抑制性中间神经元是感觉皮层中一类重要的调节性神经元,可通过释放抑制性神经递质从而减弱后一级神经元的反应。通过前馈和反馈的介导,抑制性中间神经元能够在皮层网络中起到平衡调控的作用[1]。虽然抑制性神经元的数量在皮层中仅占总数的1/5左右[2-3],但研究证实其在皮层的信息处理过程中扮演着至关重要的角色。抑制性神经元根据形态学、分子结构以及生理特征的不同,可以将神经元分为小清蛋白(parvalbumin,PV)表达的神经元,生长抑素(somatostatin,SOM)表达的神经元和血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)表达的神经元等[4-5]。其中SOM+神经元是皮层中一类重要的抑制性神经元,虽然数量稀少,但是在皮层网络中却发挥着独特的作用。有研究显示,SOM+神经元在皮层环路中具有去抑制的作用,即通过抑制其他抑制性神经元的反应从而提高兴奋性神经元的发放率[6]。以往的工作对于SOM+神经元的研究主要集中于对神经元自身动作电位发放和膜电位特性的研究[7],然而皮层神经元的功能不仅取决于神经元本身的特性,也与皮层神经元接受的突触输入特性有关[8-9],研究显示在感觉皮层中神经元的功能在很大程度上取决于所接受的不同类型的突触输入,但是目前对于SOM+神经元在皮层环路中接受的突触输入的特性研究尚不清楚[10]。与锥体细胞类似,中间神经元同样需要接受来自于其他神经元的传入才能发挥功能。这种突触传入,既包括源于前级神经元的输入,也包括源于邻近微环路的输入。两者共同组成突触输入,进而决定中间神经元的功能特性。
为了研究SOM+神经元所接受的突触输入特性,我们需要尽可能完整保留为其提供突触输入的丘脑-皮层环路结构。然而现有的主流实验方法对此存在着一些困难。一方面,传统的脑片制备方法,通常会严重破坏从丘脑的内侧膝状体(medial geniculate body,MGB)到初级听皮层(primary auditory cortex,A1)的纤维投射,记录到的突触输入无法反映神经元在完整神经环路下的功能特点;另一方面,由于SOM+中间神经元数量特别稀少,使得在体条件下很难去进行定位并进行全细胞记录。因此,基于以往文献[11]报道,我们在本课题中采用了一种特殊的切片方法,制备能够完整保存MGB到A1纤维投射的离体脑片。我们利用在脑内特异性标记SOM+神经元的转基因鼠,结合离体电生理技术,在A1区域的SOM阳性细胞中记录到由电刺激MGB所诱发的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSC)和抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic currents,IPSC)。本实验的研究结果能够为全面理解SOM+神经元在皮层中的特殊功能提供理论支持。
1 材料与方法 1.1 实验动物2周左右SPF级绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记SOM+神经元的转基因FVB小鼠,体质量15~20 g,雌雄不限,由中国科学院上海神经科学研究所提供,并由第三军医大学实验动物中心繁育饲养。
1.2 实验标本的制备取2周左右的转基因小鼠,按住颈部,立即断头取 脑,迅速置于0~4 ℃的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中冷冻1 min左右。ACSF成分为NaCl 125 mmol/L,KCl 2.5 mmol/L,NaH2PO4 1.25 mmol/L,NaHCO3 25 mmol/L,MgCl2 1.2 mmol/L,CaCl2 2 mmol/L,葡萄糖 10 mmol/L。ACSF中预先通入95% O2+5% CO2至饱和。后将全脑置于冰上修块,第一刀垂直头尾方向切去小脑,第二刀垂直头尾方向切去额叶部分,以此切面为底将组织块立起,第三刀垂直切面同时与脑的水平面呈15°夹角切去皮层的一部分,再以此切面为底,将组织块固定在振动切片机上,切片厚度为300 μm[11]。切片时组织始终浸浴在ACSF的冰水混合物中。将脑片孵育槽提前放在32 ℃的水浴锅中加热,切下的脑片迅速放进脑片孵育槽中,这样做的目的是为了使脑片保持正常的生理状态,方便接下来的实验。另外小鼠脑在放进孵育槽前要一直保存在0~4 ℃饱和氧的ACSF中,目的是为了降低脑组织的代谢水平,避免神经元在离体后由于缺氧而死亡。
1.3 细胞膜荧光探针(Di-Ⅰ)染色传统的脑片制备过程中MGB到A1的投射纤维环路很容易受到外力的破坏,无法记录到突触后电流,所以在离体条件下如何保持完整的信息传导通路是实验成功的关键。为了验证制备脑片的完整性,我们利用免疫组化染色的方法对MGB到初级听皮层的纤维投射环路进行了形态学染色。在离体条件下,利用体式显微镜在丘脑的MGB区域埋置 Di-Ⅰ染 料,然后将脑片放置在4%的多聚甲醛溶液固定3~5 d,最后在激光共聚焦显微镜下成像[11]。通过 Di-Ⅰ染色,我们观察到染料从埋置区域MGB扩散到初级听皮层区域,从形态学上验证纤维投射在MGB和A1之间通路的完整性。
1.4 局部场电位的记录根据小鼠初级听皮层的解剖学定位,结合离体场电位的记录方法,对小鼠初级听皮层进行功能性定位。玻璃电极(BF150-110-10型,美国Sutter公司)由P-1000(美国Sutter公司)电极拉制仪拉制而成,尖端阻抗4~7MΩ。参考电极置入记录槽中,膜片钳放大器将神经元传来的电生理信号放大后输出。记录电极固定后由微电极操纵器控制,缓缓下移至脑片初级听皮层位置,尽量不要碰到细胞。采集的电生理信号由模数转换器传回电脑并保存。细胞外液(mmol/L)成分:NaCl 125,KCl 2.5,NaH2PO4 1.25,NaHCO3 25,MgCl2 1.2,CaCl2 2。初级听皮层通过从丘脑到皮层的白质纤维投射定位,并通过刺激丘脑的MGB或丘脑-皮层投射纤维在皮层引发强的场电位确定位置。
1.5 电刺激刺激强度,刺激间隔:刺激强度为阈上反应的200 μA,每次记录的20 ms处给予1个单脉冲的电流刺激,记录1次的时间为1s,重复记录10次,刺激由Master-8触发及编程。
1.6 全细胞膜片钳记录玻璃电极均由P-1000玻璃电极拉制仪制成,尖端阻抗4~7 MΩ。选出4~5个符合条件的脑片(300 μm) 于恒温水浴锅(32 ℃)中孵育1~2 h后,将脑片小心的转移到膜片钳记录槽中开始实验。膜片钳记录系统置于屏蔽屋中,微操纵器将双轴同心圆电极插入内侧膝状体到初级听皮层投射环路的突触前纤维丛中,随后又缓缓地将记录电极下移到初级听皮层区域(图 1A),参考电极置于记录槽溶液中。选择记录细胞时,应挑选轮廓明显,折光度高的细胞。当记录电极贴附到细胞时(图 1B),给予电极负压吸引,细胞膜与电极尖端形成GΩ的高阻封接,待高阻封接稳定后,再给予电极轻微的负压,使细胞破膜,形成全细胞记录。此时串联阻抗应不超过30 MΩ,若记录过程中串联电阻超过这个数值,立即撤出电极,更换细胞。电极内液缓缓地流入细胞内,引起细胞内外电位的波动。形成全细胞记录后,分别记录SOM+神经元和锥体神经元电压被钳制在-70 mV和0 mV时的EPSC和IPSC(图 1C)。胞内电极充灌电极内液(mmol/L)CsOH 125,gluconic acid 125,TEA-Cl 5,MgATP 4,GTP 0.3,phosphocreatine 10,HEPES 10,EGTA 10,CsCl 2,QX-314 1.5。电生理记录结束后,将脑片置于4%多聚甲醛(4 ℃)溶液中固定72h以上,在体视镜下操作,于 MGB处包埋Di-Ⅰ颗粒,再次置于4%多聚甲醛(37 ℃)溶液中1个月以上。完成的标本在激光共聚焦显微镜下观察并拍摄照片,以再次确定纤维结构的完整性。
1.7 统计学分析
采集的神经元反应通过膜片钳放大器(AXON 700B)进行放大,并用Clampex10.4软件进行实时监控和记录。数据采集全程由计算机程序控制,并进行离线分析。采集的数据使用Clampfit、Matlab、Excel进行统计分析,组间分析使用两样本t检验,并且用Origin 9进行作图,统计数据用x±s表示。检验水准:P<0.05,P<0.01认为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 初级听皮层的功能性定位依据所介绍的局部场电位记录方法,在完整保留MGB-A1投射的离体脑片上,根据小鼠脑解剖图谱,我们将皮层初步分为6个区域(图 2A)。通过电刺激MGB区域,通常可以在皮层的第2区域记录到稳定出现的反应最强的局部场电位(local field potential,LFP),从而在功能上证明第2区域就是初级听皮层,接受来自于MGB的直接投射(图 2B)。
2.2 SOM+神经元和锥体神经元突触后电流的起始潜伏期比较
在完成初级听皮层定位之后,我们利用全细胞记 录技术将电压分别钳制在-70 mV和0 mV,记录SOM+ 神经元和锥体神经元由刺激所诱发的稳定的EPSC和IPSC。图 3表示的是SOM+神经元和锥体神经元EPSC和IPSC起始潜伏期的分布情况。从图 3A和3C中可以看出这两类神经元EPSC的起始潜伏期都集中在10 ms附近,并呈现正态分布,其中锥体神经元EPSC的起始潜伏期分布范围更广。图 3B和3D中两类神经元IPSC的起始潜伏期集中在12~16 ms,其中SOM+神经元IPSC的起始潜伏期要略大于锥体神经元IPSC的起始潜伏期。但图 4的统计结果表明,两类神经元EPSC和IPSC的起始潜伏期差异不存在统计学意义(P>0.05)。
2.3 SOM+神经元和锥体神经元突触后电流的峰值潜伏期比较
从图 5A~D可以看出SOM+神经元和锥体神经元EPSC和IPSC的峰值潜伏期都是比较集中的,其中SOM+神经元EPSC的峰值潜伏期主要集中在10~20 ms,同时SOM+神经元EPSC的峰值潜伏期要小于锥体神经元的峰值潜伏期。统计结果显示两类神经元EPSC的峰值潜伏期差异具有统计学意义(P<0.05);SOM+神经元的EPSC到达峰值的时间小于锥体神经元;与之类似,SOM+神经元IPSC的峰值潜伏期也要小于锥体神经元IPSC的峰值潜伏期,差异具有统计学意义(P<0.01,图 6)。两类神经元EPSC和IPSC峰值潜伏期的结果提示SOM+神经元所接受的突触输入与锥体神经元相比在局部皮层环路上有所不同。
2.4 SOM+神经元和锥体神经元突触后电流幅度的比较
通过比较38个SOM+神经元和35个锥体神经元EPSC和IPSC的幅度大小(图 7A~D),发现两类神经元的EPSC和IPSC在幅度上差异没有统计学意义(P>0.05,图 8),提示SOM+神经元和锥体神经元在接受突触输入的强度上是相似的。
3 讨论
神经元功能的实现主要依赖于其接受的不同类型的突触输入。其中,已有文献[12]报道抑制性通路的失衡能够造成皮层功能的紊乱,进而影响大脑功能的执行。帕金森综合征、神经性耳鸣、癫痫、抑郁症等疾病的产生,都与抑制性通路的功能失衡密切相关[13]。以往的工作提示我们,初级听皮层第4层的锥体神经元接受来自于丘脑的直接兴奋性输入,和源于皮层内部环路的抑制性输入[14-15]。通过对SOM+神经元和邻近的锥体神经元时间特性以及幅度上的比较,我们可以部分理解SOM+神经元所接受的突触输入的特点。本实验主要利用全细胞膜片钳记录方法,分别记录由刺激诱发的SOM+神经元和锥体神经元的EPSC和IPSC。本研究的结果提示,在初级听皮层中SOM+中间神经元接受的突触输入与锥体神经元接受的突触输入在基本电生理特性上类似,但时间特性上的差异提示两者接受的突触输入在皮层内环路来源上可能存在一定差异。
单个皮层神经元可能同时与数千个突触前神经元存在突触连接,而起始潜伏期则主要是由神经元接受的最快的突触输入所决定。由于皮层内锥体神经元接受的是来自丘脑的直接突触输入[14],并且SOM+神经元起始潜伏期与锥体神经元的起始潜伏期相接近,所以我们推测SOM+神经元可能也接受来自丘脑的突触输入。此外我们观察到SOM+神经元和锥体神经元EPSC和IPSC的峰值潜伏期差异存在统计学意义,并且SOM+神经元突触后电流的峰值潜伏期要小于锥体神经元,提示SOM+神经元接受的突触输入在皮层内环路来源上与锥体神经元不同。因此,我们推测除了来源于丘脑的直接投射所产生的突触输入之外,SOM+神经元还接受其他环路来源的突触输入,并且与锥体神经元有所不同。在本实验中,我们还观察到两类神经元EPSC和IPSC的幅度差异没有统计学意义,提示SOM+神经元和锥体神经元在接受突触输入的强度上是相似的。
另外,与传统的抑制性中间神经元不同,SOM+型神经元具有独特的“去抑制”功能。这类神经元能够通过抑制其他的中间神经元,进而起到兴奋锥体神经元的作用[6, 16]。本研究表明,SOM+神经元自身也能接受抑制性的突触输入,但突触输入的来源仍然有待研究。未来如能采用光遗传与膜片钳相结合的实验技术,则有可能更全面的阐明SOM+神经元突触输入的机制,从而帮助回答不同类型的突触输入是如何决定神经元功能的这一关键性科学问题。
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