喉癌(carcinoma of the larynx)是全球最常见的头颈部癌症之一,超过95%的喉癌属于鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma)。近年来,随着喉癌诊断和治疗水平的逐步提高,通过手术和放化疗可以改善病情,延长生存时间。进展期喉癌的5年生存率为30%~45%[1],并且主要死亡原因为肿瘤的侵袭和转移。目前已有大量研究表明亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA)在多种肿瘤中表达升高,包括肺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、多发性骨髓瘤、肝胆管细胞癌[2-6]等,并且与肿瘤的预后、侵袭转移密切相关。本研究通过沉默CypA建立喉鳞癌裸鼠移植瘤模型,探讨CypA与喉鳞癌生长及淋巴结转移的关系,为喉癌靶向治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料人喉鳞癌细胞株Hep2购自中科院上海细胞库。裸鼠(BALB/c-nu),SPF级,雌性,4周龄,平均体质量18.5 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司。CypA RNAi慢病毒载体的构建:CypA RNAi慢病毒表达载体及慢病毒阴性对照由上海吉凯基因科技有限公司包装合成,CypA RNA 干扰有效靶序列5′-GTCCCAAAGACAGCAGAAA-3′,病毒滴度为5×108 TU/mL;阴性对照插入序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,病毒滴度为1×109 TU/mL。主要试剂:特级胎牛血清(天津康源生物),TRIzol、逆转录试剂盒(TaKaRa公司),兔抗CypA多克隆抗体(ab41684)、兔抗CD147单克隆抗体[EPR4052](ab108317)、兔抗MMP9多克隆抗体(ab38898)、GAPDH[EPR16891](ab181602)均购自美国Abcam公司,免疫组化试剂盒(中杉金桥 PV9001),二抗(山羊抗兔IgG,博士德)。
1.2 方法 1.2.1 CypA RNAi慢病毒颗粒感染hep2细胞将Hep2细胞接种于6孔培养板,每孔细胞数1×105,培养24 h,使细胞融合度达到30%左右。慢病毒颗粒感染Hep2细胞于6孔培养板,感染复数(MOI)为20。分为3组:①空白对照组:未感染病毒的Hep2细胞;②阴性对照组:阴性对照病毒转染Hep2细胞;③基因沉默组:CypA RNAi慢病毒转染Hep2细胞。每组设3个复孔。37 ℃,5% CO2培养箱内培养72 h后加1.5 μg/mL 的嘌呤霉素筛选细胞稳定株,筛选时间为3 d。流式细胞仪测细胞转染率达85%以上。扩大培养转染细胞。
1.2.2 构建裸鼠移植瘤模型取对数生长期肿瘤细胞,0.25%胰酶消化成单个细胞,加入10%胎牛血清培养基终止消化并离心,去上清,再加入血清培养基重悬细胞并计数,离心后去上清加入无血清培养基1640调节细胞数为1×108/mL,备用。裸鼠完全随机分为3个组:空白对照组、阴性对照组、基因沉默组,每组5只。在裸鼠左后足垫皮下注射50 μL肿瘤细胞悬液。每周观察裸鼠足垫皮下成瘤情况及淋巴结转移情况,约1周后成瘤,游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤体积:V(mm3)=(1/2)ab2,a为肿瘤长径,b为肿瘤短径。总观察时间6周。
1.2.3 免疫组织化学法(PV二步法)检测肿瘤组织中CypA、CD147、MMP-9蛋白的表达4%多聚甲醛固定肿瘤组织,石蜡包埋切片,3% H2O2阻断组织内源性过氧化氢酶,枸橼酸盐缓冲液高温修复抗原,分别滴加兔抗CypA多克隆抗体(1 :100)、兔抗CD147单克隆抗体(1 :100),兔抗MMP-9多克隆抗体(1 :50) 4 ℃孵育过夜,依次滴加免疫组化试剂盒中试剂一(聚合酶辅助剂)、试剂二(辣根酶标记抗兔Ig聚合物),滴加试剂一、试剂二后均在37 ℃孵育30 min。DAB显色,苏木精染核,盐酸分化,碳酸锂返蓝,中性树胶封片。
1.2.4 实时荧光定量PCR法(RT-PCR)将适量组织置于组织匀浆管中,加入1.5 mL TRIzol冰上充分匀浆,根据TRIzol说明书提取总RNA,加40 μL DEPC水溶解RNA,测定RNA浓度后,根据逆转录试剂盒说 明书将RNA逆转录为cDNA。逆转录反应体系20 μL,反应条件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ 5 min。产物置于-20 ℃保存。CypA、CD147、MMP-9、β-actin引物由TaKaRa公司设计合成。引物序列见表 1。RT-PCR反应体系10 μL:冰上依次加样SYBR Premix EX TaqⅡ 5 μL,PCR Forward Primer 0.4 μL,PCR Reverse Primer 0.4 μL,CDNA 1 μL,DEPC 3.2 μL;反应条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,循环39个周期,建立PCR产物的熔解曲线,扩增反应结束后继续从60 ℃缓慢加热到95 ℃(每5秒升高1 ℃)。用CFX 96软件分析CypA、CD147、MMP-9 mRNA相对表达量。
引物名称 | 引物序列(5′→3′) | 片段长度 |
CypA | 上游:TCAACCCCACCGTGTTCTTC | 198 bp |
下游:TAAAGTCACCACCCTGGCACA | ||
CD147 | 上游:GCACCATCCAAACCTCTGTCC | 173 bp |
下游:GCGGTCATCTGCGTCCACTAT | ||
MMP-9 | 上游:CCAAAGACCTGAAAACCTCCAA | 103 bp |
下游:TGCTTCTCTCCCATCATCTGG | ||
β-actin | 上游:ACATTACTGCTCTGGCTCCTAGC | 147 bp |
下游:ACTCATCGTACTCCTGCTTGCT |
1.2.5 Western blot检测
肿瘤组织称质量,根据肿瘤组织质量(mg)、RIPA 裂解液(μL)、PMSF(μL)比例1 :10 :0.1在组织中加入RIPA、PMSF,超声匀浆器冰上匀浆至无明显组织碎块,冰上静置30 min,使其充分裂解。4 ℃,12 000 r/min离心15 min。取上清液,根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。根据蛋白体积、蛋白上样缓冲液体积比4 :1在蛋白中加入蛋白上样缓冲液,100 ℃水浴变性10 min。SDS-PAGE胶(12%分离胶,5%浓缩胶)电泳分离蛋白,并转至PVDF膜上。用TBST、封闭蛋白粉配置的5%封闭液封闭PVDF膜2 h,分别加入兔抗CypA多克隆抗体(1 :500),兔抗CD147单克隆抗体(1 :1 000),兔抗MMP-9多克隆抗体(1 :1 000),GAPDH(1 :5 000) 4 ℃孵育过夜,山羊二抗(1 :2 000)37 ℃孵育1 h,每次孵育后加入TBST洗膜3次,每次10 min,膜上加入化学发光试剂后在凝胶成像系统中曝光成像,用Fusion软件分析光密度,计算CypA、CD147、MMP-9蛋白条带与内参GAPDH条带的光密度比值。
1.3 统计学方法采用GraphPad Prism 5.01软件进行统计作图,对数据进行方差分析和两两比较的配对t检验,检验水准为α=0.05。
2 结果 2.1 细胞转染率用流式细胞仪测细胞转染率,空白对照组为 0.94%,阴性对照组为95.31%,基因沉默组为86.1%。
2.2 肿瘤生长与淋巴结转移情况裸鼠足垫注入肿瘤细胞第4天肿瘤开始形成,成瘤率100%。接种细胞成瘤后,每周测量肿瘤体积大小并观察淋巴结转移情况。肿瘤体积随时间推移而逐渐变大,空白对照组及阴性对照组肿瘤生长速度较基因沉默组快,肿瘤体积较基因沉默组大(P<0.05)。肿瘤生长曲线如图 1。淋巴结转移情况:空白对照组及阴性对照组在接种细胞2周后同侧腹股沟有转移淋巴结,基因沉默组在接种细胞3周后发现转移淋巴结,均有米粒大小,质韧,有粘连,活动度差。空白对照组及阴性对照组接种细胞5周后淋巴结增至绿豆大小,未见肝、肺等远处转移。
2.3 病理组织学观察
肿瘤组织病理连续切片苏木精-伊红染色表现为中分化鳞状细胞癌,细胞排列紊乱,有坏死,细胞核大、多,形状各异,深染,核分裂相多见,形成椭圆形大小不一的癌巢,呈弥漫性生长(图 2A)。淋巴结组织病理连续切片苏木精-伊红染色表现为副皮质区细胞异型性大,细胞核深染,核形态多样,呈弥漫性分布,淋巴小结结构模糊,与周围的副皮质区融合(图 2B)。
肿瘤组织中CypA主要表达在细胞质,呈棕黄色颗粒;CD47主要表达在细胞膜,呈棕黄色环状;MMP-9主要表达在癌巢之间的间质部,呈棕色颗粒。见图 3。
2.4 RT-PCR检测
在肿瘤组织中CypA、CD147、MMP-9 mRNA的表达水平,与空白对照组及阴性对照组比较,基因沉默组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见图 4。
2.5 Western blot 检测
基因沉默组CypA、CD147、MMP-9蛋白在肿瘤组织中的相对表达量较空白对照组及阴性对照组蛋白明显降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05,图 5)。
3 讨论
肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤发生发展过程中的重要特点,是影响肿瘤预后的重要因素,而且其过程复杂,包括细胞分化和肿瘤生长,肿瘤血管和淋巴管发生,肿瘤细胞进入血液循环,侵袭、附着到靶器官并开始增殖[7]。研究证实淋巴结转移是喉癌最常见的转移途径,颈部淋巴结转移是喉癌转移的早期事件和独立危险因素,是影响预后的重要因素[8-9]。
CypA于1984年第一次从牛胸腺中提纯,并且被证实是免疫抑制剂环孢菌素A(Cyclosporin A,CsA)的主要细胞内受体[10-11]。CypA基因位于7号染色体,另外有4个假基因分别位于3、10、14、18号染色体。相对分子质量为18×103。CypA具有肽脯氨基酸顺反异构酶活性。目前研究表明CypA在多种疾病中发挥重要作用,如病毒感染、心血管疾病、风湿性关节炎、脓毒症、哮喘、肿瘤等[12]。CypA已经成为肿瘤的研究热点,在多种肿瘤中高表达,但是目前对CypA与喉癌关系的研究较少。本课题组前期通过比较蛋白质组学发现CypA在喉癌组织中的表达较正常癌旁组织明显升高[13],推断其可能与喉癌的发生或发展存在密切联系;还通过体外实验证实沉默CypA基因能够抑制Hep2细胞的增殖、迁移、侵袭能力及致瘤性。
细胞外基质金属蛋白酶(MMPs)诱导因子(EMMPRIN、CD147)是CypA的受体,CypA可以调节其表达水平。在多发性骨髓瘤中,上调CypA的表达水平,CD147的表达也相应增加,而且CypA与CD147结合形成复合体能促进肿瘤细胞的增殖和归巢[4]。对非小细胞型肺癌、肝胆管细胞癌等研究发现,CypA能通过激活MAPK通路促进肿瘤的增殖,并且通过CypA与CD147结合发挥其功能,同时还促进肿瘤侵袭与转移[2-3]。目前已有研究表明,抗CD147单克隆抗体作用于头颈恶性肿瘤模型,可以阻止肿瘤的侵袭与转 移[14-16]。CypA与CD147的配体受体结合效应,能够诱导MMPs的表达并激活其效应,尤其是MMP-9[17-19]。MMPs能 够降解纤维蛋白和多种胶原蛋白,破坏细胞外基质结构,因此为肿瘤细胞的侵袭和转移提供了条件。在多种肿瘤中都发现MMPs,尤其是MMP-9有高表达,并且其表达水平与CypA、CD147密切相关。
本实验通过RNA干扰技术,构建干扰CypA表达的慢病毒载体,沉默CypA基因,使CypA在RNA水平和蛋白水平表达都明显下降,同时在建立的裸鼠移植瘤模型有效地抑制肿瘤的生长,延缓肿瘤转移的时间。而且与肿瘤增殖、转移相关的CD147和MMP-9的表达明显降低,说明在喉鳞状细胞癌中CypA通过调节CD147和MMP-9的表达水平促进肿瘤的生长和转移,这与在其他恶性肿瘤中CypA的效应一致,但其具体机制需要进一步研究。
[1] | Szabó B, Nelhubel G A, Kárpáti A, et al. Clinical significance of genetic alterations and expression of epidermal growth factor receptor(EGFR) in head and neck squamous cell carcinomas[J]. Oral Oncol,2011, 47 (6) : 487 –496. DOI:10.1016/j.oraloncology.2011.03.020 |
[2] | Qian Z, Zhao X, Jiang M, et al. Downregulation of cyclophilin A by siRNA diminishes non-small cell lung cancer cell growth and metastasis via the regulation of matrix metallopeptidase 9[J]. BMC Cancer,2012, 12 : 442 . DOI:10.1186/1471-2407-12-442 |
[3] | Obchoei S, Sawanyawisuth K, Wongkham C, et al. Secreted cyclophilin A mediates G1/S phase transition of cholangiocarcinoma cells via CD147/ERK1/2 pathway[J]. Tumour Biol,2015, 36 (2) : 849 –859. DOI:10.1007/s13277-014-2691-5 |
[4] | Zhu D, Wang Z, Zhao J J, et al. The Cyclophilin A CD147 complex promotes the proliferation and homing of multiple myeloma cells[J]. Nat Med,2015, 21 (6) : 572 –580. DOI:10.1038/nm.3867 |
[5] | Han W, Soltani K, Ming M, et al. Deregulation of XPC and CypA by cyclosporin A: an immunosuppression-independent mechanism of skin carcinogenesis[J]. Cancer Prev Res (Phila),2012, 5 (9) : 1155 –1162. DOI:10.1158/1940-6207.CAPR-12-0185-T |
[6] | Li Z, Min W, Gou J. Knockdown of cyclophilin A reverses paclitaxel resistance in human endometrial cancer cells via suppression of MAPK kinase pathways[J]. Cancer Chemother Pharmacol,2013, 72 (5) : 1001 –1011. DOI:10.1007/s00280-013-2285-8 |
[7] | León X, Bothe C, García J, et al. Expression of IL-1ɑ correlates with distant metastasis in patients with head and neck Squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget,2015, 6 (35) : 37398 –37409. DOI:10.18632/oncotarget.6054 |
[8] | Zhang S Y, Lu Z M, Luo X N, et al. Retrospective analysis of prognostic factors in 205 patients with Laryngeal squamous cell carcinoma who underwent surgical treatment[J]. PLoS One,2013, 8 (4) : e60157 . DOI:10.1371/journal.pone.0060157 |
[9] | Cho S, Kang S G, Tae B S, et al. Influence of nonregional lymph node metastasis as a prognostic factor in metastatic prostate Cancer patients[J]. Korean J Urol,2012, 53 (10) : 673 –679. DOI:10.4111/kju.2012.53.10.673 |
[10] | Dawer F U, Tu J, Khattak M N, et al. CyclophilinA: A key Factor in Virus Replication and Potential Target for Anti-viral Therapy[J]. Curr lssues Mol Biol,2016, 21 : 1 –20. |
[11] | Saleh T, Jarkowski W, Sriram G, et al. CyclophilinA promotes cell migration via the Abl-Crk signaling pathway[J]. Nat Chem Biol,2016, 12 (2) : 117 –123. DOI:10.1038/nchembio.1981 |
[12] | Nigro P, Pompilio G, Capogrossi M C. Cyclophilin A: a key player for human disease[J]. Cell Death Dis,2013, 4 : e888 . DOI:10.1038/cddis.2013.410 |
[13] | 冯明亮, 周建荣, 魏莲枝, 等. MRP8和亲环素A在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2011, 25 (18) : 834 –836. |
[14] | Dean N, Helman E, Aldridge J, et al. Anti-EMMPRIN treatment of HNSCC in an ex vivo model[J]. Laryngoscope,2010, 120 (Suppl 4) : S146 . DOI:10.1002/lary.21610 |
[15] | Dean N R, Knowles J A, Helman E E, et al. Anti-EMMPRIN antibody treatment of head and neck squamous cell carcinoma in an ex-vivo model[J]. Anticancer Drugs,2010, 21 (9) : 861 –867. DOI:10.1097/CAD.0b013e32833d1a11 |
[16] | Walter M, Simanovich E, Brod V, et al. An eiptope-specific novel anti-EMMPRIN polyclonal antibody inhibits tumor progression[J]. Oncoimmunology,2015, 5 (2) : e1078056 . DOI:10.1080/2162402X.2015.1078056 |
[17] | Kumari S, Roy S, Singh P, et al. Cyclophilins: proteins in search of function[J]. Plant signal Behav,2013, 8 (1) : e22734 . DOI:10.4161/psb.22734 |
[18] | Bahmed K, Henry C, Holliday M, et al. Extracellular Cyclophilin-A stimulates ERK1/2 phosphorylation in a cell-dependent manner but broadly stimulates nuclear factor Kappa-B[J]. Cancer cell Int,2012, 12 : 19 . DOI:10.1186/1475-2867-12-19 |
[19] | Frederick J W, Sweeny L, Hartman Y, et al. Epidermal growth factor receptor inhibition by anti-CD147 therapy in cutaneous squamous cell carcinoma[J]. Head Neck,2016, 38 (2) : 247 –252. DOI:10.1002/hed.23885 |