盆腔炎性疾病(pelvic inflammatory disease，PID)是女性上生殖道及其周围邻近组织发生的炎症，简称盆腔炎，主要包括盆腔腹膜炎、子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔结缔组织炎等，是育龄期妇女常见及多发的妇科疾病^[1]。近年来受药物及人流等多种因素的影响，盆腔炎发病率呈显著升高趋势，严重影响妇女生殖健康^[2]。盆腔炎一般较复杂，多为混合感染，临床上以抗生素治疗为主，常用喹诺酮类中的左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)^[3-4]。但慢性盆腔炎疗程较长，长期使用抗生素易导致菌群失调或耐药的产生，使治疗效果减弱，易复发。近年有报道采用中西医结合，在应用抗生素的基础上联合使用含红花的中药复方或红花注射液，通过活血化瘀、清热解毒，增强临床效果，同时无不良反应，治愈率显著增高，患者生活质量得到改善，具有较好的临床应用价值^[5-7]。

但是联合使用红花注射液是否影响左氧氟沙星在血液中的浓度及其在盆腔组织的分布尚少见相关报道，所以我们认为有必要从药动学方面探讨联合使用红花注射液对左氧氟沙星体内代谢的影响，为临床上红花与左氧氟沙星联用治疗盆腔炎提供一定的用药依据。本研究首先建立大鼠细菌性盆腔炎模型，用高效液相色谱法(high performance liquid chromate-graphy，HPLC)检测给药后模型大鼠子宫组织中左氧氟沙星的浓度，观察联合使用红花注射液对细菌致盆腔炎模型大鼠子宫组织中左氧氟沙星药物代谢动力学方面的影响。

1 材料与方法 1.1 仪器

高效液相色谱仪(LC-20系列，日本岛津，含双泵、梯度洗脱、可调波长紫外检测器，自动进样系统和Labsolutions工作站)、高速分散器(GF-1型，江苏其林医用仪器厂)、高速台式离心机(B160A型，白洋离心机厂)、SK-1快速混匀器(江苏中大仪器厂)、电子天平(BP61型，德国Sartorius公司)。

1.2 药品和试剂

乳酸左氧氟沙星片(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：20140214，规格：0.2 g)、红花注射液(山西华卫药业有限公司，批号：13112703，规格：10 mL)、左氧氟沙星标准对照品(中国药品生物制品检定出品，批号：130455-200604，纯度：97.3%)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CF，内标，重庆药友制药有限公司提供，批号：060402，纯度：98.16%)、二氯甲烷(安徽时联化工有限公司，批号6603BT03，色谱纯)、甲醇(重庆川东化工有限公司，批号：20131201，分析纯)。

1.3 动物

清洁级健康SD雌性大鼠100只，体质量180～220 g，由重庆医科大学动物实验中心提供，动物合格证号为SCXK(渝)2012-0001。

1.4 细菌

大肠埃希菌标准菌种，由重庆医科大学附属第一医院传染科实验室提供，使用时用生理盐水配制成浓度为1.8×10⁷ cfu/mL混悬液。

1.5 慢性盆腔炎模型制备

参照文献[8]，取清洁级SD雌性大鼠100只，禁食不禁水12 h。3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉麻醉，待麻醉起效后，用橡皮筋牵拉四肢，将大鼠固定于操作台上，剪去下腹正中皮毛，酒精棉球消毒，铺消毒巾，按无菌手术操作，于下腹部正中切口2 cm左右，暴露子宫，用注射器针头，于子宫分岔处进针入子宫腔内，机械损伤子宫内膜组织，随后将0.1 mL大肠埃希菌菌液(1.8×10⁷ cfu/mL)多点注入。随后缝合腹壁肌肉皮肤，碘伏消毒伤口后将大鼠放回鼠笼，分笼喂养，自由进食及饮水。

1.6 动物分组及给药

造模成功后，将大鼠按照完全随机分组法分为实验组(联合用药组)和对照组(单用左氧氟沙星)，每组48只。于造模第4天开始，实验组动物肌注红花注射液(0.8 mL/kg)，对照组注射相同体积的生理盐水，连续注射3 d后，两组动物均灌服相同剂量的乳酸左氧氟沙星混悬液(80 mg/kg)。

1.7 标本采集

于给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、8、12 h，分别从两组中取6只大鼠处死，采集血液和子宫组织。血样经5 000 r/min离心5 min取血浆；子宫组织经滤纸吸干，称质量，剪碎放入试管，加生理盐水2 mL，制成组织匀浆；血浆和组织匀浆均置于-20 ℃低温保存备用。

1.8 色谱条件

色谱柱为Amethyst C18-Ⅱ(100 mm×4.6 mm，粒径5 μm)，预柱为Dikma EasyⅡGuard C18 Kit(8 mm× 4 mm)；固定进样环100 μL；流动相：甲醇(0.008 mol/L) ： 磷酸盐缓冲液(0.5 mol/L) ：四丁基溴化铵(体积比)=25 ：75 ：4，流速0.4 mL/min；紫外检测波长：290 nm；柱温：40 ℃。

1.9 样品处理

取血浆或子宫组织匀浆500 μL，加入内标CF 30 μL(33.6 μg/mL)，涡旋10 s混匀并加入二氯甲烷4 mL，涡旋提取1 min后经3 000 r/min离心3 min，静置分层，取下层有机相3.5 mL，于50 ℃水浴氮气吹干，加入流动相100 μL复溶，震荡混匀后进样40 μL。

1.10 统计学分析

采用DAS 2统计软件计算药动学参数，SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料数据以x±s表示，组间比较行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 色谱行为

在本实验的色谱条件下，血浆、子宫组织匀浆中左氧氟沙星与内标CF二者峰形良好，且均不受内源性物质干扰，左氧氟沙星保留时间在5.5 min左右，内标CF在7.8 min左右，药物及内标CF达到基线分离，分离度良好(R>1.5，图 1)。

2.2 标准曲线、线性关系、最低定量浓度

在空白血浆和空白子宫组织匀浆液中添加左氧氟沙星使其浓度分别为19.008、10.56、5.28、2.64、1.32、0.66、0.33、0.165 μg/mL和8.32、4.16、2.08、1.04、0.52、0.26、0.13、0.065 μg/mL，按1.9项下操作，测定后所得数据经线性回归，分别求出血浆、子宫组织匀浆中左氧氟沙星的标准曲线方程。

血浆左氧氟沙星与内标CF峰面积之比(y₁)与左氧氟沙星浓度(x₁)的关系为：y₁=3.320x₁-0.124，在 0.165～19.008 μg/mL范围内线性关系良好，r=0.999 5； 最低定量浓度0.165 μg/mL(n=5,RSD=10.91%)。

子宫组织匀浆左氧氟沙星与内标CF峰面积之比(y₂)与左氧氟沙星浓度(x₂)的关系为：y₂=3.007x₂-0.256，在0.065～8.320 μg/mL范围内线性关系良好，r=0.999 5；最低定量浓度0.065 μg/mL (n=5，RSD= 9.78%)。

2.3 检测限与定量限

在空白血浆和空白子宫组织匀浆液中分别添加左氧氟沙星使其浓度约为1.0 μg/mL，按1.9项下操作测定，记录峰面积，以信噪比为3 ：1和10 ：1分别计算二者的检测限和定量限。测得血浆和子宫组织中左氧氟沙星的检测限分别为0.05、0.02 μg/mL，定量限分别为0.165、0.065 μg/mL。

2.4 回收率与精密度

取高、中、低浓度和最低定量浓度的血浆和子宫组织匀浆样本(血浆：10.56、2.64、0.33、0.165 μg/mL，子宫组织：4.16、1.04、0.26、0.065 μg/mL)，每个浓度各5份，按照1.9项下操作测定，考察本法在测定血浆和子宫组织匀浆中左氧氟沙星含量时的回收率和日内、日间精密度(即相对标准差，relative standard deviation，RSD)。如表 1所示，本法回收率和日内、日间精密度均符合测定要求。

2.5 冻融稳定性

将高、中、低3个浓度的血浆(10.56、2.64、0.33 μg/mL)和子宫组织匀浆(4.16、1.04、0.26 μg/mL)样品，经反复冷冻、融化，再按1.9样品处理操作，分别测定3次，考察其冻融稳定性。如表 2所示，血浆及子宫组织匀浆样品经反复冻融后测定左氧氟沙星的药物浓度稳定性良好。

2.6 萃取回收率

取高、中、低3种浓度的血浆(10.56、2.64、0.33 μg/mL)和子宫组织匀浆(4.16、1.04、0.26 μg/mL)样品，按1.9项下操作测定，记录峰面积，作为萃取后的数据。另分别取以上浓度(10.56、2.64、0.33 g/mL和4.16、1.04、0.26 g/mL)沙星甲醇液500 μL，从1.9项下“氮气吹干”开始操作，进样后记录峰面积，作为未萃取的数据。以萃取后的峰面积/未萃取的峰面积作为萃取回收率。二氯甲烷对高、 中、低浓度的左氧 氟沙星血浆样品的萃取回收率分别为(97.44±3.43)%、 (95.03±4.34)%、(97.36±3.41)%；二氯甲烷对高、中、低浓度的左氧氟沙星子宫组织样品的萃取回收率分别为 (96.66±4.50)%、(98.28±7.63)%、(100.62± 6.24)%。

2.7 药-时曲线

实验组和对照组大鼠二者血浆及子宫组织匀浆按1.9项下操作，记录峰面积之比。将左氧氟沙星与内标CF峰面积之比代入标准曲线方程，求得血浆中左氧氟沙星的浓度，同时按所称取子宫的质量换算出子宫组织中左氧氟沙星的浓度，分别绘制左氧氟沙星的浓度-时间曲线。大鼠口服左氧氟沙星后，血液中药物浓度不断增高，在约1.5 h时，血液中浓度最高，随着药物在体内的消除，血药浓度逐渐下降。实验组与对照组血浆中的药-时曲线相似(图 2A)。子宫组织中左氧氟沙星的浓度变化趋势与血液中的同步，但两组之间药-时曲线有差异，实验组药-时曲线下面积大于对照组(图 2B，表 3)。

2.8 药代动力学参数

实验组和对照组大鼠的血浆、子宫组织中左氧氟沙星的浓度-时间数据采用计算机DAS 2软件程序自动拟合，结果表明口服左氧氟沙星后两组血浆及子宫组织中左氧氟沙星的药-时曲线均符合药动学二室模型。主要的药代动力学参数见表 3：两组间血浆中左氧氟沙星的药代动力学参数差异无统计学意义(P＞0.05)；而子宫组织中左氧氟沙星的药代动力学参数如达峰浓度(C_max)、药物清除率(CL)及药-时曲线下面积(AUC_0→t)差异均有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

对左氧氟沙星体内浓度的测定可采用微生物法、沉淀法等多种方法，但均存在专属性不高、误差大等弊端。本研究采用的HPLC法十分适合对临床生物样品中药物浓度的测定，同时与其他研究中的HPLC法相比，本研究采用有机溶剂二氯甲烷从生物样品中萃取左氧氟沙星，操作简单，提取率高；流动相选择上，以低浓度甲醇和高浓度磷酸盐缓冲液配以一定量的离子极化剂四丁基溴化铵，成功避开样品中杂峰对药物峰的影响，使药物与内标CF分离完全，且峰形良好。本研究中采用的HPLC法，经本实验室长期考证，专属性强，测定准确，方法简单易操作，且已被用于多种其他生物样品中左氧氟沙星的测定^[9-12]。

盆腔炎是妇科常见病，外源性病原体包括淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及支原体等；内源性病原体为来自寄居于阴道内的菌群，主要包括需氧菌(葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌等)及厌氧菌(消化链球菌、消化球菌及脆弱类杆菌等)^[13]；盆腔炎常常为混合感染，故临床治疗多选用抗菌谱广、不良反应少、安全性良好的氟喹诺 酮类药物，常用左氧氟沙星。左氧氟沙星是氧氟沙星的左旋体，其作用机制为通过作用于拓扑异构酶抑制细菌DNA的复制。药动学方面，左氧氟沙星生物利用度极高，口服可达90%以上，吸收快而迅速，组织渗透性强，在血液及组织中浓度均较高，适用于敏感菌引起的轻、中度泌尿生殖系统感染，尤其是盆腔炎感染^[14]。

红花注射液是以菊科植物红花为主要原料，经提取精制而成的中药注射液，主要有效成分是黄酮类的红花黄色素和红花苷等，具有广泛的药理活性，包括抗炎镇痛、调节免疫等，已被广泛运用于临床^[15]。尤其是在慢性盆腔炎、盆腔淤血综合征、痛经、女性乳腺增生等妇科疾病方面，疗效确切，安全性高^[16]。

采用左氧氟沙星联合红花注射液治疗盆腔炎具有一定的临床意义，但联合用药后左氧氟沙星在体内的浓度是否增加与治疗效果及不良反应的发生有密切关系，因此从药动学方面探讨联合用药后红花注射液对左氧氟沙星的影响存在必要性。本研究以大鼠细菌性盆腔炎实验模型为对象，用HPLC法检测其血液及盆腔组织中左氧氟沙星的浓度，探讨联合用药对模型大鼠盆腔组织中左氧氟沙星药物代谢动力学的影响。结果显示，红花注射液与左氧氟沙星联合后，红花注射液可明显提高左氧氟沙星在模型大鼠子宫中的药物浓度，但并不影响其在血液中的浓度；同时，联用红花注射液不影响左氧氟沙星在血液中的药动学参数，但红花注射液可明显改变左氧氟沙星在子宫组织的药动学参数，如达峰浓度、药物清除率及药-时曲线下面积。提示红花注射液可通过增加左氧氟沙星在盆腔炎大鼠子宫组织中浓度，从而达到提高药效的目的。原因可 能是发生盆腔炎时，盆腔血液循环差，药物在盆腔内较难达到有效浓度，红花通过扩血管，增加血流量，改善微循环，进而使盆腔组织血液中药物浓度更高，药物到达组织的量相对增多；另外盆腔内局部病变可导致周围结缔组织增生粘连，形成纤维化炎性包块，阻碍药物进入组织，影响药效发挥，红花具有活血散结、清热解毒的疗效，能改善机体内环境，增强巨噬细胞吞噬功能，减少附件粘连、肿胀，消除炎症，恢复组织正常生理功能，使药物能够更快地从血液中转运至组织^{[7, 17-18]}。

红花注射液可明显提高左氧氟沙星在模型大鼠子宫中的药物浓度，提示红花注射液与左氧氟沙星联合应用于盆腔炎的治疗有重要的临床意义。本研究为盆腔炎的联合用药从药动学角度做了初步的探索，可为临床用药提供理论支持。