肺纤维化又称间质性肺炎，病理特点是肺实质细胞减少，结缔组织进行性增多，肺结构功能丧失，最终导致呼吸衰竭。近年来肺纤维化的发病率显著上升，引起广泛关注。其发病原因复杂，机制不明，尚缺乏有效的治疗药物。临床上主要以应用肾上腺皮质激素及免疫抑制药为主，而这种疗法常伴随严重的副反应并容易引起继发感染，所以寻找一种安全有效改善肺纤维化的药物亟须解决。
虾青素 (astaxanthin, AX) 亦称“虾黄素”，是一种抗氧化能力极强的脂溶性类胡萝卜素，全称3, 3′-二羟基-β, β′-胡萝卜素-4, 4′-二酮基，分子式为C40H52O4。AX广泛存在于自然界中，如虾、蟹、海藻及鸟类羽毛等。因其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及增强免疫力等多种药理作用，而被广泛应用于各种疾病的研究[1-2]。近年研究表明，AX可抑制肺纤维化，但其作用机制尚未完全清楚[3-6]。本研究旨在观察AX对大鼠肺纤维化的治疗效果，并初步探讨其作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试药与仪器羟脯氨酸检测试剂盒 (南京建成，A030-2)、大鼠TGF-β1检测试剂盒 (博士德，EK0514)、α-SMA (Abcam，ab5694)、p-Smad2(Abcam，188334)、p-Smad3(CST，9520)、Smad2/3(SANTA，sc-398844)、p-ERK1/2(CST，4370)、ERK1/2(CST，4695)、虾青素 (Astaxanthin，阿拉丁，纯度>98%，CAS：472-61-7)、盐酸博来霉素 (日本化药株式会社，规格15 mg/瓶，批号640412)、植物油。全波长酶标仪 (美国Thermo公司)、倒置显微镜 (日本Nikon公司)、凝胶成像系统 (美国BIO-RAD公司)。
1.1.2 实验动物由第三军医大学实验动物中心提供无病原体 (SPF) 级SD雄性大鼠[生产许可证号：SGXK (渝)2012-0003]，8~10周龄，体质量 (200±20) g，分笼饲养，自由饮水及进食。
1.2 方法 1.2.1 动物分组及肺纤维化模型的构建32只SD雄性大鼠采用随机数字表法分为4组：Sham组 (假手术组)、BLM组、AX组、AX+BLM组，每组8只。动物造模前一晚禁食，手术前2 h禁水。大鼠用1%戊巴比妥钠 (45 mg/kg) 腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，剪去颈部毛发，碘伏及乙醇消毒后逐层分离并暴露气管，1 mL注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，注入一定体积的博莱霉素生理盐水溶液 (5 mg/kg) (BLM组和AX+BLM组) 或生理盐水 (Sham组)，并继续注入0.1 mL的空气，然后立即将动物直立并旋转3 min，使药液在肺内均匀分布。造模第2天AX组及AX+BLM组灌服AX (2 mg/kg) 油溶液，BLM组给予等体积植物油，口服体积为1 mL/100 g大鼠体质量，Sham组给予正常饲养。
1.2.2 肺组织病理检测各组大鼠分别于给药14 d后取全肺，称重，按公式“肺系数=肺湿质量/体质量”计算肺系数。左下肺以4%多聚甲醛固定，常规病理学方法经脱水、包埋、切片，进行HE染色及Masson染色。肺炎症程度评分参照Szapiel等[7]方法，肺纤维化程度评分参照Ashcroft等[8]的方法进行。
1.2.3 肺组织羟脯胺酸检测采用碱水解法测肺组织样本中羟脯氨酸 (HYP) 含量，严格按照试剂盒说明书 (南京建成，A030-2) 操作：精确称取右肺组织80~100 mg，加入裂解液，沸水浴水解20 min，调pH至6.0~6.8，加活性炭离心，取1 mL上清液依次加反应试剂，水浴反应15 min，离心后取上清于550 nm处测定光密度值。
1.2.4 免疫组化检测切片常规脱蜡，抗原修复，滴加单克隆α-SMA抗体 (工作浓度1：80)，于4 ℃过夜孵育，DAB显色，苏木精复染，于显微镜下观察α-SMA表达情况。
1.2.5 酶联免疫夹心 (ELISA) 检测加样品和标准品，37 ℃反应90 min；加生物素标记抗体，37 ℃反应60 min；洗涤缓冲液洗涤3次；加亲和素-过氧化物酶复合物，37 ℃反应30 min；洗涤缓冲液洗涤5次；TMB显色液37 ℃反应30 min；加入TMB终止液，酶标仪测光密度值。
1.2.6 Western blot检测采用液氮研磨法提取肺组织蛋白，BCA法蛋白定量，沸水浴变性5 min，每份样品取30 μg上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后转移至PVDF膜上，5%BSA封闭2 h，加p-Smad2、p-Smad3、Smad2/3、p-ERK1/2、ERK1/2等单克隆一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗3次，辣根过氧化物酶标记的二抗 (1：5 000) 孵育2 h，PBST洗3次，ECL化学发光法检测目的条带，GAPDH为内参对照。
1.3 统计学分析采用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料以x±s表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，计数资料采用非参数秩和检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 肺组织病理观察肺部拍照结果显示：Sham组与AX组双肺呈粉红色，肺泡壁光滑有弹性；BLM组双肺呈暗红色，局部呈灰白色，有点状淤血斑点均匀分布；AX+BLM组情况较模型组有好转，双肺较红润，只见少量斑点出现 (图 1)。
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| 图 1 各组大鼠肺部大体、HE染色及Masson染色观察 |
肺系数结果显示：BLM组肺系数较Sham组及AX组明显升高，差异有统计学意义 (P＜0.01)；AX+BLM组肺系数较模型组有所降低，但无统计学差异 (表 1)。
| 组别 | 肺系数 (mg/g) | 炎症程度 | 纤维化程度 |
| Sham组 | 0.60±0.15 | 1.14±0.11 | 0.14±0.03 |
| AX组 | 0.47±0.03 | 1.10±0.10 | 0.10±0.01 |
| BLM组 | 1.19±0.37a | 3.60±0.42a | 7.14±0.24a |
| AX+BLM组 | 0.96±0.18 | 2.26±0.15b | 5.54±0.44b |
| a:P＜0.01, 与Sham组比较; b:P＜0.01, 与BLM组比较 | |||
HE结果显示：Sham组及AX组肺泡结构完整，肺泡壁薄，无充血及炎症细胞浸润；BLM组肺泡大量塌陷，肺泡间隔增厚，甚至融合为大肺泡，肺泡内有充血及炎症细胞浸润，与Sham组及AX组比较，其炎症程度显著升高 (P＜0.01)；AX+BLM组肺泡结构尚能保持，但局部可见肺泡间隔增厚，少量肺泡有融合，与模型组比较，其炎症程度明显降低 (P＜0.01，图 1，表 1)。
Masson结果显示：Sham组及AX组肺泡结构完整，肺泡间隙未见明显的蓝色胶原沉积；与Sham组及AX组相比，BLM组双肺大部分肺泡结构丧失，肺部明显实变，间质可见大量蓝色胶原沉积，其纤维化程度显著升高 (P＜0.01)；AX+BLM组肺泡间隔可见少量胶原沉积，其纤维化程度显著降低 (P＜0.01，图 1，表 1)。
2.2 AX降低肺组织中HYP含量羟脯氨酸的测定结果显示：与Sham组与AX组比较，BLM组HYP含量明显上升，差异有统计学意义 (P＜0.01)；与BLM组比较，AX+BLM组HYP含量明显降低，差异有统计学意义 (P＜0.01，图 2)。
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| a:P＜0.01, 与Sham组比较; b:P＜0.01, 与BLM组比较 图 2 各组大鼠肺组织HYP含量 (n=8，x±s) |
2.3 AX降低肺组织中α-SMA的表达
BLM组肺组织α-SMA表达 (棕黄色区域) 较Sham组及AX组明显增高，尤其在肺泡塌陷区域及肺间隔呈蜂窝状分布；AX+BLM组α-SMA表达较BLM组低，仅在肺泡隔增厚处有少量表达 (图 3)。
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| A:Sham组; B:AX组; C:BLM组; D:AX+BLM组 图 3 各组大鼠肺组织α-SMA蛋白表达 (×200) |
2.4 AX降低血清中TGF-β1水平
与Sham组和AX组比较，BLM组血清TGF-β1水平明显升高 (P＜0.01)，而AX+BLM组TGF-β1水平较模型组明显降低 (P＜0.05，图 4)。
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| a:P＜0.01, 与Sham组比较; b:P＜0.05, 与BLM组比较 图 4 各组大鼠血清TGF-β1表达水平 (n=8，x±s) |
2.5 AX降低肺组织Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化水平
实验结果显示：BLM组磷酸化Smad2(p-Smad2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2) 表达明显升高，而磷酸化Smad3(p-Smad3) 则变化不明显；与BLM组比较，AX+BLM组p-Smad2、p-Smad3、p-ERK1/2表达均降低 (图 5)。
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| 1:Sham组; 2:AX组; 3:BLM组; 4:AX+BLM组 图 5 Western blot检测大鼠肺组织Smad2/3与ERK1/2蛋白 |
3 讨论
肺纤维化的病理特点主要以肺成纤维细胞聚集及细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 进行性过度沉积取代正常肺组织结构主。博莱霉素致大鼠肺纤维化模型病理学改变与人类肺纤维化极为相似。有文献报道[8-9]，大鼠气管注射博来霉素造模后第14天即可形成肺纤维化。本实验造模14 d后肺组织病理结果观察到，BLM组肺系数升高 (P＜0.01)，肺部病变明显；HE结果显示肺泡结构塌陷，有充血及炎症，肺泡间隙有成纤维样细胞增生；肺组织Masson染色结果亦发现胶原蛋白沉积明显增多。同时羟脯氨酸 (HYP) 检测结果也显示BLM组HYP明显升高 (P＜0.01)，而HYP是胶原纤维代谢的重要指标，可间接反映组织胶原含量[10]。这些结果都表明BLM造模成功，而AX可明显减轻BLM引起的炎症反应，抑制胶原蛋白沉积及成纤维样细胞增生，同时降低肺组织中HYP含量 (P＜0.01)，表明AX能明显改善BLM所致肺纤维化。
肺纤维化病灶主要由肺成纤维细胞及肺肌成纤维细胞组成，而肺肌成纤维细胞是肺纤维化的主要效应细胞。α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 是肺肌成纤维细胞的标志性蛋白，可通过检测α-SMA的表达间接衡量肺肌成纤维细胞 (MFB) 的生成情况[11]。本实验观察到，与Sham组及AX组比较，BLM组肺组织α-SMA表达明显升高，而AX+BLM组α-SMA表达较BLM组明显降低。此结果也表明AX可降低肺纤维化程度。
以往对于AX抑制肺纤维化的作用主要是以其抗氧化作用为线索进行研究，并发现AX可促进肌成纤维细胞的凋亡来抑制肺纤维化的形成[2-5]。但是肺纤维化的发生机制十分复杂，是多种因素共同作用的结果，其中最关键的因素就是转化生长因子β1(TGF-β1)。它可促进成肺成纤维细胞过度增殖、分化并转化为肌成纤维细胞，促ECM分泌，最终导致肺间质胶原的过度沉积，肺结构实质化[12]。但是AX对TGF-β1的作用及其相关信号通路的研究还未见报道。研究报道TGF-β1诱导肺纤维化的发生与其下游的Smads蛋白家族信号通路相关。活性TGF-β1通过与其受体TβRⅡ、TβRI结合形成三聚体复合物，使磷酸化Smad2/3增多，磷酸化的Smad2/3与TβRI受体分离，即与Smad4结合形成复合体，携带信号从细胞质进入胞核激活转录，促进肺纤维化的发生[13]；同时，MAPKs丝裂原活化蛋白激酶家族的ERK1/2通路也是促纤维化发生的重要通路，被认为与Smads通路存在协同作用[14]。TGF-β1/Smad信号通路的激活过程受ERK通路的调控，Smad2/3含有ERK磷酸化的位点，可被ERK磷酸化，促进磷酸化的Smad2/3与Smad4的结合并转录。同时，ERK通路受Smads通路调控，促使ERK通路相关细胞因子或激酶的转录，从而激活ERK信号传导通路，使磷酸化的ERK1/2参与细胞的增殖、分化和转化，从而促进肺纤维化发生。本课题组通过检测肺纤维化大鼠血清TGF-β1水平，发现BLM诱导的肺纤维化TGF-β1水平明显升高 (P＜0.01)，表明BLM可能是通过引起TGF-β1水平升高，从而诱导肺纤维化的发生，而AX可明显降低TGF-β1水平 (P＜0.05)。同时本实验也检测了Smad2/3蛋白与ERK1/2蛋白，发现BLM组Smad2/3蛋白与ERK1/2蛋白的磷酸化水平明显升高，而AX+BLM组Smad2/3蛋白与ERK1/2蛋白磷酸化水平较BLM组明显降低。这些结果提示AX抑制肺纤维化的作用机制可能与其降低TGF-β1水平，从而下调Smads/ERK通路有关。
综上所述，AX能明显抑制肺纤维化，其作用机制可能与降低TGF-β1水平，从而下调Smads/ERK通路有关。本实验研究了AX对TGF-β1介导的Smads/ERK通路的影响，为肺纤维化的防治提供了理论依据。但本实验只进行了动物在体研究，后期还需进行细胞水平的研究予以论证。
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