肾缺血再灌注可导致急性肾损伤或急性肾衰竭,是围术期常见并发症,并可进一步导致心、脑、肝、肺等肾外远隔器官的功能异常或损伤[1-3]。病理情况下,机体会激活自身的神经保护性机制,表现为迷走神经放电频率的变化。缺血、炎症、应激等状况时,迷走神经活性会自动调节而有所增加,以对抗过度增强的交感神经活性,维持机体内稳态,这一过程被称之为胆碱能抗炎通路的激活[4-5]。动物实验中,迷走神经放电频率变化可间接反映机体炎症活性的变化,进而反映机体的病理状况,是一种直观且有效的观察指标[6]。既往关于胆碱能抗炎通路的研究中[7-8],涉及到实验动物迷走神经解剖及放电频率测定的详尽方法较少,因此,本研究拟采用C57BL/6J小鼠行肾缺血再灌注手术,同时观察并采集其颈部迷走神经放电频率变化,为深入探索肾缺血再灌注的神经保护性机制奠定模型基础。
1 材料与方法 1.1 动物健康清洁级雄性C57BL/6J小鼠8只,8~10周龄,体质量22~26 g,购于第三军医大学实验动物中心,术前适应性饲养1周,标准饲料喂养,正常饮水,普通光照,每12 h昼夜交替,控制室温22~26 ℃,相对湿度45%~55%,保持环境清洁、安静。术前10 h禁食,不禁饮。
1.2 材料5%水合氯醛、罗哌卡因注射液、75%酒精、BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟)、不锈钢万能支架、小动物手术台、动物手术显微镜、眼科剪、眼科镊、玻璃分针、5号缝合针、5/0缝合线、持针器,灭菌石蜡油、小动脉夹、腹腔皮肤撑开器等。
1.3 方法 1.3.1 麻醉与暴露颈部组织小鼠5%水合氯醛按0.1 mL/10 g体质量腹腔内注射麻醉后于小动物手术台上固定,颈部皮肤消毒,抽取罗哌卡因注射液0.1 mL沿颈正中线作皮下浸润麻醉后用眼科剪向上剪开约1.5 cm长手术切口(图 1A),暴露颈部皮下腺体及组织,用两把眼科镊轻轻拉住两侧皮肤并沿中线向两边钝性分离腺体及皮下组织(图 1B),取针线将腺体组织与皮肤缝合一针后分别向两边做适当牵拉并固定,以便充分显露颈部组织。之后的操作均应在动物手术显微镜下完成。
1.3.2 迷走神经分离
调整显微镜(10倍)至视野清晰,此时可见气管旁左右各有一条纵向肌肉,为胸乳突肌,以右侧为例,用眼科镊钝性分离该肌肉上覆的筋膜组织后向上略提起该肌,取眼科剪于肌肉上三分之一处横向剪断胸乳突肌(图 1C),此时应特别注意,肌肉下方血管较丰富,切勿剪太深,以防剪断血管导致大出血,然后持眼科镊向下牵拉该肌肉并钝性分离至胸廓上部,此时可完全显露右侧迷走神经及颈部大血管,迷走神经沿气管旁纵向走行,呈白色条索状,其下方有颈动脉通过(图 1D),取玻璃分针小心分离迷走神经,使其游离,并用眼科镊配合玻璃分针小心剥除神经上覆筋膜(此时务必小心切勿夹伤神经)(图 1E),分离出约1 cm长一段后于其下方挂线备用(图 1F)。
1.3.3 持续记录迷走神经放电频率将BL-420F生物机能实验系统连接至计算机,用万能支架固定其铂金电极头,调整至电极头挂钩悬于神经上方1~2 mm,轻轻提起挂线将神经置于挂钩上(图 1G),此时注意张力切不可过大,以防神经断裂,滴2~3滴已加温的灭菌石蜡油覆盖神经及切口,以防止神经及周围组织干燥脱水,打开计算机上生物机能实验系统程序即可观察神经放电情况。
1.3.4 肾缺血再灌注手术记录基础放电频率15 min后,抽取罗哌卡因注射液0.1 mL作腹部正中皮下浸润麻醉后向上纵向剪开腹部皮肤及腹肌,腹腔撑开器撑开暴露腹腔,找到左右肾后分别用动脉夹将两侧肾蒂夹闭,腹腔注射0.5 mL温生理盐水后暂时闭合腹腔,25 min后再次打开腹腔,取下双侧动脉夹后逐层关腹(图 1H、I)。在缺血再灌注期间全程记录其迷走神经放电变化,于再灌注30 min后结束观察,取下挂钩,关闭颈部切口。
1.3.5 采集迷走神经放电频率根据缺血再灌注时间,分别于缺血开始即刻(T0)、缺血5 min (T1)、10 min (T2)、15 min (T3)、20 min (T4)、25 min (T5)、再灌注5 min (T6)、10 min (T7)、15 min (T8)、20 min (T9)、25 min (T10)、30 min (T11)各时间点采集迷走神经放电频率。
1.4 统计学方法数据采用GraphPad统计学软件进行分析,计量资料采用x±s表示,数据采用单因素方差分析,两两多重比较采用Newman-Keuls多重比较检验。检验水准α=0.05。
2 结果与基础放电频率(T0)(520±52) Hz比较,缺血期迷走神经放电频率明显上升,于缺血后25 min (T5)升高至(632±59) Hz (P < 0.05),随后进入再灌注期。再灌注15 min (T8)左右其放电频率进一步上升至(672±58) Hz (P < 0.05),其后开始逐渐下降,于再灌注30 min (T11)下降至(544±51) Hz,但仍高于基础放电频率(P < 0.05)。见图 2、3。
3 讨论
本研究通过构建C57小鼠肾缺血再灌注模型,同时在不同时间点采集其颈部迷走神经放电频率,结果显示放电频率随着肾缺血再灌注的进程,呈现一个先上升再下降的趋势,具体表现为:缺血5 min后放电频率开始持续升高,直至再灌注15 min达到峰值,其后逐渐下降,再灌注30 min后恢复近基础水平。该现象可能涉及胆碱能抗炎通路的激活。胆碱能抗炎通路是2000年时由Borovikova[4]于Nature撰文首次提出的概念,其认为神经-免疫作用能直接调节炎症反应而快速发挥防御作用,该过程有赖于胆碱能受体和激活的副交感传出神经(迷走神经)的共同作用,故而将其命名为“胆碱能抗炎通路”。缺血缺氧时,机体启动自身炎症反应,适度的炎症反应对机体具保护作用,但过度反应则可能造成机体的损伤;胆碱能抗炎通路的激活,可抑制过度增强的炎症反应,维持机体内稳态,从而达到对机体的保护作用。
目前研究认为,胆碱能抗炎通路是机体神经系统与免疫系统之间的一种关联性抗炎机制,能够以快速、集中和整合的方式调控机体免疫功能和抑制过度的炎症反应[9-10]。本研究中,肾缺血后机体迷走神经兴奋性升高,表明胆碱能抗炎通路已被激活,机体的快速调控机制启动,其后随着开放再灌注,其局部乃至全身炎症反应短暂加剧,因此迷走神经放电频率进一步升高,以对抗过度增强的炎症反应。但再灌注15 min后迷走神经放电频率逐渐下降,推测其可能原因是再灌注后组织器官缺血缺氧情况逐渐改善,炎症反应相应减弱,故迷走神经放电频率也随即下降,同时这也符合胆碱能抗炎通路快速调控方式的特性。该研究是在我们前期实验基础上的一个拓展性探索,而在实验再灌注30 min内已获取到迷走神经放电频率变化的明显趋势,并且已初步证实肾缺血再灌注同胆碱能抗炎通路的关联性,因此我们未进一步观察30 min后其放电频率变化情况,但后续对深入观察和采集较长时间(数小时至数天)迷走神经放电频率变化仍具有研究价值。
既往对胆碱能抗炎通路的研究中,多数均采用大鼠[11-12]作为动物模型,究其原因,可能在于大鼠体积较大,迷走神经解剖难度较小。本研究采用C57BL/6J小鼠行肾缺血再灌注手术,概因C57小鼠为近交系小鼠,应激反应均一,实验结果精度高且可比性好,可进行转基因的深入研究。但由于其体积较小,颈部神经解剖难度相对较大,因此在关于迷走神经保护性机制的探索研究中,鲜有实验以其为模型采集迷走神经放电频率。为了在前期课题研究的基础之上进一步深入探索肾缺血再灌注的神经保护性机制奠定模型基础,因此本研究仍选用C57小鼠进行迷走神经放电频率的采集研究。C57小鼠本身体积较小,手术操作难度已然较大,其颈部血管神经的排列更是紧密且脆弱,稍有不慎即可造成神经断裂血管破裂大出血导致小鼠死亡,故整个手术操作过程中均应特别注意保持操作轻柔精细,动作幅度切不可过大,以保证手术的成功率。神经挂于铂金电极挂钩上应保持适当张力,不可过于松弛和紧张,否则会造成所记录波形的干扰,导致波形变形和记录数据失真。并且在实验记录过程中要注意随时排除各种干扰,以保证所记录波形的形态准确性。
神经内分泌系统对炎症的反射性调控是机体防御的重要机制之一,其中胆碱能抗炎途径理论对于深入理解和阐释炎症的精密调控具有重要意义[13]。而目前研究表明,通过电刺激迷走神经可直接激活胆碱能抗炎通路,从而减轻缺血再灌注所致的急性肾损伤[14-16],对心肌缺血再灌注损伤、癫痫、抑郁症等诸方面也具有明确的治疗和保护作用[7, 17-18]。
本研究在C57BL/6J小鼠肾缺血再灌注模型的基础之上通过检测其迷走神经兴奋性,发现此病理状况下迷走神经放电频率变化的规律并初步探索其神经保护性机制,以期今后通过施加不同干预以及对不同指标的检测,进一步探索相应的器官保护机制与措施。
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