2. 100037 北京,解放军海军总医院呼吸内科
2. Department of Respiratory Diseases,Navy General Hospital of PLA,Beijing, 100037, China
宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤之一,其发病率仅次于乳腺癌,位居第二。目前,经过手术、放疗、化疗虽能提高患者生存率,但肿瘤的转移和复发仍是导致患者死亡的主要原因。诱导肿瘤细胞凋亡并抑制其迁移是治疗肿瘤复发与转移的主要手段[1]。 Rab26是一种小G蛋白,属于Ras超家族,共有60多种家族成员,目前已知Ras家族蛋白中Rab5、Rab 8、Rab 21、Rab 25参 与了肿瘤的生长和增殖、侵袭和转移、细胞凋亡、肿瘤新生血管的形成[2],目前有关Rab26的报道主要集中在肌动蛋白的细胞骨架重组、细胞黏附、细胞运动、细胞周期进展、细胞分裂以及基因转录中[3-5],有关Rab26在宫颈癌中的作用尚不清楚。因此,本研究拟以含Rab26 cDNA全长或Rab26 siRNA序列的真核表达载体为介导,调控Rab26在HeLa细胞中的表达,观察Rab26对细胞凋亡及细胞迁移的影响,以期为宫颈癌的防治提供更多的实验室依据。
1 材料与方法 1.1 材料Rab26质粒由美国摄政大学吴光玉教授赠送(带红色荧光),1640完全培养基(美国HyClone公司),胰蛋白酶(美国HyClone公司),Opti-MEM(美国Invitrogen公司),转染试剂(罗氏公司),TRIzol总RNA提取试剂(北京天根生物技术公司),RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司),Rab26、GAPDH抗体(艾博抗贸易有限公司),质粒提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 Rab26过表达质粒和siRNA真核表达载体构建Rab26 cDNA全长的真核表达载体和Rab26 siRNA序列的真核表达载体由美国摄政大学吴光玉教授赠送,过表达组(Rab26-QL-DsRed,GTP活性,激活Rab26表达)质粒载体为pDsRed-monomer-C1载体(红色荧光)。Rab26 siRNA载体为pRNATU6.2,siRNA序列:GUGUUACCCAUGCCUACUATT/UAGUAGGCAUG-GGUAACACTT。
1.2.2 HeLa 细胞的培养HeLa细胞培养于含 10%标准胎牛血清的1640完全培养基中,培养条件为37 ℃、5% CO2细胞培养箱,实验选用对数生长期细胞。
1.2.3 细胞转染分为正常细胞组、空载体转染组、过表达组、siRNA组。转染前1 d将对数生长期的HeLa细胞分别接种于6孔板,每孔1×105个细胞。倒置显微镜下观察细胞生长情况,待培养板中细胞约60%融合时行细胞转染,转染前用PBS洗板1次,提前4 h更换为Opti-MEM培养基,用Opti-MEM 稀释质粒、siRNA 以及转染试剂,正常细胞组只加入等量培养液。转染6 h后换用含有10%标准胎牛血清的培养基,置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养48 h。
1.2.4 RT-PCR检测Rab26 mRNA的表达采用TRIzol总RNA提取试剂一步法进行细胞总RNA的提取,1%琼脂糖凝胶电泳检测证实无降解,核酸蛋白检测仪测定纯度并定量,光密度D(260)/D(280)比值均在1.80~2.00之间。根据RT-PCR 试剂盒进行逆转录以及扩增,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,2对引物同时扩增。总反应体系为50 μL,Premix Taq酶25 μL,模板RNA 3 μL,上下游引物各2 μL,灭菌DEPC水18 μL。Rab26上游引物: 5′-TCAAGGGCGGCAGCAGGA-3′,下游引物: 5′-GAGTACGCCCAGCACGAC-3′,扩增产物片段长度为298 bp。GAPDH上游引物: 5′-GCAAATTCCACGGCACAGTCA-3′,下游引物: 5′-TCACGCCACAGTTTCCCAGAG-3′,扩增产物片段长度为450 bp。扩增条件为:94 ℃ 4 min 预变性; 94 ℃ 变性30 s,62 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,30个循环;72 ℃后延伸5 min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,并采用自动电泳凝胶成像分析仪进行图像扫描和分析。计算目的基因与正常细胞组相对表达量(以百分率表示)。
1.2.5 Western blot 检测Rab26蛋白的表达4组细胞处理48 h后,收集各组细胞,加细胞蛋白提取液提取总蛋白,于4 ℃裂解20 min后,用细胞刮收集细胞于EP管中,4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min,取上清用于核酸蛋白检测仪测蛋白浓度,将蛋白浓度调成一致,加入5×Loading buffer后在沸水中煮8 min变性。配制15%分离胶、4%浓缩胶后进行SDS-PAGE凝胶电泳,80 V 30 min,120 V 1.5 h后,300 mA湿转50 min,将PVDF膜置于5%脱脂奶粉室温封闭 2 h,加入一抗稀释液稀释的Rab26一抗(1 ∶500),GAPDH一抗(1 ∶1 000)中4 ℃孵育过夜,次日用TBST漂洗5次,每次10 min,放入5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物,酶标记山羊抗兔IgG (1 ∶5 000) 抗体,室温孵育1 h,TBST漂洗5次,每次10 min,ECL化学发光法显色。计算目的蛋白相对表达量,方法同1.2.4。
1.2.6 流式细胞仪检测HeLa细胞的凋亡率0.25%的胰酶消化收集细胞后,室温2 000 r/min离 心10 min,弃上清,用预冷的PBS重悬细胞,2 000 r/min 离心10 min洗涤细胞1次,加300 μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞,再加5 μL的Annexin V-FITC混匀后室温避光孵育15 min,上机前加入5 μL的PI染色,室温避光孵育10 min,使用流式细胞仪检测。
1.2.7 划痕实验检测HeLa细胞迁移6孔板铺板,每孔3×105个细胞,待细胞融合率达100%后,用 200 μL tip头沿6孔板画直线。画好后用PBS洗涤1次,加入2 mL 10%FBS的1640完全培养基,倒置相差显微镜下照相;24 h后,更换培养基后照相,至48 h。
1.3 统计学处理使用Image-Pro Plus 10.0对图像进行分析; 使用SPSS 13.0统计软件和单因素方差分析对数据进行分析。α=0.05为检验水准。
2 结果 2.1 RT-PCR、Western blot分别检测Rab26 mRNA和蛋白的表达各组转染48 h后,检测各组Rab26 mRNA和蛋白 表达情况,发现过表达组Rab26 mRNA和蛋白表达水平较正常细胞组和空载体转染组显著升高(P<0.05);siRNA组Rab26 mRNA和蛋白表达水平较正常细胞组和空载体转染组明显降低(P<0.05),而正常细胞组与空载体转染组间差异无统计学意义(P>0.05,图 1、2)。
2.2 Rab26对HeLa细胞凋亡的影响
各组处理48 h后,过表达组凋亡率为(43.29±3.59)%,siRNA组凋亡率为(0.95±1.63)%,空载体转染组凋亡率为(1.21±1.08)%,正常细胞组凋亡率为(0.14±0.07)%。可见过表达组凋亡率显著高于正常细胞组和空载体转染组(P<0.01),siRNA组与正常细胞组和空载体转染组凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 Rab26对HeLa细胞迁移的影响在正常细胞组、空载体转染组、过表达组、siRNA 组处理24 h后,迁移速度分别为(0.43±0.02)、(0.39± 0.02)、(0.31±0.02)、(0.59±0.03)μm/min;处理48 h后各组迁移速度分别为(0.27±0.01)、(0.25±0.03)、(0.19±0.04)、(0.26±0.02)μm/min,过表达组细胞迁移速度显著低于正常细胞组和空载体转染组(P<0.01);siRNA组在24 h时迁移速度显著高于正常细胞组和空载体转染组(P<0.05),而正常细胞组和空载体转染比较,差异无统计学意义(P>0.05,图 3)。
3 讨论
目前临床上对晚期宫颈癌仍缺乏有效的治疗方法。Rab26是近年来新发现的Ras家族成员,表达具有组织特异性,在胰腺、腮腺等腺体组织有高表达,在海马组织、肾、肝等上皮细胞中均有表达,而在肝癌、结肠癌和淋巴瘤组织中几乎不表达。研究表明Rab26在宫颈癌HeLa细胞中亦有表达[6],但目前有关Rab26对宫颈癌细胞凋亡及迁移能力的调控作用尚不清楚[7]。本实验通过转染Rab26过表达质粒和siRNA到HeLa细胞中,发现过表达组Rab26 mRNA和蛋白表达增加,而siRNA组则降低,提示Rab26质粒和siRNA 在mRNA和蛋白水平均发挥了作用。
肿瘤的发生、发展是由于细胞增殖和凋亡失衡而导致细胞无限增殖所致,因此促进其凋亡以及抑制迁移成为评估抗癌药物作用能力的重要指标。近年来研究证明,Rab超家族与肿瘤细胞的迁移和侵袭有密切关系。目前已有研究报道,Rab家族中Rab5和Rab21参与肿瘤细胞内涵体的转运及胞内定位,并促使肿瘤的黏附和侵袭[8-10],而Rab25和Rab8与肿瘤细胞的迁移、侵袭有关[10-12]。本实验通过调控Rab26表达,发现Rab26过表达可有效促进HeLa细胞的凋亡,并抑制HeLa细胞迁移;siRNA沉默后促进细胞的迁移,而与正常细胞组、空载体转染组比较,差异无统计学意义。这表明Rab26作为Ras家族成员,可能通过促进HeLa细胞的凋亡,并抑制其迁移来调控肿瘤的发展。
本研究表明,Rab26可能通过调控HeLa细胞凋亡及迁移从而参与了宫颈癌的发生、发展,但是其具体的信号通路尚不清楚。文献[13]报道Rab26具有协调质膜转运功能,可通过物理作用调节α2肾上腺素受体从高尔基体到细胞膜的转运,进而调控细胞的生物学功能[14-15]。因此Rab26是否亦通过肾上腺素受体途径参与调控HeLa细胞凋亡及迁移,需要进一步研究。
[1] | Burke A J, Sullivan F J, Giles F J, et al. The yin and yang of nitric oxide in cancer progression[J]. Carcinogenesis,2013, 34 (3) : 503 –512. DOI:10.1093/carcin/bgt034 |
[2] | Wettschureck N, Offermanns S. Rho/Rho-kinase mediated signaling in physiology and pathophysiology[J]. J Mol Med,2002, 80 (10) : 629 –638. DOI:10.1007/s00109-002-0370-2 |
[3] | Smits K, Iannucci V, Stove V, et al. Rho GTPase Cdc42 is essential for human T-cell development[J]. Haematologica,2010, 95 (3) : 367 –375. DOI:10.3324/haematol.2009.006890 |
[4] | Fernández-Espartero C H, Ramel D, Farago M, et al. GTP exchange factor Vav regulates guided cell migration by coupling guidance receptor signalling to local Rac activation[J]. J Cell Sci,2013, 126 (Pt 10) : 2285 –2293. DOI:10.1242/jcs.124438 |
[5] | Jin R U, Mills J C. RAB26 coordinates lysosome traffic and mitochondrial localization[J]. J Cell Sci,2014, 127 (Pt 5) : 1018 –1032. DOI:10.1242/jcs.138776 |
[6] | 王健, 朱嗣博, 李鼎, 等. 一个新的人Rb26基因cDNA的克隆、表达及其增强细胞吞噬功能研究[J]. 生物化学与生物物理进展,2008, 35 (6) : 719 –723. DOI:10.3321/j.issn:1000-3282.2008.06.017 |
[7] | Wandinger-Ness, A, Rodman, J S, Romero, E G, et al. The Kidney Epithelial Rab26 GTPase Functions in Basolateral Recycling and is Altered in ADPKD[J]. FASEB J,2004, 18 (5) : 1027 –1027. |
[8] | Chen T, Han Y, Yang M, et al. Rab39, a novel Golgi-associated Rab GTPase from human dendritic cells involved in cellular endocytosis[J]. Biochem Biophys Res Commun,2003, 303 (4) : 1114 –1120. DOI:10.1016/s0006-291x(03)00482-0 |
[9] | Binotti B, Pavlos N J, Riedel D, et al. The GTPase Rab26 links synaptic vesicles to the autophagy pathway[J]. Elife,2015, 4 : e05597 . DOI:10.7554/eLife.05597 |
[10] | Wang J, Zhu S B, Li D, et al. A novel human Rab26 cDNA coloning, expression and its endocytosis enhancing function[J]. Progress in Biochemistry & Biophysics,2008, 35 (6) : 719 –723. |
[11] | Mai A, Veltel S, Pellinen T, et al. Competitive binding of Rab21 and p120RasGAP to integrins regulates receptor traffic and migration[J]. J Cell Biol,2011, 194 (2) : 291 –306. DOI:10.1083/jcb.201012126 |
[12] | Cao C, Lu C, Xu J, et al. Expression of Rab25 correlates with the invasion and metastasis of gastric cancer[J]. Chung-kuo yen cheng yen chiu,2013, 25 (2) : 192 –199. DOI:10.3978/j.issn.1000-9604.2013.03.01 |
[13] | Zilber Y, Babayeva S, Seo J H, et al. The PCP effector Fuzzy controls cilial assembly and signaling by recruiting Rab8 and Dishevelled to the primary cilium[J]. Mol Biol Cell,2013, 24 (5) : 555 –565. DOI:10.1091/mbc.E12-06-0437 |
[14] | Wang G, Wu G. Small GTPase regulation of GPCR anterograde trafficking[J]. Trends Pharmacol Sci,2012, 33 (1) : 28 –34. DOI:10.1016/j.tips.2011.09.002 |
[15] | 甘露, 丁振华. 多沙唑嗪通过转录因子激活蛋白-2α诱导HeLa细胞凋亡[J]. 第三军医大学学报,2009, 31 (24) : 2414 –2417. DOI:10.3321/j.issn:1000-5404.2009.24.002 |