了PD-L1分别位于启动子区、编码区以及非编码区的3个SNP位点(rs4143185、rs17718883和rs2890658),观察并分析了其单核苷酸多态性与肝癌易感性及预后的关系;为肝癌免疫治疗疗效的精准预测进行了初步探索。
1 材料与方法 1.1 临床资料收集2008年2月至2014年5月第三军医大学大坪医院野战外科研究所经过病理确诊的样本264例,分为2组。病例组:原发性肝癌样本123例,其中男性 82例,女性41例,年龄(59.7±10.9)岁,7例有肿瘤家族史;对照组:健康体检样本141例,其中男性104例,女性37例,年龄(60.2±11.2)岁,5例有肿瘤家族史。对照组人群三代以内没有胃肠道疾病或其他癌症史,其外周血淋巴细胞样本是在体检中收集获得的。病例组的临床病例资料包括肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期以及医疗记录。患者在取标本前均未接受过放化疗。本课题经大坪医院野战外科研究所伦理委员会审查通过。
1.2 单核苷酸多态性位点的选取检索GenBank数据库与相关文献中报道的(rs4143185、rs2890658和rs17718883)基因序列,应用Oligo6.0软件设计引物并通过Prime Premie 5.0软件验证,最终确定3个SNPs位点的6条引物(表 1),rs4143185位点由重庆志达生物科技公司采用测序技术进行分析。所有引物由上海Invitrogen公司合成。
目的基因 | 引物序列 |
rs4143185 | 上游:5′-GATACACATTTGGAGGAGACG-3′
下游:5′-CAAATACTCCATGTTTTACTAG-3′ |
rs17718883 | 上游:5′-TACGTAGTTCTGTGCTCAG- 3′
下游:5′- GTTGATTCTCAGTGTGCTG- 3′ |
rs2890658 | 上游:5′-AATGGCTTGTTGTCCAGAGATG-3′
下游:5′-GTACCACATGGAGTGGCTGC-3′ |
1.3 PCR扩增
PCR反应体系配制(25 μL),将下列试剂依次加入0.5 mL的EP管中,5×buffer(5 μL),MgCl2(2 μL),模板DNA(2 μL),dNTP(2 μL),上游引物(1 μL),下游引物(1 μL),Taq DNA聚合酶(0.2 μL),ddH2O(9.8 μL)。振荡混匀,然后在4℃离心机中瞬离30 s,再将EP管放入PCR仪中扩增,反应条件如下。rs2890658:预变性(95 ℃,10 min)→变性(95 ℃,30 s)→退火(60 ℃,30 s),延伸(72 ℃,3 min),37个循环→延伸(72 ℃,10 min);rs17718883:预变性(95 ℃,3 min)→变性(94 ℃,1 min)→5个循环→退火(55 ℃,1 min),延伸(72 ℃,1 min),30个循环→延伸(72 ℃,1 min);rs4143185:预变性(94 ℃,5 min)→变性(94 ℃,20 s)→5个循环→退火(55 ℃,30 s),延伸(72 ℃,1 min),35个循环→延伸(72 ℃,7 min)。
1.4 DNA测序分析由上海Invitrogen生物公司运用AI377型测序仪对随机抽取5%的DNA样本进行DNA测序,测序与PCR重合率100%。
1.5 随访采用电话随访方式或者门诊方式对123例患者进行随访。总生存时间定义为自确诊肝癌之日起至出现与肝癌相关的死亡的时间。死于其他原因或在随访期内生存的病例则作为截尾事件处理。全部患者随访10~48个月,中位随访时间20个月,随访截止时间为:2016年5月1日。
1.6 统计学分析采用SPSS 19统计软件。使用拟合优度皮尔森卡方(χ2)检验对照组和病例组基因型分布是否符合哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡。比值比(OR)和95%置信区间(CI)使用logistic regression分析。使用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验测定生存曲线PFS和OS。采用多变量Cox比例风险模型(前进逐步:似然比)估计调整后的危险比(HR)与95%置信区间。多变量回归分析年龄、性别、病理分级和治疗方法。P<0.05被认为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 人口统计学特征共纳入264例受试者,其中病例组123例,对照组141例,两组年龄、性别和肿瘤家族史相匹配。病例组手术治疗34例,介入治疗75例,介入合并射频治疗14例。
2.2 单个基因的单核苷酸多态性与肝癌易感性之间的关系对照组的基因型频率遵循Hardy-Weinberg平衡定律(表 2),该群体遗传基因平衡,具有群体代表性。分析显示位点rs17718883与肝癌易感性相关(P<0.001)。运用Logistic回归分析显示,在对年龄、性别以及家族史进行校正后,rs2890658的AC杂合突变基因型可以降低肝癌的发病风险(OR=0.43;95%CI:0.20~0.94;P=0.035);rs4143185纯合突变型(GG)可能会增加肝癌的患病风险(OR=2.80),但是差异无统计学意义(P=0.057)。rs17718883的CG杂合突变基因型可以降低发病风险(P<0.001),但是例数太少可能存在数据偏倚;其余基因型与肝癌的易感性之间无相关性(P>0.05,表 3)。
SNP | 基因型 | 观察值(%) | 期望值 (%) | P(HWE) |
rs2890658 | AA | 98(69.5) | 97.9(69.4) | 0.960 |
AC | 39(27.7) | 39.2(27.8) | ||
CC | 4(2.8) | 3.9(2.8) | ||
rs17718883 | CC | 77(54.6) | 72.3(51.3) | 0.054 |
CG | 48(34.0) | 57.3(40.6) | ||
GG | 16(11.4) | 11.4(8.1) | ||
rs4143185 | CC | 49(34.8) | 53.7(38.1) | 0.095 |
CG | 76(53.9) | 66.6(47.2) | ||
GG | 16(11.4) | 20.7(14.7) | ||
HWE:Hardy-Weinberg 平衡 |
SNP | 基因型 | 病例组
[例(%)] | 对照组
[例(%)] | P值 | 校正OR
(95%CI) | P值 |
rs2890658 | AA | 95(77.2) | 98(69.5) | 1(参考值) | ||
AC | 27(21.9) | 39(27.7) | 0.243 | 0.43(0.20-0.94) | 0.035 | |
CC | 1(0.8) | 4(2.8) | 0.370 | 0.14(0.01-1.93) | 0.142 | |
A allele | 217(88.2) | 235(83.3) | 1(参考值) | |||
C allele | 29(11.8) | 47(16.7) | 0.111 | 0.67(0.41-1.10) | 0.142 | |
rs17718883 | CC | 122(99.2) | 77(54.6) | 0.000 | 1(参考值) | |
CG | 1(0.8) | 48(34.0) | 0.000 | 0.01(0.00-0.05) | 0.000 | |
GG | 0(0) | 16(11.4) | 0.000 | - | ||
C allele | 245(99.6) | 204(72.3) | 1(参考值) | |||
G allele | 1(0.4) | 78(27.7) | 0.000 | 0.01(0.00-0.08) | 0.000 | |
rs4143185 | CC | 50(40.7) | 49(34.8) | 1(参考值) | ||
CG | 50(40.7) | 76(53.9) | 0.105 | 0.66(0.32-1.36) | 0.255 | |
GG | 23(18.6) | 16(11.4) | 0.369 | 2.80(0.97-8.06) | 0.057 | |
C allele | 150(61.0) | 174(61.7) | 1(参考值) | |||
G allele | 96(39.0) | 108(38.3) | 0.864 | 0.97(0.68-1.38) | 0.935 |
2.3 PD-L1 SNP与肝癌患者预后情况相关性分析
在对PD-L1 SNP与肝癌患者预后情况相关性分析后,本研究发现rs4143185、rs2890658和rs17718883位点突变型都能不同程度的增加患者的中位生存时间;其中rs2890658位点的3个基因型AA、AC和CC的中位生存时间分别为:17、20、19个月,差异无统计学意义(P=0.115),但是合并突变基因型AC与CC后,中位生存时间为20个月,与AA比较差异有统计学意义(P=0.042,图 1);rs4143185位点的三个基因型CC、GC和GG的中位生存时间分别为:15、21、18个月,,差异有统计学(P<0.001),合并突变基因型GC 与CC后,发现GC+GG和CC的中位生存时间为:21个 月和15个月,差异有统计学意义(P<0.001);并且经过Bonferroni-Holm法校正后仍有统计学意义(图 2)。COX回归模型分析rs4143185和rs2890658位点,显示rs4143185的突变基因型都可以获得好的预后,差异有统计学意义(HR<1,P<0.05),rs17718883各基因型的差异未发现统计学差异(表 4)。
SNP | 基因型 | n | 总的生存时间(月) | |||
中位生存时间 | P值 | HR(95%CI) | P值 | |||
rs2890658 | AA | 95 | 17 | 1(参考值) | ||
AC | 27 | 20 | 0.042 | 0.68(0.32-1.45) | 0.322 | |
CC | 1 | 19 | 0.583 | 1.17(0.31-4.38) | 0.822 | |
AC+CC | 28 | 20 | 0.036 | 0.56(0.31-1.00) | 0.051 | |
rs17718883 | CC | 122 | 17 | 1(参考值) | ||
CG | 1 | 14 | 0.466 | 1.43(0.53-3.85) | 0.480 | |
GG | 0 | - | - | - | - | |
CG+GG | 1 | 14 | 0.466 | 1.43(0.53-3.85) | 0.480 | |
rs4143185 | CC | 50 | 15 | 1(参考值) | ||
CG | 50 | 21 | 0.000 | 0.37(0.22-0.63) | 0.000 | |
GG | 23 | 18 | 0.005 | 0.40(0.21-0.78) | 0.007 | |
CG+GG | 73 | 21 | 0.001 | 0.38(0.23-0.61) | 0.000 |
3 讨论
肝癌是一种在中国比较常见的恶性肿瘤,发病率较高,预后差。肝癌的病因非常复杂,生物化学危险因素和遗传异常等多因素的相互作用可能会导致肝癌的发生。到现在为止,其机制还没有被完全阐明。随着免疫治疗的兴起与发展,免疫治疗也被逐步应用到肝癌的治疗中。近来的研究也证实以PD-L1为检查点的免疫治疗在肝癌的治疗中起重要作用。
最近国内外研究表明PD-L1的多态性可能与多种肿瘤与自身免疫性疾病发病风险有关[16-18]。几项研究表明PD-L1的多态性与类风湿、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病有关[10, 19]。Wang等[20]研究证实位点rs17718883(6777 G)与类风湿结节的患病率相关联,PD-L16777 G(+)的类风湿结节的患病率显著高于PD-L16777 G(-)的患者(P=0.005,OR=4.0,95%CI=1.5-10.9)。Wang等[21]证实了PD-L1基因3′UTR 上的miRSNPs可能会增加胃癌发病风险,SNP可能是通过miR-570对B7-H1mRNA的调控作用影响B7-H1 蛋白质的表达,从而影响胃癌易感。
本研究结果显示,rs17718883位点与肝癌易感性有关,运用logistic回归分析后发现位点rs2890658(AC突变型)可能降低肝癌发病风险,差异有统计学意义(OR=0.43,P=0.035);rs4143185纯合突变型(GG) 可能会增加肝癌的患病风险,差异无统计学意义(OR= 2.80,P=0.057)。而位点rs17718883在肝癌里面基本不发生突变,突变率为0.84%,该位点可能是肝癌的一个保护因素该结果与Wang等[20]研究类风湿结节的患病率相关联的结论相反。结合两者结果与疾病的免疫状态,本研究推测rs17718883突变型可能影响或抑制PD-L1的功能,导致以PD-L1为检查点的T细胞免疫抑制作用减弱,防止肝癌细胞的免疫逃逸,但是却增加了免疫性疾病的发病风险。由于本研究例数较少尚需在今后的实验中进一步证实。
对这3个位点与肝癌患者预后情况单因素相关性分析,发现rs4143185、rs2890658两个位点突变型都能不同程度的延长患者的中位生存时间;且差异有统计学意义,但在运用COX回归进行分析后,仅发现位点rs4143185有统计学差异。rs4143185位于PD-L1基因的3′UTR上,其SNP可能会在mRNA水平影响PD-L1 蛋白质的表达,导致PD-L1蛋白水平降低,从而引起PD-L1/PD-1受体与配体结合量减少,激活T细胞对肝癌细胞的免疫攻击,肝癌细胞的转移得到控制,患者的生存时间相应延长,该结果与Wang等[21]在2013年的研究成果一致。rs2890658位于内含子区,其对PD-L1的表达以及功能可能不存在显著的影响。rs17718883由于突变型例数太少统计学意义不明显。
因此,在今后的抗PD-L1的肝癌免疫治疗过程中,rs4143185、rs17718883和rs2890658位点的基因型状态的测定可能与肝癌患者的免疫治疗效果有关,突变型在抗PD-L1免疫治疗后能获得更好预后。但是本研究还存在一定局限性:由于条件限制,只纳入了264例样本,例数偏少,导致本研究结果意义有限,结论较初步。本研究回顾性分析得出的初步结论可作为进一步前瞻性关联研究的起点,所得相关结论的可靠性还需要更大样本量的实验来验证,3个位点的具体功能以及对肝癌的影响方式还需今后的细胞和动物实验进行证实。
综上所述,本研究发现PD-L1 SNP rs4143185和rs2890658位点与肝癌易感性和预后的关系。为今后针对肝癌患者以PD-L1 为靶点的免疫治疗提供新的思路。
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