瘢痕疙瘩常超越损伤边缘生长、侵袭毗邻组织,极少自发退化,与肿瘤类似,严重影响机体功能,至今仍缺乏有效的预防及治疗方案,故深入探究瘢痕疙瘩的致病机制是预防和治疗的关键。
骨母特异性因子2是成骨细胞及成骨细胞样细胞系分泌的胞外基质蛋白[1]。研究认为,骨母特异性因子2在多种肿瘤中异常高表达,参与肿瘤的血管生成、侵袭和转移等多个过程,刺激细胞增殖而促进肿瘤进展[2],以上研究提示骨母特异性因子2可能是肿瘤发生发展的关键分子之一。瘢痕疙瘩是一种良性肿瘤,我们前期实验发现,其骨母特异性因子2的表达水平明显高于正常皮肤组织。此外,研究发现,骨母特异性因子2与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩病理过程密切关联,主要调控成纤维细胞的增殖、凋亡和分化等[3-4]。随后,进一步研究发现骨母特异性因子2可促进脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, hADSCs)、人角膜干细胞(human limbal stem cells, HLECs)和神经干细胞(neural stem cells, NSCs)等的增殖[5-7]。尽管Moon等[8]从瘢痕疙瘩中分离出一类具多能性的瘢痕疙瘩间充质干细胞(keloid mesenchymal stem cells, KMLSCs),并证明该细胞可通过失控性自我更新、增强细胞增殖和药物抵抗而调控瘢痕疙瘩致病过程[9-10],但是骨母特异性因子2与KMLSCs的增殖联系则极少研究。
低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low-density lipoprotein receptor-related protein 5,LRP5)为LRP超家族中的膜蛋白,与LRP6共同组成辅助受体后激活Wnt信号通路,使GSK-3β失活,引起下游β-catenin的累积,启动靶基因转录,直接参与调控细胞增殖、凋亡、迁移分化等生物学行为,降低LRP5的表达后,则出现肿瘤抑制,抗肿瘤性增强[11-13]。此外,前期实验发现[14],在瘢痕疙瘩成纤维细胞中,骨母特异性因子2可与LRP5相互作用而促进细胞增殖,但是这一现象是否也存在于KMLSCs中尚不清楚。
因此,基于目前现有的研究基础,我们推测骨母特异性因子2可能与KMLSCs的增殖状态存在某种联系,且可能与LRP5表达相关,本研究拟通过体外相关实验进行验证。
1 材料与方法 1.1 材料西南医院整形美容外科提供所有组织,患者年龄5~35岁,术前获其知情同意。人骨髓间充质干细胞完全培养基和FBS购自于中国赛业公司,0.25%胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA购自于美国Gibco公司,DispaseⅡ和Ⅳ型胶原酶购自于美国Sigma公司,MTT试剂盒购自于中国碧云天公司,免疫化学试剂盒购自于中国凯基生物公司,鼠抗人CD73-PE、CD90-APC和CD34-FITC购自于美国BD公司,兔抗人GAPDH、骨母特异性因子2和LRP5抗体购自于Abcam公司,胶回收试剂盒购自于美国Qiagen公司,分子克隆试剂购自于日本TaKaRa公司,慢病毒包装质粒和qPCR引物均来自上海生工生物公司,倒置相差显微镜购自于日本Olympus公司,恒温培养箱、酶标仪购自于美国Thermo公司,共聚焦显微镜和流式细胞仪等由第三军医大学公共实验平台提供。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与流式细胞术(FCM)分选取3组无菌瘢痕疙瘩和皮肤,相同条件处理组织,修剪清洗组织并切成3~5 mm长条状,DispaseⅡ 4 ℃过夜消化。弃表皮,剪碎真皮,Ⅳ型胶原酶37 ℃下消化3~5 h,过滤收集消化液并离心,弃上清,人骨髓间充质干细胞完全培养基调整细胞浓度,于37 ℃ 5%CO2的恒温培养箱中常规培养,24 h后换液,以后换液频率为3 d/次,当细胞融合度超过80%时,按1:2~1:3比例传代,接种浓度为3×105/mL。收集生长良好的P3细胞,浓度调整为1×106/mL,各取98 μL细胞悬液同时各加入2 μL的CD73-PE、CD90-APC和CD34-FITC,用PBS阴性对照,室温避光孵育30~60 min,离心,PBS重悬细胞,分装入流式管,上机分选,收集目的细胞并扩增,P5代细胞用于后续实验。
1.2.2 免疫细胞化学收集KMLSCs和皮肤干细胞(skin precursors, SKPs)分别制作细胞爬片,24 h后预冷的4%多聚甲醛固定,按照免疫组化染色试剂盒步骤操作,后经DAB显色、苏木精染色、梯度乙醇脱水、干燥和封片。胞质显示棕黄色或褐色为阳性着色。
1.2.3 干扰慢病毒载体构建及包装采用Invitrogen公司在线RNAi设计系统设计3条骨母特异性因子2基因的siRNA干扰靶点序列及1条无关序列作为阴性对照组(表 1)。按转染试剂说明书,将合成的4条siRNA分别转染6孔板中的KMLSCs内,6 h后换液继续培养, 48 h后收集细胞,设计引物(表 1), 采用qPCR检测筛选出干扰能力最强的靶点,将双链寡核苷酸退火形成双链,在与经EcoRⅠ和BamHⅠ双切线性化后的pLVX-shRNA2载体进行重组,产物进行测序鉴定。进一步与辅助质粒共转染到293FT细胞,48 h后,收集病毒,同样方法获得阴性对照的空载体病毒,再分别转染KMLSCs,未转染组用等量PBS处理细胞,作为空白对照。最后流式细胞仪分析感染效率为干扰组96.31%和空载体组96.18%。
序列名称 | 靶序列(5′→3′) | 信息 |
骨母特异性因子2-siRNA1 | TGATTGGCAGTCTTCAGCCTAT | G/C (44.0%) |
骨母特异性因子2-siRNA2 | CACCTGTTGGAAATGATCAACTGCT | G/C (44.0%) |
骨母特异性因子2-siRNA3 | AAGGCAGTCCTTCAGCCTATTATCAA | G/C (40.0%) |
TNC-siRNA | TACCCTAAGTTCGGGTGGAATAATT | G/C (40.0%) |
骨母特异性因子2上游 | TTGATGGAGTGCCTGTGGAA | 241 bp |
骨母特异性因子2下游 | AACTTCCTCACGGGTGTGTC | |
GAPDH上游 | GAGAAGGCTGGGGCTCATTT | 231 bp |
GAPDH下游 | AGTGATGGCATGGACTGTGG |
1.2.4 Western blot
基因干扰前,分别收集KMLSCs和SKPs,PBS漂洗,4 ℃下3 000 r/min离心10 min,加入裂解液120 μL,冰上裂解30 min,100 ℃煮沸变性10 min,冰上复性5 min,超声粉碎30 s,12 000×g离心30 min,吸上清。BSA分析试剂测定蛋白质浓度。30 μg总蛋白质在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,转移至NC膜。一抗抗体(骨母特异性因子2抗体1:500稀释,GAPDH抗体1:2 000稀释)与膜室温孵育2 h后洗涤3次,二抗(HRP标记山羊抗兔IgG 1:2 000)与膜室温孵育2 h后洗涤,ECL试剂盒进行化学发光检测。
1.2.5 qPCR和Western blot检测慢病毒感染干扰效果慢病毒转染细胞48 h后, 刮刀收集干扰组KMLSCs于1.5 mL离心管,TRIzol提取细胞中RNA,RNA按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,骨母特异性因子2基因及GAPDH基因PCR扩增引物(表 1), 用PCR仪测定骨母特异性因子2的mRNA表达水平。同样方法提取空载体组和未转染组KMLSCs的RNA并测量,Western blot检测3组蛋白样本,具体方法参照步骤1.2.4方法。
1.2.6 MTT检测于96孔板分别接种3组对数期KMLSCs 1×106/孔,体积为200 μL,每组设3个复孔,同时设空白孔。分别培养0、24、48、72、96 h后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL后37 ℃培养4 h。弃培养基,加入150 μL DMSO, 室温避光摇床振荡10 min,以空白孔为对照,用酶标仪490 nm波长测定各孔光密度值[D(490)值]。重复3次。
1.2.7 FCM检测细胞凋亡和细胞周期病毒感染48 h后,分别收集各组细胞,细胞浓度为1×106/mL,分成两部分,其中一部分用PBS洗涤,离心2次,留取细胞沉淀,BDinflux检测细胞凋亡率;另一部分PBS清洗后,70%乙醇4 ℃固定过夜,按照周期检测试剂说明行PI染色后流式488 nm波长检测细胞周期。实验重复3次。
1.3 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件,计量资料以x±s表示,组间差异用单因素方差分析和t检验,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 细胞形态学特点和FCM分选细胞接种24 h内逐渐贴壁,镜下见细胞呈椭圆形,个别为梭形,72 h后细胞逐渐表现出极性,细胞呈明显的集落样生长。经传代培养后,细胞形态逐渐均一。细胞流式分选结果示,CD73+CD90+ KMLSCs比例为95.1%,CD73+CD90+ SKPs为94.9%,几乎不表达CD34(图 1)。
2.2 KMLSCs和SKPs中骨母特异性因子2的表达变化
瘢痕疙瘩中骨母特异性因子2的表达明显高于皮肤,因此,为明确KMLSCs和SKPs中骨母特异性因子2的表达情况是否与组织一致,采用细胞免疫化学染色和Western blot进行检测,结果显示, KMLSCs中骨母特异性因子2蛋白的表达明显高于SKPs,Western blot检测结果显示,KMLSCs中骨母特异性因子2蛋白明显增强,蛋白半定量分析结果显示,KMLSCs为(0.97±0.01),SKPs为(0.68±0.03),两者表达差异具有统计学意义(P < 0.05,图 2)。
2.3 基因干扰后对KMLSCs中骨母特异性因子2的表达影响
为检测干扰组的骨母特异性因子2基因是否被干扰,我们利用qPCR进行检测,结果显示,干扰组细胞中骨母特异性因子2 mRNA表达显著低于未转染组和空载体组(P < 0.05,图 3A),Western blot进一步分析结果显示,干扰组蛋白表达量显著下降(P < 0.05),而空载体和未转染组的表达则差异无统计学意义(P>0.05,图 3B、C),结果表明骨母特异性因子2基因表达受到有效干扰。
2.4 沉默骨母特异性因子2基因后KMLSCs的增殖、凋亡以及细胞周期的变化
MTT检测结果显示,干扰组同空载体组和未转染组相比,0~48 h的光密度值差异无统计学意义(P>0.05),在72 h, 干扰组的值为(0.37±0.01),显著低于空载体组(0.69±0.03,P < 0.05)和未转染组(0.69±0.04,P < 0.05);在96 h,干扰组(0.57±0.01)显著低于空载体组(0.94±0.01,P < 0.05)和未转染组(0.95±0.01,P < 0.05),但各时相点,干扰组和空载体组光密度值均无明显差异(P>0.05)。FCM检测凋亡结果显示,干扰组细胞的凋亡率(10.63±0.15)%较未转染组(1.70±0.06)%和空载体组(2.82±0.03)%明显增加(P < 0.05)。未转染组和空载体组间差异无统计学意义(P>0.05,图 4);流式细胞仪分析结果显示,骨母特异性因子2表达受抑制后,细胞周期主要阻滞在G1期,且S期和G2期DNA含量明显降低(图 5)。
2.5 沉默骨母特异性因子2基因后LRP5表达降低
为观察骨母特异性因子2表达变化后是否会引起Wnt信号通路下游LRP5表达变化,我们采用细胞免疫荧光和Western blot检测LRP5的表达,结果显示,同空载体组和未转染组相比,干扰组LRP5的表达显著减弱(图 6、7)。
3 讨论
研究发现,KMLSCs与瘢痕疙瘩的发生、发展、转归消退存在一致性关系,KMLSCs是瘢痕疙瘩的主要细胞成分之一,对瘢痕疙瘩的形成具有重要调控作用[8]。为明确KMLSCs和SKPs中其表达情况是否与之一致,我们随即从瘢痕疙瘩及其同体正常皮肤组织中分离干细胞,并用细胞流式术进行分选,分选比例均超过94%,随后通过免疫细胞化学和Western blot观察检测KMLSCs和SKPs中骨母特异性因子2的表达情况。结果显示,KMLSCs中骨母特异性因子2明显高于SKPs。
骨母特异性因子2作为一种分泌性胞外基质蛋白,可能在肿瘤干细胞及其周围微环境中作为一个间质反应的识别元件发挥关键作用。研究认为,通过RNA干扰沉默骨母特异性因子2的表达可抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移。同时,骨母特异性因子2的内源性表达可促进胰腺癌细胞和肺腺癌细胞的增殖和侵袭力,而抵消骨母特异性因子2的表达后则可显著抑制小鼠乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在诸如终分化的心肌细胞和真皮成纤维细胞等良性细胞中,骨母特异性因子2同样展现出促生长的生物学活性[2, 12]。归因于骨母特异性因子2在肿瘤细胞增殖生长中的重要性,且本质上瘢痕疙瘩是一种增殖紊乱性疾病,研究骨母特异性因子2对KMLSCs的增殖作用具有重要意义。
为研究骨母特异性因子2对KMLSCs的增殖作用,本课题组采用慢病毒干扰系统,成功构建了可有效干扰骨母特异性因子2的基因表达载体,并转染KMLSCs,流式细胞术富集检测干扰效率,结果表明干扰率均超过93%。随后利用qPCR和Western blot检测干扰效果,结果显示,骨母特异性因子2基因受干扰后,骨母特异性因子2的表达显著降低。进一步以MTT评价细胞的增殖能力,结果发现,骨母特异性因子2低表达时,KMLSCs的增殖受到显著抑制,该结果提示骨母特异性因子2可能介导KMLSCs的增殖抑制而限制瘢痕疙瘩的浸润生长。最后,通过流式细胞分析术探讨骨母特异性因子2表达减低后对细胞凋亡和细胞周期的影响,结果显示,骨母特异性因子2的表达下调明显增强细胞凋亡,同时,细胞周期发生G1期阻滞, 阻碍G1期向S期转变。综合分析所得结果,由此可推测,瘢痕疙瘩KMLSCs中骨母特异性因子2表达异常增高后,导致细胞周期缩短,加快细胞增殖,减少细胞凋亡,不断补充损伤消耗和衰老凋亡的细胞,加重细胞的高增殖状态,促进胶原沉积,形成一个恶性循环,使瘢痕疙瘩的进展不断恶化。
研究认为,骨母特异性因子2调控细胞增殖和细胞周期主要是通过控制PI3K/Akt信号通路来介导,促进周期中G1/S的转换,增强细胞增殖,或是直接激活丝氨酸/苏氨酸激酶而影响细胞存活和增殖[6-7, 12]。骨母特异性因子2促进细胞增殖是一个极其复杂的过程,除了PI3K/Akt信号通路,还涉及多个包括P63、P57等在内的信号通路和信号分子[12, 15],Qu等[6]的研究认为,骨母特异性因子2对LSCs的增殖作用还与Wnt信号通路相关。同样,我们前期实验发现,骨母特异性因子2也可调控Wnt信号通路而加快瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,但是不同于前人研究的是,在该过程中发挥关键作用的是LRP5,此外,研究认为瘢痕疙瘩成纤维细胞来源于KMLSCs[13],故初步认为,在KMLSCs中,骨母特异性因子2表达变化引起的增殖活性改变可能也与LRP5有关。为验证该观点,采用细胞免疫荧光和Western blot检测骨母特异性因子2不同表达水平下LRP5的表达情况,结果表明,干扰组LRP5的表达显著减弱,而空载体组和未转染组的表达未见明显差异。这些都提示骨母特异性因子2可作用于LRP5调控Wnt信号通路的活性而介导细胞的增殖调控。
综上所述,本研究通过多组实验探讨了骨母特异性因子2对瘢痕疙瘩内KMLSCs的增殖调控作用,明确了骨母特异性因子2可介导细胞凋亡、周期进展以及Wnt信号通路而调控KMLSCs的增殖,充分说明骨母特异性因子2有望成为瘢痕疙瘩治疗的一个新可控靶点。本课题的研究成果为以后瘢痕疙瘩机制的研究提供了一个新方向,奠定了研究基础,但是关于骨母特异性因子2基因调控细胞增殖机制和与LRP5的相互作用模式需要进一步研究,这正是本课题的下一步计划,旨在明晰KMLSCs增殖在瘢痕疙瘩的浸润性生长中的新机制,为后续研究提供数据基础并为瘢痕疙瘩的干预提供新方向。
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