前列腺癌为全球男性发病率第二的肿瘤，2012年前列腺癌新发病例1 100 000例，占男性全部癌症患者的15%[1]。据2015年数据统计，我国前列腺癌发病率2005-2011年环比上升4.7%；致死率2000-2011年环比上升5.5%[2]。前列腺癌是激素依赖性肿瘤，激素治疗是其首选标准方案。然而，前列腺癌患者经过一段时间激素治疗以后，往往发展成雄激素难治性前列腺癌(hormone refractory prostate cancer，HRPC)。HRPC转移性强，预后较差，病死率高，目前对其尚无有效的临床治疗方案。
长期以来，坏死都被认为是细胞突发死亡的结果，是不被基因所调控的。2005年，Degterev等[3]提出一种新的细胞死亡方式--不能被Caspase广谱抑制剂抑制，但能被necrostatin-1特异性抑制的细胞死亡，将其命名为程序性坏死(necroptosis)。程序性坏死在形态学上呈坏死样(即细胞膜完整性消失、胞核溶解)，但却受到细胞内精密的基因调控，受体相互作用蛋白(receptor interacting protein-1, RIP1)/混合谱系激酶结构区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like, MLKL)是程序性坏死的主要通路。
皂苷类化合物在抗肿瘤方面发挥重要作用，Zhou等[4]发现桔梗皂苷D可通过周期阻滞、诱导凋亡从而在体内外有效抑制前列腺癌生长。Cheng等[5]研究发现从绞股蓝中提取出来的皂苷类化合物可抑制前列腺癌PC3细胞的凋亡。麦冬皂苷D’(Ophiopogonin D’，OPD’)作为皂苷类化合物，它的抗前列腺癌潜能可能巨大。因此，本研究以雄激素非依赖的前列腺癌PC3细胞为研究对象，观察OPD’对该细胞存活的影响，并进一步讨论OPD’抑制前列腺癌的可能相关机制。
1 材料与方法 1.1 化合物和试剂OPD’购买于成都曼思特生物科技有限公司，纯度＞98%。Ham’s F-12、胎牛血清(FBS)购买于GIBCO公司(New York, USA)，胰酶购于北京中杉金桥生物技术有限公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购买于江苏祥盛生物技术有限公司。Annexin V-FITC/PI试剂盒购买于上海贝博生物。Western blot实验所用抗体：RIP1购于sigma公司(St. Louis, MO)，anti-MLKL、anti-p-MLKL购于Abcom (Cambridge, UK)，anti-β-actin购买于杭州贤至生物科技有限公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠/兔IgG (H+L)购买于北京中杉金桥。程序性坏死特异性抑制剂necrostatin-1购于Sigma公司(St. Louis, MO)。Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK、Caspase 3抑制剂AC-DEVD-CHO、四甲基偶唑氮盐(3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)、结晶紫染料均购于上海碧云天生物技术有限公司。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购于Sigma公司(St. Louis, MO)。
1.2 细胞株和细胞培养人前列腺癌PC3细胞为本实验室所保存。PC3细胞培养于Ham’s F-12培养基(含10% FBS)，在37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中进行培养，根据细胞生长情况每2~3天进行传代。
1.3 MTT实验检测细胞生存率将处于对数生长期PC3细胞以1×104个/孔接种于96孔板，每个浓度均设3个平行孔，置于细胞培养箱中培养24 h后，以不同浓度的OPD’(0、1、2.5、5、10 μmol/L)处理细胞24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，于细胞培养箱中继续培养3 h后去上清，每孔加入100 μL DMSO溶解形成的甲臜晶体。运用多功能酶标仪在570 nm波长处读取光密度值，计算生存率，并得出IC50值。
1.4 流式细胞术检测Annexin V-Fitc和PI双染将处于对数生长期的PC3细胞以2×105个/孔接种于6孔板，置于细胞培养箱中培养24 h后，以不同浓度的OPD’(0、1、2.5、5、10 μmol/L)处理细胞6 h，或者用5 μmol/L OPD’处理细胞0、0.5、1、2、4、6 h后，收集细胞及上清，以1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次后，用结合液重悬，分别用Annexin V-FITC和PI染色后，于4 ℃避光孵育15 min，运用流式细胞仪进行检测。
1.5 Western blot检测细胞蛋白表达将处于对数生长期的PC3细胞以1×106个/瓶接种于25 cm2培养瓶中，待其贴壁后分别用不同浓度的OPD’(0、2.5、5 μmol/L)处理细胞6 h，或者以5 μmol/L OPD’处理细胞0、0.5、1、2、4、6、8 h。到达时间点时收集细胞，并提取细胞全蛋白。检测Cleaved-RIP1(30×103)、RIP1(78×103)、MLKL (54×103)、p-MLKL (220×103)的蛋白表达。提取蛋白后进行凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭3 h，一抗(1:1 000)4 ℃孵育过夜。用TBST洗脱液洗膜(10 min×3次)，孵育辣根过氧化物酶共轭的山羊抗鼠/兔二抗2 h，再次洗膜(10 min×3次)，凝胶成像系统成像扫描分析。
1.6 结晶紫染色实验观察OPD’对PC3细胞形态学的改变将处于对数生长期的PC3细胞以3×104个/孔接种于24孔板的10 mm×10 mm玻片内，置于细胞培养箱中培养过夜后，以不同浓度的OPD’(0、2.5、5 μmol/L)处理细胞24 h，弃上清，用PBS洗涤2次，加入多聚甲醛室温固定30 min后，PBS洗涤3次，加入结晶紫染色10 min，用PBS洗涤3次，于倒置显微镜下观察拍照。
1.7 透射电镜实验观察OPD’对PC3细胞超微结构的影响将处于对数生长期的PC3细胞以1×106个/瓶接种于25 cm2培养瓶中，待其贴壁后用10 μmol/L的OPD’处理细胞2 h后，收集细胞及上清，以1 500 r/min离心5 min，弃上清，用PBS混匀清洗，离心(1 500 r/min，5 min)，去掉上清，加入2%戊二醛，4 ℃固定过夜，PBS清洗1次之后1%锇酸固定2 h，丙酮梯度脱水、环氧树脂618浸透包埋、超薄切片，厚度100 nm，铀铅双染观察。
1.8 统计学分析数据以x±s表示，采用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析，时间依赖进行线性回归分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 OPD’抑制PC3细胞生长采用MTT实验检测OPD’对PC3细胞存活能力的影响。OPD’处理24 h后MTT实验结果见图 1，5 μmol/L的OPD’即可显著抑制PC3细胞活性，10 μmol/L的OPD’处理细胞24 h可抑制88.04%细胞的生长，其半数抑制剂量IC50为(6.25±0.31)μmol/L。
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| 1：对照组；2: 0.5 μmol/L OPD’处理组；3:1.0 μmol/L OPD’处理组；4: 2.5 μmol/L OPD’处理组；5: 5.0 μmol/L OPD’处理组；6: 10.0 μmol/L OPD’处理组a:P < 0.05, 与对照组比较 图 1 OPD’抑制PC3细胞活性 |
2.2 OPD’诱导PC3细胞凋亡和坏死
不同浓度(0、1、2.5、5 μmol/L) OPD’处理PC3细胞24 h后Annexin V-Fitc和PI双染结果见图 2A，5 μmol/L OPD’诱导21.24%的PC3细胞早期凋亡(P < 0.05)，43.5%的细胞晚期凋亡/坏死(P < 0.05)，3.86%的细胞坏死(P < 0.05)；5 μmol/L OPD’处理PC3细胞不同时间(0、0.5、1、2、4、6 h)后Annexin V-Fitc和PI双染结果见图 2B，5 μmol/L OPD’诱导PC3细胞晚期凋亡/坏死呈明显的时间依赖关系(r=0.728，P < 0.001), 而早期凋亡象限(r=0.149，P=0.554)和坏死象限(r=0.123，P=0.627)不呈时间依赖。
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| A：麦冬皂苷D’诱导PC3细胞凋亡和坏死呈剂量依赖；B：麦冬皂苷D’诱导PC3细胞凋亡和坏死呈时间依赖；1：存活细胞；2：早期凋亡；3：晚期凋亡/坏死；4：坏死；a：P < 0.05，与对照组(0 μmol/L)比较 图 2 OPD’诱导PC3细胞凋亡和坏死 |
2.3 OPD’诱导PC3细胞Caspase非依赖死亡
结果见表 1，Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK (20 μmol/L)单独处理PC3细胞，并不抑制PC3细胞活性；而Z-VAD-FMK预处理细胞1 h，再联合5 μmol/L OPD’处理24 h，并不比5 μmol/L OPD’单独处理的杀伤效果弱，反而杀伤效果更强，表明OPD’诱导前列腺癌细胞的死亡是不依赖于Caspase的死亡。同样，用Caspase 3抑制剂AC-DEVD-CHO (10 μmol/L)单独处理PC3细胞并不抑制PC3细胞存活，但AC-DEVD-CHO预处理细胞1 h后，再联合5 μmol/L OPD’，同样比5 μmol/L OPD’单独处理杀伤了更多的PC3细胞，进一步表明OPD’诱导前列腺癌细胞的死亡为Caspase非依赖性死亡。
| 抑制剂 | 0 μmol/L | 5 μmol/L |
| DMSO | 100.00±0.00 | 60.65±4.99 |
| Z-VAD-FMK (20 μmol/L) | 97.03±6.55 | 46.38±4.17a |
| AC-DEVD-CHO (10 μmol/L) | 93.48±4.53 | 48.69±1.76a |
| a：P < 0.05, 与5 μmol/L OPD’(DMSO溶剂)比较 | ||
2.4 OPD’诱导PC3细胞发生程序性坏死
10 μmol/L Nec-1单独处理PC3细胞，并不抑制PC3细胞活性，而Nec-1预处理细胞1 h后再联合10 μmol/L OPD’处理，则逆转OPD’诱导的PC3细胞死亡(P=0.047，图 3)，表明OPD’诱导了PC3细胞的程序性坏死。
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| 1：对照组；2：Nec-1处理组；3：OPD’处理组；4：Nec-1+OPD’处理组；a:P < 0.05, 与OPD’处理组比较 图 3 OPD’诱导PC3细胞程序性坏死 |
2.5 OPD’上调程序性坏死相关蛋白RIP1、下调Cleaved-RIP1蛋白的表达
不同浓度OPD’(0、2.5、5 μmol/L)处理PC3细胞6 h后，5 μmol/L组Cleaved-RIP1表达水平明显下调，RIP1表达水平明显上调，Cleaved-RIP1/RIP1比值下降(P < 0.001，图 4)。表明OPD’通过RIP1途径诱导PC3细胞发生程序性坏死。
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| A: Western blot检测结果；B：半定量分析；1：对照组；2：2.5 μmol/L OPD’处理组；3：5 μmol/L OPD’处理组；a：P < 0.05，与对照组比较 图 4 OPD’调节Cleaved-RIP1、RIP1蛋白表达 |
2.6 OPD’上调p-MLKL四聚体蛋白表达水平
同浓度OPD’(0、2.5、5 μmol/L)处理PC3细胞6 h后，5 μmol/L OPD’处理组p-MLKL四聚体表达水平明显上调、p-MLKL/MLKL比值上升(P < 0.001，图 5A、B)；5 μmol/L OPD’处理细胞0、0.5、1、2、4、6、8 h后，p-MLKL四聚体水平逐渐上调，p-MLKL/MLKL比值上升，存在明显的时间效应依赖关系(r=0.907，P=0.005，5C、D)。表明OPD’经由MLKL途径诱导PC3细胞程序性死亡。
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| A：不同剂量OPD’对p-MLKL四聚体表达的影响；B：图A蛋白相对表达量；1：对照组；2：2.5 μmol/L OPD’处理组；3：5 μmol/L OPD’处理组；a：P < 0.05，与对照组比较; C: OPD’处理不同时间对p-MLKL四聚体表达的影响；D：图C蛋白相对表达量；1：0 h处理组；2：0.5 h处理组；3：1.0 h处理组；4：2.0 h处理组；5：4.0 h处理组；6：6.0 h处理组；7：8.0 h处理组 图 5 Western blot检测OPD’激活p-MLKL的表达 |
2.7 OPD’诱导PC3细胞呈坏死样改变
进一步用结晶紫和透射电镜观察OPD’对PC3细胞形态学的影响。5 μmol/L OPD’处理PC3细胞6 h后，结晶紫染色显示，与对照组相比，处理组细胞肿胀、胞浆空泡化(图 6A~C)。透射电镜结果显示，10 μmol/L OPD’处理PC3细胞2 h后，处理组细胞胞体肿胀、胞核溶解，细胞呈坏死样死亡(图 6D、E)。
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| A~C:结晶紫染色显示麦冬皂苷D’诱导PC3细胞肿胀(×400)；A；对照组；B：2.5 μmol/L OPD’处理组；C：5 μmol/L OPD’处理组；箭头示细胞肿胀；D、E:透射电镜显示麦冬皂苷D’诱导PC3细胞呈坏死样改变；D：对照组；E：10 μmol/L OPD’处理组；箭头示细胞坏死 图 6 OPD’诱导PC3细胞呈坏死样改变 |
3 讨论
前列腺癌的发生与遗传、生活方式、环境污染等多种因素有关，其中年龄是重要的发病因素。随着人们期望寿命的延长，前列腺癌的发病率必然会越来越高。常规的抗前列腺癌药物主要以诱导肿瘤细胞凋亡为主。近几年，肿瘤细胞的程序性坏死(necroptosis)受到关注，被认为是肿瘤细胞死亡的主要方式之一，尤其是耐药肿瘤细胞有可能通过程序性坏死被清除，necroptosis有希望作为治疗耐药性肿瘤的新靶标[6]。
程序性坏死在抗结肠癌、淋巴瘤、口腔癌中发挥重要作用[7-9]，而在对前列腺癌的研究中发现，绿茶提取物茶多酚可诱导前列腺癌PC3细胞程序性坏死[10]。然而皂苷类化合物对前列腺癌程序性坏死的研究鲜见报道。
本研究采用Annexin V-Fitc和PI双染检测早期凋亡、晚期凋亡和坏死的细胞：Annexin V (+) PI (+)为晚期凋亡细胞，Annexin V (+) PI (-)为早期凋亡细胞，Annexin V (-) PI (+)为坏死细胞，Annexin V (-) PI (-)为活细胞。在坏死细胞中，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。细胞凋亡时，位于细胞膜磷脂双分子层内侧的磷脂酰丝氨酸由内侧翻向外侧，与标记了FITC的Annexin V特异性结合，是检测细胞凋亡的重要手段。但Annexin V阳性并不只出现在凋亡细胞中，细胞膜完整性受到破坏的坏死细胞同样会有Annexin V阳性，即Annexin V (+) PI (+)中存在一部分坏死细胞[11]。Annexin V-Fitc和PI双染实验结果表明，5 μmol/L的OPD’主要诱导PC3细胞晚期凋亡/坏死，且与晚期凋亡/坏死象限中的细胞数呈明显的时间依赖关系(r=0.728，P < 0.001)。后续实验运用Caspase抑制剂、程序性坏死特异性抑制剂Nec-1实验结果显示，凋亡不是OPD’诱导PC3死亡的主要机制，有可能程序性坏死才是。
死亡受体所介导的RIP1/MLKL通路是程序性坏死的主要途径。RIP1是细胞程序性坏死的必须因素。当细胞内Caspase家族有活性时，Caspase家族切割RIP1，使其失活，细胞就通过凋亡的方式死亡；当Caspase活性被抑制无法切割RIP1时，细胞则启动程序性坏死[12]。本研究结果表明OPD’处理的PC3细胞Cleaved-RIP1表达水平明显下调、RIP1表达水平明显上调，Cleaved-RIP1/RIP1比值上升，提示细胞启动了程序性坏死。
MLKL是RIP1/MLKL通路中的核心分子，当细胞启动程序性坏死时，MLKL中T357/S358两个位点发生磷酸化[13]，p-MLKL蛋白(54×103)中的螺旋束开始折叠，最终使p-MLKL蛋白形成四聚体(220×103)，与细胞膜或细胞器膜中的磷脂酰肌醇脂质(phosphatidylinositol lipids，PIP)[14]结合, 从而开放细胞膜孔道，引起细胞内Ca2+、Na+流紊乱造成细胞或细胞器肿胀，最终导致细胞呈坏死样死亡[15]。本研究的Western blot检测结果表明，OPD’处理的PC3细胞p-MLKL四聚体表达水平上调，p-MLKL/MLKL比值上升，且呈明显的时间依赖关系，提示OPD’诱导了肿瘤细胞程序性坏死。临床上已有证据表明，胰腺癌和卵巢癌患者肿瘤组织中MLKL高表达者，其预后更好，生存期更长[16-17]，MLKL可能是治疗肿瘤的新靶标。
在程序性坏死通路中，除死亡受体介导的RIP1/MLKL通路以外，电离辐射、放疗、活性氧、钙离子过载等可能通过不同的机制引起程序性坏死。当X射线照射结直肠癌细胞时，激活RIP1引起细胞程序性坏死[18]。过量的Ca2+活化脂肪氧合酶，使溶酶体破裂，释放体内水解酶，从而引起细胞程序性坏死[19]。ROS通过氧化蛋白和脂质分子破坏细胞膜、影响线粒体氧化磷酸化水平和Ca2+浓度，从而引起程序性坏死[20]。
本研究证实OPD’可通过RIP1/MLKL通路抑制前列腺癌PC3细胞的生长，具有明显的抗肿瘤效应，其诱导PC3细胞程序性坏死可能是其发挥抗肿瘤效应的机制之一。OPD’与程序性坏死还存在诸多未知机制，需要进一步研究证实。本研究拓展了天然化合物诱导肿瘤细胞发生程序性坏死机制的认识，丰富了我们对天然化合物抗肿瘤机制的理解，从而为OPD’诱导前列腺癌程序性坏死提供实验依据，为其成为新的抗肿瘤备选药物提供理论基础。
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