2. 402160 重庆永川，重庆医科大学附属永川医院：中心实验室
2. Center for Clinical Laboratory, Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 402160, China
维生素D是人体必需的营养素，是体内钙稳态及骨代谢主要调节因子之一，其作用除经典的调节钙磷代谢外，还在免疫系统调节，抑制细胞坏死、肿瘤浸润和转移，调节细胞增殖和分化等方面起重要作用[1-2]。3～6岁正是儿童生长发育的关键阶段，其维生素D营养状况不仅关系着现阶段的生长发育，也影响成年后的健康情况。25-(OH)D是维生素D在血液循环中的主要代谢产物，是人体内维生素D的主要储存形式，其在血液中浓度高、稳定、循环半衰期长，故是反应维生素D营养状况的最佳测评指标[3, 11]。近年各地对儿童维生素D水平的调查较多，但对留守儿童这一特殊群体的维生素D营养状况调查尚缺。因此，本研究将通过检测25-(OH)D水平，对永川地区3～6岁留守儿童维生素D的营养状况进行调查评估。活性维生素D主要通过与维生素D受体(Vitamin D Receptor,VDR)结合发挥生物学作用。VDR基因存在单个碱基突变，这个单个核苷酸突变称为单核苷酸多态性，现认为与骨代谢相关的VDR基因多态性主要为BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ和FokⅠ四个酶切位点[16]。迄今为止研究主要认为维生素D的代谢主要受环境因素影响，有关维生素D代谢产物浓度与VDR基因多态性关系的研究较少。因此，本研究同时探讨VDR基因FokⅠ位点多态性与25-(OH)D的相关性。
1 对象与方法： 1.1 研究对象2015年11月-2016年4月(冬春季)期间，由重庆 医科大学附属永川医院招募永川区部分乡镇3～6岁 留守儿童进行健康体检，最终招募儿童共计285人，其中男童155人，女童130人；同时以来我院儿保科就诊的健康非留守儿童作为对照组，共计141人，其中男童78人，女童63人。留守儿童是指父母双方或其中一方目前为在外务工或经商的农民，且在外务工时间到调查时达到或超过6个月，儿童在当地居住的时间达到或超过6个月(不论户口是否在当地)的儿童。所有研究对象均无明显骨骼系统异常，除外肝、肾疾病、遗传代谢性疾病等影响骨代谢疾病。所有儿童均参与维生素D水平检测，同时参与FOK Ⅰ位点基因型检测的有191人，其中男童101人，女童90人，该部分儿童近期无影响骨代谢药物使用史(如维生素D制剂、肾上腺皮质激素等免疫抑制剂)，留守儿童还需参与调查问卷填写及体格测量。
1.2 研究方法 1.2.1 基本情况首先由我院医务人员向监护人进行维生素D相关知识介绍，所有研究对象均在监护人知情选择的基础上进行维生素D及VDR基因 FOK Ⅰ位点多态性的检测。随后进行调查问卷填写，内容包括儿童基本情况、监护人情况、近期乳类摄入情况、维生素D制剂补充情况、户外活动时间和既往患病情况，所有情况均由经培训的医务人员询问填写。
1.2.2 体格测量测量儿童的身高、体质量，参考2007年世界卫生组织发布的儿童生长标准计算Z评分。评价标准：①年龄别体质量(WAZ)，WAZ＜-2为低体质量，WAZ＞2为超重；②年龄别身高(HAZ)，HAZ＜-2为生长迟缓；③身高别体质量(WHZ)，WHZ＜-2为消瘦，WHZ＞2为肥胖。
1.2.3 维生素D水平测定采用干燥促凝管收集清晨空腹静脉血2 mL，室温下放置20～40 min后离心分离血清，采用液相色谱串联质谱发进行血清25-(OH)D水平检测。仪器为美国AB公司的液相色谱串联质谱仪(API4000)，试剂采用了美国SIGMA公司的标准品和内标品及德国RECIPE公司的质控品。所有检测均严格按仪器操作规程和试剂说明书进行。
维生素D营养状况评价标准[4-5]: ①维生素D严重缺乏：25-(OH)D≤10 ng/mL；②维生素D缺乏：10 ng/mL ＜25-(OH)D≤20 ng/mL；③维生素D不足：20 ng/mL＜25-(OH)D≤30 ng/mL；④维生素D充足：30 ng/mL＜25-(OH)D≤100 ng/mL；⑤维生素D过量：100 ng/mL＜25-(OH)D≤150 ng/mL；⑥维生素D中毒：25-(OH)D＞150 ng/mL。
1.2.4 FokⅠ位点基因型检测采用EDTA抗凝管收集静脉血2 mL，用全血DNA提取试剂盒(天根生化科技公司提供)提取DNA，-20 ℃保存。采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测VDR基因型。扩增试剂盒(Takara提供)，引物按文献设计[6]上游引物5′-GATGCCAGCTGGCCCTGGCACTG-3′，下游引物5′- ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′(由life公司合成)，反应总体积25 μL，其中模板DNA 3 μL，两端引物各0.8 μL，Taq DNA聚合酶0.15 μL，25 mmol/ L MgCL2 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10×PCR 缓冲液2.5 μL，灭菌双蒸馏水补齐至 25 μL。反应条件为：94 ℃预变性 5 min后进行30次循环，每个循环的条件是94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，循环完后72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR扩增产物，加入FOK Ⅰ内切酶(美国NEB公司提供)1 U，10×NEbuffer 2μL，灭菌双蒸馏水补齐至20 μL。37 ℃水浴消化3 h。酶切产物于2%EB的琼脂糖凝胶上电泳后用凝胶图像分析系统分析基因型。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料采用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用方差分析，多组中两两比较采用LSD检验；率 的比较采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 基础资料参与维生素D检测的285名留守儿童中，每日平均奶量达到500 mL以上的仅占5.2%，31.6%儿童每日平均奶量在250～500 mL之间，其余每日奶量多在250 mL以下。全天户外活动时间达到2 h以上的儿童占92%，1～2 h儿童占7.7%。3岁以前补充过维生素D制剂的儿童约有27.4%，3岁以后仍有补充外源性维生素D的仅占5%左右。
2.2 体格发育情况本研究中共有278名留守儿童完整的收集到了身高及体重信息，其中生长迟缓问题较为严重，超重问题也较突出。见表 1。经Z评分分析，本地区留守儿童生长迟缓率为14%，消瘦及低体重率为1.4%和2.2%，而超重及肥胖率分别为2.5%和5%。男性儿童超重及肥胖率均高于女性。见表 2。
| 年龄(岁) | 男性儿童 | 女性儿童 | ||||||
| 例数 | 身高(cm) | 体质量(kg) | BMI(kg/m2) | 例数 | 身高(cm) | 体质量(kg) | BMI(kg/m2) | |
| 3 | 13 | 96.15±3.94 | 15.32±1.44 | 16.57±1.36 | 18 | 97.08±5.16 | 15.53±1.99 | 16.45±1.43 |
| 4 | 40 | 103.03±4.02 | 17.65±2.92 | 16.55±1.87 | 37 | 102.12±5.28 | 16.91±2.19 | 16.17±1.20 |
| 5 | 54 | 108.13±5.19 | 18.71±2.02 | 16.01±1.40 | 47 | 109.22±5.10 | 18.15±2.37 | 15.17±1.30 |
| 6 | 44 | 115.98±5.33 | 20.53±2.74 | 15.22±1.26 | 25 | 115.99±5.16 | 20.32±2.86 | 15.04±1.31 |
| 性别 | 例数 | 生长迟缓 | 消瘦 | 肥胖 | 低体质量 | 超重 |
| 男 | 151 | 22(14.6) | 1(0.7) | 12(7.9) | 2(1.3) | 5(3.3) |
| 女 | 127 | 17(13.4) | 3(2.4) | 2(1.6) | 4(3.1) | 2(1.6) |
| 合计 | 278 | 39(14.0) | 4(1.4) | 14(5.0) | 6(2.2) | 7(2.5) |
2.3 血清25-(OH)D总体水平及年龄、性别对25-(OH)D水平的影响
本次研究共有426名儿童进行了维生素D检测，血清25-(OH)D平均水平为(19.886±5.136)ng/mL，其中留守儿童组血清25-(OH)D平均水平为(19.566± 5.185)ng/mL，非留守儿童组血清25-(OH)D平均水平为(20.533±4.989)ng/mL，非留守儿童组血清25-(OH)D高于留守儿童组，但两组比较无显著差异(t=1.834，P＞0.05)。按照维生素D缺乏的评价标准分组，留守儿童组维生素D严重缺乏8例，占2.81%；维生素D缺乏151例，占52.98%；维生素D不足(临界水平)118例，占41.40%，维生素D充足8例，占2.81%；非留守儿童组无维生素D严重缺乏者；维生素D缺乏67例，占47.5%；维生素D不足(临界水平)68例，占48.2%，维生素D充足6例，占4.3%，均未检测到维生素D过量及中毒者。血清25-(OH)D平均水平随年龄增长逐渐下降，3岁组25-(OH)D平均水平最高，各年龄组维生素D 水平比较，差异有统计学意义(F=7.246，P＜0.001)，组间比较其中3岁组分别与4、5、6岁组比较差异均有统计学意义(P＜0.001)，其余各年龄组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 3。男童和女童血清25-(OH)D平均水平分别为(20.304±5.115)ng/mL和(19.382±5.128)ng/mL，男童血清25-(OH)D水平略高于女童，但两组比较无显著差异(t=1.851，P＞0.05)。
| 年龄
(岁) | 例数
(例) | 25-(OH)D
(ng/mL) | 维生素D营养状况 [例(%)] | |||
| 严重缺乏 | 缺乏 | 不足 | 充足 | |||
| 3 | 52 | 22.863±4.571 | 0(0) | 16(30.77) | 36(69.23) | 0(0) |
| 4 | 113 | 19.825±5.273 | 3(2.65) | 54(47.79) | 51(45.13) | 5(4.42) |
| 5 | 151 | 19.426±5.322 | 4(2.65) | 83(54.97) | 58(38.41) | 6(3.97) |
| 6 | 110 | 19.174±4.525 | 1(0.90) | 65(59.09) | 41(37.27) | 3(2.72) |
| 合计 | 426 | 19.566±5.185 | 8(1.88) | 218(51.17) | 186(43.66) | 14(3.29) |
| F | 7.246 | |||||
| P | ＜0.001 | |||||
2.4 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验
为评价基因频率估计的可靠性,对FOK Ⅰ位点基因型的分布进行了Hardy-Weinberg遗传平衡检验。经统计学检验，VDR基因FokⅠ位点等位基因分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=0.820，P＞0.05)，说明该组资料具有较好的代表性。
2.5 基因型检测结果分型标准: FF(273 bp)，Ff(273 bp、198 bp、75 bp)，ff(198 bp、75 bp) ，FokⅠ酶切结果见图 1 。191例受检儿童中FF、Ff和ff的例数分别为46例、89例和56例，分布频率分别为24.08%、46.60%和29.32%，F等位基因的频率为47.38%，f等位基因的频率为52.62%。
|
| 2：FF 基因型(273 bp)； 4、5、6、7: Ff 基因型(273 bp、198 bp、75 bp)；1、3：ff 基因型(198 bp、75 bp) PCR 扩增产物(273 bp) 图 1 FOK Ⅰ酶切结果 |
2.6 VDR基因FOK Ⅰ位点多态性与25-(OH)D的相关性
本研究得到3种基因型，其中基因型FF的25-(OH)D平均值为(19.798±5.460)ng/mL，Ff为 (20.555±5.893)ng/mL，ff为(18.800±4.772)ng/mL，ff基因型的维生素D水平较其余2种基因型低(见图 2)，但3种基因型的维生素D水平相比较差异无显著统计学意义(F=1.744，P=0.178)(见表 4)。比较3种基因型的维生素D缺乏率，其中ff基因型的维生素D缺乏率[34(60.71%)]较FF[27(58.70%)]和Ff[44(49.44%)]2种基因型更高，但差异无显著统计学意义(χ2=2.105，P=0.349)(见表 4)。采用协方差分析校正年龄对维生素D水平的影响后，各基因型维生素D水平相比较差异仍无显著统计学意义(F=2.233，P＞0.05)。
|
| 图 2 VDR基因FOK Ⅰ位点多态性与维生素D水平的关系 |
| 例数(%) | 25-(OH)D
(ng/mL) | 维生素D缺乏[例(%)]
[25-(OH)D≤20 ng/mL] | |
| 基因型 | |||
| FF | 46(24.08) | 19.798±5.460 | 27(58.70) |
| Ff | 89(46.60) | 20.555±5.893 | 44(49.44) |
| ff | 56(56.62) | 18.800±4.772 | 34(60.71) |
| 等位基因 | |||
| F | 181(47.38) | 98(54.14) | |
| f | 201(52.62) | 112(55.72) |
3 讨论
维生素D在体内发挥着多方面生物学活性，维生素D缺乏不仅可导致儿童佝偻病、肥胖、呼吸道感染和哮喘[7, 20]，而且与成年期糖尿病、癌症、心血管疾病等多系统疾病密切相关[8-9]。流行病学调查结果显示南京、浙江、成都[10, 12-13]地区3~6岁儿童血清25-(OH)D平均水平分别为(58.40±22.79)nmol/L、(31.74±10.17)nmol/L、(24.4±11.2)ng/mL，维生素D不足及缺乏者占47.37%~75.3%，提示学龄前儿童维生素D营养状况普遍低下。本研究则以重庆西部永川区儿童作为调查对象，发现本地区3-6岁儿童维生素D营养低下情况比文献[10, 12-13]中报道的更为严重，血清25-(OH)D平均水平为(19.886±5.136)ng/mL，其中留守儿童血清25-(OH)D平均水平仅为(19.566±5.185)ng/mL，维生素D达适宜水平的仅占2.81%，缺乏者高达55.79%，不足者占41.40%。但本地区留守学童的维生素D水平与非留守儿童相比，总体上并无明显统计学差异，提示本地区的学龄前儿童整体维生素D营养状况不容乐观。
人体的维生素D主要来源于皮肤经紫外线照射后合成的代谢转换而成。2015年最新拟定的《维生素D 缺乏及维生素D 缺乏性佝偻病防治建议》[14](以下简称《建议》)推荐儿童平均户外运动时间应在1～2 h/d。调查中虽绝大部分留守儿童每日户外运动时间能在2 h以上，但冬春季是一年中紫外线照射相对最弱的时段，且重庆市冬春季多雾，机体通过日照合成的内源性维生素D明显减少，故仅靠光照难以使血清25-(OH)D维持在适宜水平。这可能是永川区学龄前儿童维生素D营养状况整体低下的重要原因。在光照不足的情况下，膳食的补充及维生素D制剂的替代就显得尤为重要。然而天然食物中的维生素D含量较低，学龄前儿童主要通过奶制品获取维生素D。本研究发现，由于饮食习惯的原因、家庭收入的限制及隔代监护人的营养意识淡薄，永川区留守儿童奶制品摄入量少，每天摄入奶量达500 mL以上的仅占5.2%，近65%左右儿童每日奶量都在250 mL以下。这可能是永川地区留守儿童维生素D营养低下的重要原因之一。此外，研究还发现约有27.4%的儿童在3岁以前补充过维生素D制剂，但3岁以后仍有补充的仅约5%。本研究中3岁后血清25-(OH)D水平逐年降低，也可能与外源性维生素D补充减少有关。
维生素D的代谢除受环境因素影响外，遗传因素的作用也越来越受到重视。与骨代谢相关的VDR基因酶切位点中，FokⅠ位点目前被认为是唯一可改变VDR氨基酸构成的位点[17]。关于FokⅠ位点多态性与25-(OH)D水平相关性的研究，国内外结论并不一致：Abrams[18]及Smolders等[19]的研究发现ff基因型有更高的25-(OH)D水平，携带 F等位基因的个体比携带f等位基因的个体25-(OH)D水平低，Meropi等[21]却发现ff基因型及携带f等位基因个体25-(OH)D水平更低，国内外亦有不少研究显示FokⅠ位点多态性与维生素D水平可能无关[22-23]。本研究发现正常儿童中ff基因型相比其他基因型维生素D水平更低，维生素D缺乏率高，但不同基因型间维生素D水平及缺乏率无显著统计学差异，提示VDR受体基因FokⅠ位点多态性可能与25-(OH)D水平无关。为进一步验证VDR基因多态性对维生素D代谢影响的本质关系，还需进行大样本、多中心的深入研究，以期实现儿童的维生素D补充和水平控制的个性化方案。
综上所述，本地区留守儿童冬季维生素D水平严重低下主要还是内源性维生素D的生成不足及外源性维生素D补充极少所致。但究其根本，一方面是由于家庭条件所限，另一方面父母长期缺位及隔代监护人营养知识的欠缺也绝不能忽视，调查中还发现本地区留守儿童体格发育情况也不容乐观，生长迟缓问题尤为严重，超重问题也较为突出，两极分化明显，也与监护人问题所致留守儿童膳食结构不合理有关。因此，在留守儿童集中地区，卫生保健部门需广泛开展切实有效的营养科普教育，加强营养喂养、科学喂养指导，提高监护人的营养知识水平。同时，鉴于留守儿童家庭收入较低，建议政府相关部门可加大财政支持，定期免费予留守儿童适量维生素D制剂补充，帮助留守儿童获得生长所需营养素，健康成长。此外，2008年旧版《建议》[11]中推荐婴儿生后2周至2岁需补充维生素D制剂，新版《建议》虽将补充维生素D时间提前至出生后即开始补充，但对需补充至哪个年龄段未做说明。而基于3～6岁儿童生长速度快、普遍摄入奶量不足[12, 15]、冬春季日照减少等情况，及国内多项研究报道提示该年龄段儿童营养状况普遍低下，笔者建议应明确提高对3岁以上儿童维生素D制剂补充的重视程度，冬春季尤甚，补充维生素D的时间可延长至6周岁，甚至整个青少年阶段。
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